梁俊超，趙 翔，劉紅祥，袁 飛，李 坤，郝堯光，王宗升，王輝之，劉 東，杜元釗

（1.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院人獸共患病研究所，人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春 130062；2.青島易邦生物工程有限公司，動(dòng)物基因工程疫苗國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266000；3.青島市市北區(qū)疾病預(yù)防控制中心，山東青島 266000）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）可引發(fā)豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），俗稱“藍(lán)耳病”。PRRS 是一種高度接觸性傳染病，導(dǎo)致豬群出現(xiàn)繁殖障礙、免疫抑制及呼吸道疾病等問題，引發(fā)豬只死淘率增高，對(duì)豬場生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響。PRRSV 是一種有囊膜的單股正鏈RNA 病毒，基因組大小15 kb 左右，含開放閱讀框（open reading frame，ORF）至少11 個(gè)，編碼結(jié)構(gòu)蛋白8 種，非結(jié)構(gòu)蛋白至少16 種。

PRRSV 可分為兩大亞群，分別為PRRSV1（歐洲株）和PRRSV2（美洲株）[1]。據(jù)ORF5 基因序列分析，PRRSV2 可分為9 個(gè)譜系，其中在我國流行的主要分布在4 個(gè)譜系，分別為譜系1（代表毒株為NADC30 及MN184B）、譜系3（代表毒株為GM2）、譜系5（代表毒株為VR2332）及譜系8（代表毒株為CH-1a、BJ0706 及JXA1）[2]。2012年前，在我國流行的PRRSV 毒株為經(jīng)典美洲株（代表毒株CH-1a）和高致病性毒株（