秦百君，唐曦平，楊昕，楊蕾，馮敏超，張馳，洪曉華，藍(lán)艷梅，陳國忠（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃科，南寧 500；.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南寧 50001；.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胰腺內(nèi)科，南寧 5001；.仁壽縣中醫(yī)院內(nèi)科，四川 眉山 60500）

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是由胰蛋白酶異常激活、炎癥因子大量釋放入血而引發(fā)的胰腺水腫壞死及胰周組織液積聚。該病可并發(fā)腸梗阻、胃腸功能衰竭等疾病，嚴(yán)重者會出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙等急危重癥[1]。SAP在亞洲國家的發(fā)病率為0.036%～0.125%，病死率為6.5%～26%，且進(jìn)展迅速，預(yù)后兇險[2－3]。腸道是SAP早期受損的功能器官之一，生理狀態(tài)下，腸道菌群與腸黏膜屏障相互作用，共同維持腸道穩(wěn)態(tài)并促進(jìn)組織代謝、調(diào)節(jié)免疫等；疾病狀態(tài)下，腸道屏障功能障礙及腸道菌群失衡是SAP的重要病理機(jī)制之一，菌群的結(jié)構(gòu)、相對豐度、位置變化均可能破壞腸黏膜屏障的完整性，從而進(jìn)一步誘發(fā)菌群移位，加重炎癥水平，損害靶器官[4－5]。因此，在SAP早期修復(fù)腸黏膜屏障功能，并及時抑制菌群移位，對降低全身炎癥水平、遏制病情進(jìn)展具有重要意義。清解化攻方（Qingjie huagong decoction，QJHGD）是廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃科治療SAP的院內(nèi)制劑，臨床應(yīng)用多年，已獲國家發(fā)明專利（專利號ZL201811021893.2）。本課題組前期研究表明，QJHGD聯(lián)合化學(xué)藥治療早期SAP的臨床療效較好，可抑制炎癥因子表達(dá)，降低胰腺組織壞死程度，保護(hù)腸黏膜屏障，但具體機(jī)制未完全闡明[6－8]。

本研究采用雨蛙素聯(lián)合脂多糖腹腔注射法復(fù)制SAP大鼠模型，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA）法和Western blot法觀察QJHGD對SAP模型大鼠炎癥水平及腸黏膜屏障調(diào)節(jié)蛋白的影響；并基于16S rRNA高通量測序，初步探究該藥對SAP模型大鼠腸黏膜屏障的保護(hù)作用及調(diào)節(jié)腸道菌群、修復(fù)腸黏膜屏障的分子機(jī)制。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Centrifuge5804R型離心機(jī)（德國Eppendorf公司），CKX41型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），RM2016型病理切片機(jī)（德國Leica公司），Thermo HistoStar型組織包埋機(jī)（江蘇維林科生物技術(shù)有限公司），Qubit 3.0 Fluromete型熒光定量儀、Multiskan GO型全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），Amersham Imager 600型超靈敏多功能成像儀（美國GE公司），Agilent 2100 Bioanalyzer型生物芯片分析系統(tǒng)（美國Agilent公司）。

1.2 主要藥品與試劑

QJHGD藥材飲片均購自廣西仙茱中藥科技有限公司，分別為柴胡（批號17010267）、大黃（批號17010163）、厚樸（批號16060431）、黃芩（批號16060117）、木香（批號16080375）、桃仁（批號16282049）、枳實（批號16182144），經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥真?zhèn)舞b定技術(shù)中心鑒定為真品，符合《中國藥典》相關(guān)規(guī)定[9]。將上述藥材加10倍蒸餾水浸泡24 h后，武火煮沸，再以文火煮30 min，過濾；藥渣繼續(xù)加水煎煮3次，合并3次濾液，以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，制成質(zhì)量濃度為1 g/mL的藥液（以生藥量計）。

其他藥品與試劑有注射用烏司他?。◤V東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，批號032005103，規(guī)格10×104U/支），雨蛙素、脂多糖（上海源葉生物科技有限公司，批號分別為S62702、S11060），蘇木素-伊紅染色試劑盒、兔閉合蛋白（Occludin）多克隆抗體（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為G1120、K106466P），血清淀粉酶試劑盒（北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司，批號DG96286Q），白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號ER008-96），IL-18 ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號EEL-R0567c），IL-10 ELISA試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司，批號211070825），兔高遷移率族蛋白B1（HMGB1）多克隆抗體（武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號PAB46173），兔閉鎖連接蛋白1（ZO-1）多克隆抗體、兔GAPDH多克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G抗體、ECL發(fā)光試劑盒（美國Affinity公司，批號分別為 AF5145、AF7021、S0001、KF003），RIPA 裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號分別為P0013B、P0010S）。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級SD大鼠，8周齡，雄性，體質(zhì)量為（200±20）g，購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可合格證號為SCXK（湘）2019-0004。大鼠飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實驗中心SPF級實驗室，動物使用許可證號為SYXK（桂）2019-0001。實驗室環(huán)境濕度為55%～65%，溫度為（24±2）℃，光暗循環(huán)12 h/12 h，實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，期間自由飲水和進(jìn)食。本研究符合動物實驗倫理要求。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將60只SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型組、陽性藥對照組、QJHGD治療組，每組15只。造模前24 h大鼠禁食不禁水，采用雨蛙素聯(lián)合脂多糖腹腔注射法[10]，并參考《藥理實驗方法學(xué)（第4版）》[11]造模。模型組、陽性藥對照組、QJHGD治療組大鼠腹腔注射雨蛙素（50 μg/kg），每小時1次，連續(xù)6次，第7次注射脂多糖（10 mg/kg）以復(fù)制SAP模型。末次注射后，各組取3只大鼠，剖取大鼠胰腺組織，當(dāng)胰腺發(fā)生水腫滲出、局部呈暗紅色且被膜下有出血點時，表明造模成功[12]。造模成功后，QJHGD治療組大鼠灌胃QJHGD藥液（7 g/kg，劑量根據(jù)臨床等效劑量換算而得），陽性藥對照組大鼠腹腔注射烏司他丁（5 U/kg，劑量根據(jù)臨床等效劑量換算而得），空白對照組、模型組大鼠灌胃與QJHGD治療組腹腔注射等體積的生理鹽水，每天2次，連續(xù)3 d。

2.2 生存狀態(tài)觀察及指標(biāo)檢測

2.2.1 大鼠生存狀態(tài)的觀察 觀察并記錄各組大鼠造模及給藥后的精神狀態(tài)、呼吸、活動、飲食、腹部膨脹情況等方面的變化，統(tǒng)計大鼠3 d內(nèi)的死亡情況，然后從各組剩余大鼠中分別抽取10只進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2.2 大鼠血清中血清淀粉酶及炎癥因子水平的檢測 大鼠末次給藥后1 h，腹主動脈取血約5 mL，室溫靜置2 h，以3 000 r/min離心10 min，取上清液分裝于試管中，采用全自動生化檢測儀檢測大鼠血清中血清淀粉酶水平，采用ELISA法檢測大鼠血清中IL10、IL-18、IL-1β水平。

2.2.3 大鼠胰腺及小腸組織的病理學(xué)觀察 采用蘇木素-伊紅染色法進(jìn)行觀察。各組大鼠取血完成后，腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）進(jìn)行麻醉，處死。取大鼠胰頭組織及距回盲部2 cm左右的小腸組織（并收集其小腸內(nèi)容物，備用），部分固定于4%多聚甲醛溶液中（另外部分用無酶、無菌管收集后于－80℃冰箱中保存），再進(jìn)行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（厚度4μm）。切片以蘇木素染色5 min，依次洗滌、分化后，再以伊紅染色30 s，然后進(jìn)行脫水、透明，用中性樹膠密封，置于顯微鏡下觀察胰腺及小腸組織的病理變化。采用Schmidt法進(jìn)行胰腺組織病理評分[13]，采用Chiu等[14]報告的標(biāo)準(zhǔn)化評分方法進(jìn)行小腸組織病理評分。病理切片由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院和廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科2位主任醫(yī)師進(jìn)行雙盲觀察，綜合兩者意見得到最終評分。

2.2.4 大鼠小腸組織中HMGB1、Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)水平的檢測 取“2.2.3”項下保存于－80℃冰箱的小腸組織適量，加入600 μL RIPA裂解液研磨，于4℃下以12 000 r/min離心15 min，取上清液，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。將上清液加入適量蛋白上樣緩沖液煮沸15 min后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳，轉(zhuǎn)膜；以脫脂奶粉封閉2 h，加入HMGB1、Occludin、ZO-1一抗（稀釋度均為1∶1 000）和GAPDH一抗（稀釋度為1∶3 000），4℃孵育過夜；以TBST洗滌重復(fù)3次，每次5 min，加入二抗（稀釋度為1∶5 000），常溫孵育1 h；以ECL發(fā)光液顯影曝光，并用凝膠成像系統(tǒng)成像。采用Image J軟件進(jìn)行條帶定量分析，以目的蛋白與內(nèi)參的灰度值比值表示其表達(dá)水平。

2.3 腸道菌群分析

2.3.1 腸道菌群16S rRNA測序 取“2.2.3”項下各組大鼠的小腸內(nèi)容物至對應(yīng)編號的無菌凍存管中，置于－80℃冰箱凍存后，送至上海中科新生命生物科技有限公司進(jìn)行16S rRNA高通量測序。由于取材時陽性藥對照組大鼠小腸內(nèi)容物污染嚴(yán)重，故未進(jìn)行測序。

2.3.2 腸道菌群多樣性分析 將“2.3.1”項下測序得到的原始數(shù)據(jù)用FLASH軟件進(jìn)行序列拼接、過濾及去嵌合體，得到有效數(shù)據(jù)?；谟行?shù)據(jù)進(jìn)行分類操作單元聚類（operational taxonomic units，OTUs）和物種分類：采用UPARSE軟件包結(jié)合UPARSE-otu和UPARSE-oturef算法分析α多樣性（樣本內(nèi)）和β多樣性（樣本間），將相似性≥97%的序列歸為相同OTUs；采用Shannon、Simpson、Ace、Coverage、Chao1 指數(shù)表征菌群多樣性。對OTUs多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，并基于Bray-Curtis算法對微生物結(jié)構(gòu)組間差異進(jìn)行分析。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 QJHGD對SAP模型大鼠生存狀態(tài)的影響

空白對照組大鼠精神較佳，飲食規(guī)律，活動自如；模型組大鼠造模后狀態(tài)較差，出現(xiàn)精神萎靡、呼吸急促、嗜睡、食欲差、蜷縮顫抖、腹部膨脹等癥狀；陽性藥對照組和QJHGD治療組較模型組大鼠腹部膨脹癥狀明顯減輕，飲食及活動增加，精神狀態(tài)恢復(fù)較好。空白對照組大鼠無死亡現(xiàn)象；模型組大鼠造模24 h后開始死亡，造模后共死亡6只大鼠（模型組最后死亡的1只大鼠在造模后第3天，為保證后續(xù)實驗各組大鼠數(shù)量一致、基線可比，筆者在其瀕臨死亡時，立即麻醉取材）；陽性藥對照組大鼠共死亡4只；QJHGD治療組大鼠共死亡3只。綜上，QJHGD可改善SAP模型大鼠的生存狀態(tài)，降低其死亡率。

3.2 QJHGD對SAP模型大鼠血清中血清淀粉酶和炎癥因子水平的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠血清中血清淀粉酶、IL-10、IL-18、IL-1β水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥對照組和QJHGD治療組大鼠血清中血清淀粉酶、IL-18、IL-1β（QJHGD治療組除外）水平均顯著降低（P＜0.05），IL-10水平顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠血清中血清淀粉酶和炎癥因子水平的檢測結(jié)果（±s，n＝10）

表1 各組大鼠血清中血清淀粉酶和炎癥因子水平的檢測結(jié)果（±s，n＝10）

a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別空白對照組模型組陽性藥對照組QJHGD治療組IL-1β/（pg/mL）24.81±9.39 115.38±34.23a 93.13±13.95b 108.42±8.33血清淀粉酶/（U/L）2 094.21±341.07 9 062.05±2 497.23a 3 394.00±456.93b 3 079.81±834.62b IL-10/（ng/L）14.15±2.11 37.34±14.25a 59.34±9.23b 55.47±11.84b IL-18/（pg/mL）89.59±31.06 567.19±42.19a 189.65±34.69b 193.28±85.13b

3.3 QJHGD對SAP模型大鼠胰腺及小腸組織病理的影響

蘇木素-伊紅染色結(jié)果顯示，空白對照組大鼠胰腺組織排列緊密、結(jié)構(gòu)完整，胰管走形正常，未見小葉間隙增寬，無出血壞死；腸上皮細(xì)胞無水腫，腸黏膜無脫落。模型組大鼠胰腺結(jié)構(gòu)彌漫性破壞，細(xì)胞腫脹，實質(zhì)性出血明顯，并伴有炎癥細(xì)胞浸潤；腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，間隔稀疏，水腫增加，腸黏膜上皮脫落，并伴有炎癥細(xì)胞浸潤。陽性藥對照組、QJHGD治療組大鼠的胰腺組織壞死區(qū)域、炎癥細(xì)胞浸潤較模型組減少，胰腺小葉水腫減輕、出血壞死灶減少；腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)稍紊亂，可見炎癥細(xì)胞浸潤，少許腸黏膜上皮脫落。組織病理學(xué)損傷評分結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠胰腺及小腸組織的病理評分均顯著升高；與模型組比較，陽性藥對照組大鼠小腸組織的病理評分和QJHGD治療組大鼠胰腺及小腸組織的病理評分均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表2、圖1。

圖1 各組大鼠胰腺及小腸組織的病理學(xué)觀察顯微圖（蘇木素-伊紅染色，×200）

表2 各組大鼠胰腺及小腸組織的病理評分結(jié)果（±s，n＝10）

表2 各組大鼠胰腺及小腸組織的病理評分結(jié)果（±s，n＝10）

a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別空白對照組模型組陽性藥對照組QJHGD治療組小腸組織0.63±0.14 5.24±1.81a 3.84±0.33b 2.55±0.21b胰腺組織0.62±0.23 10.29±3.45a 8.12±2.95 7.57±2.31b

3.4 QJHGD對SAP模型大鼠小腸組織中HMGB1、Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠小腸組織中HMGB1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性藥對照組、QJHGD治療組大鼠小腸組織中HMGB1蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖2。

圖2 QJHGD對SAP模型大鼠小腸組織中HMGB1、Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)的影響

3.5 腸道菌群測序及分析結(jié)果

3.5.1 測序樣本合理性考察結(jié)果 稀釋曲線是評估OTUs數(shù)量是否趨近于飽和以及樣品物種豐富程度的重要指標(biāo)，Shannon曲線是根據(jù)各樣本測序量在不同測序深度時的微生物多樣性指數(shù)所繪制的曲線[15]。本研究收集了空白對照組、模型組、QJHGD治療組共30只大鼠的小腸內(nèi)容物樣本，通過微生物稀釋曲線圖、Shannon曲線圖考察測序樣本的合理性，結(jié)果見圖3。由圖3可見，稀釋曲線和Shannon曲線均逐漸趨向平坦，各樣本有效序列大于70 000，觀測到的OTUs數(shù)量約為1 000，這表明本研究測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物信息。

圖3 測序數(shù)據(jù)量合理性評估圖

3.5.2 組間群落結(jié)構(gòu)差異檢驗 基于Bray-Curtis算法對微生物結(jié)構(gòu)組間差異進(jìn)行Anosim非參數(shù)檢驗，結(jié)果表明，空白對照組、模型組、QJHGD治療組大鼠小腸內(nèi)容物樣本兩兩比較，P值均小于0.01，相關(guān)變量系數(shù)R2分別為0.546（空白對照組vs.模型組）、0.681（模型組vs.QJHGD治療組）、0.898（空白對照組vs.QJHGD治療組），均大于0，提示這3組樣本組間差異明顯，分組合理有意義。

3.5.3 OTUs分析和菌群組成分析 對30個小腸內(nèi)容物樣本進(jìn)行高通量測序分析，得到2 361 942條測序數(shù)據(jù)，每個樣品平均78 731條，共聚類得到2 620個OTUs。其中，空白對照組和模型組共有的OTUs數(shù)量為1 377個，模型組和QJHGD治療組共有的OTUs數(shù)量為675個。經(jīng)鑒定，小腸內(nèi)容物樣本中的腸道菌群涉及16個門、211個屬。根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取各組在門水平和屬水平上相對豐度排名前10位的菌群，得到菌群相對豐度堆積柱形圖，具體見圖4。

圖4 各組樣本在門水平和屬水平上的物種組成分布

在門水平上，樣本腸道菌群涉及厚壁菌門Firmicutes、變形菌門Proteobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、放線菌門Actinobacteria、軟壁菌門Tenericutes、ε-變形菌門ε-Proteobacteria、藍(lán)藻門Cyanophyta、髕骨菌門Patescibacteria、脫鐵桿菌門 Deferribacteres、螺旋體門Spirochaetes等。其中，厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門是各組大鼠腸道菌群門水平的主要構(gòu)成物種。在空白對照組、模型組、QJHGD治療組中，厚壁菌門的相對豐度分別為56.2%、55.1%、50.2%，變形菌門的相對豐度分別為33.3%、20.5%、2.3%，擬桿菌門的相對豐度分別為4.4%、17.2%、40.2%，放線菌門的相對豐度分別為4.8%、3.9%、6.9%。

在屬水平上，各組樣本相對豐度較高的菌屬為擬桿菌屬Bacteroides、真桿菌屬Eubacteriumprévot、普雷沃氏菌屬PrevotellaShanandCollins、乳酸桿菌屬Lactobacillus、瘤胃球菌屬Ruminococcus、埃希氏-志賀氏菌屬Escherichia-Shigella、梭狀芽孢桿菌屬Clostridium、羅斯氏菌屬Rothia、毛螺菌科NK4A136組Lachnospiraceae_NK4A136group等。其中，真桿菌屬、普雷沃氏菌屬、乳酸桿菌屬和瘤胃球菌屬是各組大鼠腸道菌群屬水平的主要構(gòu)成物種。在空白對照組、模型組、QJHGD治療組中，真桿菌屬的相對豐度分別為28.5%、40.2%、36.1%，普雷沃氏菌屬的相對豐度分別為6.3%、19.5%、33.7%，乳酸桿菌屬的相對豐度分別為9.4%、10.1%、21.3%，瘤胃球菌屬的相對豐度分別為14.1%、4.6%、0.9%。

3.5.4 腸道菌群的α多樣性分析 對各組大鼠腸道菌群的整體群落結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行α多樣性分析，結(jié)果如表3所示。3組樣本的測序深度指數(shù)Coverage均達(dá)到0.996±0.001，這表明本研究測序深度足夠深，絕大多數(shù)細(xì)菌能得到有效檢測和覆蓋。菌群豐度指數(shù)Ace和Chao1是表征菌群相對豐度的指標(biāo)[16]。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組Ace指數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，QJHGD治療組Ace、Chao1指數(shù)顯著降低（P＜0.05），這表明大鼠腸道菌群整體結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。Shannon、Simpson是可以反映α多樣性的指數(shù)，可表征微生物多樣性的豐富程度；二者值越大，表明群落中微生物多樣性越高，反之，表明微生物多樣性越低[17]。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組Shannon指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，QJHGD治療組Shannon、Simpson指數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。

表3 各組樣本α多樣性分析的相關(guān)指數(shù)統(tǒng)計結(jié)果（±s，n＝10）

表3 各組樣本α多樣性分析的相關(guān)指數(shù)統(tǒng)計結(jié)果（±s，n＝10）

a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別空白對照組模型組QJHGD治療組Simpson 0.949±0.026 0.925±0.120 0.693±0.251b Coverage 0.996±0.001 0.996±0.001 0.996±0.001 Ace 995.131±87.267 972.319±184.121a 385.374±90.838b Chao1 963.937±80.068 950.334±186.453 390.509±95.783b Shannon 5.447±0.506 6.166±1.523a 3.245±1.503b

3.5.5 腸道菌群β多樣性分析 腸道菌群β多樣性分析結(jié)果顯示（圖5），各組組內(nèi)聚集性良好，表明同組樣本內(nèi)部菌群結(jié)構(gòu)的相似性較強(qiáng)?？瞻讓φ战M和模型組之間的菌群結(jié)構(gòu)有一定差異；QJHGD治療組與模型組呈現(xiàn)出明顯的分離趨勢，且給藥后菌屬分布的離散程度大于給藥前，這表明經(jīng)QJHGD干預(yù)后，組間樣本菌群結(jié)構(gòu)差異較大，這也與“3.5.2”項下分析結(jié)果一致。

圖5 各組樣本β多樣性分析結(jié)果

4 討論

SAP是多種病因影響下由急性胰腺炎發(fā)展來的臨床急危重癥，也是胃腸道疾病患者住院的主要原因之一，目前無特效治療藥物。根據(jù)2021年中國急性胰腺炎指南推薦，SAP早期治療策略之一是使用質(zhì)子泵抑制劑來抑制胃酸分泌，減少胰腺分泌[17]。胃酸屏障是維持胃腸道微生物穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵，抑酸劑及其他藥物的頻繁使用會改變消化道內(nèi)腔環(huán)境，使得腸道菌群失調(diào)和固有免疫系統(tǒng)失衡，從而加重炎癥級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致胰腺壞死、腸黏膜損傷加重[18]。有研究表明，腸道菌群失調(diào)與SAP明顯相關(guān)，其機(jī)制之一是腸道菌群紊亂引起腸黏膜的過度免疫反應(yīng)和持續(xù)炎癥，使得腸黏膜屏障破壞、腸內(nèi)細(xì)菌移位，繼而導(dǎo)致胰腺、胰周感染及膿毒血癥等，引起SAP患者“第2個死亡高峰”，因此及時有效地維持腸道屏障生理功能、糾正腸道菌群失衡對于防治SAP極為關(guān)鍵[19]。中醫(yī)藥全程干預(yù)不僅可以抑制炎癥因子過度釋放，遏制瀑布樣級聯(lián)效應(yīng)，還可在改善SAP腸梗阻、修復(fù)腸屏障、抑制腸道菌群移位等方面發(fā)揮有益作用[20]。中醫(yī)理論認(rèn)為，SAP屬濕熱瘀濁絞結(jié)于中焦，腑氣不通，耗氣傷陰，日久成毒；針對早期SAP的“熱、毒、濕、瘀”濁邪，治療當(dāng)“清熱化濕解毒、化瘀攻下存陰”并舉[21]。QJHGD是遵從上述治則、長期廣泛使用且確有療效的臨床協(xié)定處方，由柴胡、大黃、厚樸、黃芩、木香、桃仁、枳實等組合而成，具有清熱化濕、解毒化瘀的功效。

本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠血清中促炎因子血清淀粉酶、IL-10、IL-18、IL-1β水平顯著升高，胰腺和小腸組織結(jié)構(gòu)破壞、水腫分裂，表明造模成功；經(jīng)QJHGD干預(yù)后，治療組大鼠血清中血清淀粉酶、IL-18水平較模型組顯著降低，胰腺和小腸組織病理形態(tài)得到改善。

腸黏膜屏障是腸道防止腸內(nèi)有害物質(zhì)如細(xì)菌和毒素穿過腸黏膜進(jìn)入體內(nèi)組織、器官和血液循環(huán)的統(tǒng)稱，由生物屏障、化學(xué)屏障、機(jī)械屏障和免疫屏障構(gòu)成[22]。腸上皮細(xì)胞是維持腸黏膜機(jī)械屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，包含了Occludin、ZO-1及黏附連接分子等組成的緊密連接復(fù)合體。Occludin是內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能正常的象征性蛋白，主要參與腸壁通透性的調(diào)節(jié)；ZO-1屬于膜結(jié)合鳥苷酸激酶家族，在維持腸屏障緊密連接體系中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是評價腸道通透性的重要指標(biāo)[23]。HMGB1是高遷移率蛋白家族成員之一，是組織激發(fā)炎癥反應(yīng)的主要因子，與晚期糖基化終產(chǎn)物受體、Toll樣受體結(jié)合后，可激活下游炎癥信號通路參與病情進(jìn)展，可作為急性胰腺炎病情嚴(yán)重程度的標(biāo)志性反應(yīng)因子，同時也是腸黏膜屏障損害的重要參考指標(biāo)[24]。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠小腸組織中HMGB1蛋白表達(dá)水平顯著升高，Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)水平顯著降低，這表明模型組大鼠腸黏膜緊密連接完整性和屏障功能受損；經(jīng)QJHGD干預(yù)后，大鼠小腸組織中HMGB1蛋白表達(dá)水平顯著降低，Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高，這表明QJHGD可有效恢復(fù)腸黏膜屏障損傷。

作為腸道菌群中的兩大優(yōu)勢微生物，厚壁菌和擬桿菌參與了機(jī)體能量代謝、脂肪存儲等過程，厚壁菌/擬桿菌的比值（F/B）反映了機(jī)體能量吸收與貯存的能力，是腸道穩(wěn)態(tài)的生理性指標(biāo)之一，該比值越低則腸道菌群越穩(wěn)定[25]。本研究結(jié)果顯示，QJHGD治療組厚壁菌相對豐度較模型組降低，而擬桿菌相對豐度較模型組升高，由此可知QJHGD治療組F/B數(shù)值降低，這說明QJHGD可調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂，改善腸道微生態(tài)失衡。擬桿菌作為革蘭氏陰性菌之一，其死亡后會裂解脫落形成脂多糖，脂多糖與結(jié)合蛋白、細(xì)胞表面CD14結(jié)合后，可激活以核因子κB為代表的癌癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)多種促炎因子的釋放，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥及全身炎癥級聯(lián)反應(yīng)[26]。變形菌包含了很多潛在的致病菌，其相對豐度升高可增加腸道對炎癥的敏感性，該類菌群相對豐度升高也是腸道菌群失調(diào)的標(biāo)志[27]。但本研究卻發(fā)現(xiàn)，相比于空白對照組，模型組變形菌相對豐度明顯降低，這與理論情況不一致。筆者推測可能是樣本量較少而引起的測序誤差，后續(xù)可重復(fù)實驗進(jìn)一步考察該菌群結(jié)果的可靠性。普雷沃氏菌能夠利用富含纖維的碳水化合物產(chǎn)生短鏈脂肪酸，從而發(fā)揮抗炎作用；乳酸桿菌可參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)，其繁殖過程可產(chǎn)生低能脂肪酸，從而有效降低腸道pH值，抑制大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜菌等有害菌群的生長[28－29]。乳酸桿菌還可通過刺激免疫相關(guān)Toll樣受體、T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子等的活化，抑制促炎因子如IL-6、IL-1β的釋放，進(jìn)而保護(hù)腸黏膜屏障的完整性，影響?zhàn)つっ庖吖δ躘30]。本研究結(jié)果顯示，QJHGD可上調(diào)SAP模型大鼠腸道普雷沃氏菌屬、乳酸桿菌屬等菌落結(jié)構(gòu)；在ELISA實驗中也得出，QJHGD可下調(diào)促炎因子血清淀粉酶、IL-18、IL-1β水平，并上調(diào)抑炎因子IL-10水平，這與胡煒等[31]研究結(jié)果一致，表明QJHGD可增加益生菌群的相對豐度，減少有害菌群定植，減少炎癥因子釋放，從而維護(hù)腸穩(wěn)態(tài)。在菌群α多樣性分析中，與空白對照組比較，模型組Simpson反而降低，基于菌群真實世界測序結(jié)果，我們推測這種反差可能是由樣本抽樣誤差和群落內(nèi)部菌群分布不均勻引起，后續(xù)本課題組將加大測序樣本量，以驗證該結(jié)果。綜上，QJHGD對SAP模型大鼠菌群的相對豐度和多樣性均有一定的調(diào)節(jié)作用，能夠改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，優(yōu)化物種多樣性。

總之，QJHGD可有效抑制SAP模型大鼠胰腺及小腸組織的炎癥反應(yīng)，可通過上調(diào)小腸組織中ZO-1、Occludin的表達(dá)，下調(diào)HMGB1蛋白的表達(dá)，改善腸黏膜屏障損傷；并通過升高擬桿菌門、乳酸桿菌屬等益生菌群的相對豐度，減少厚壁菌門等有害菌群的定植發(fā)揮保護(hù)腸道的作用。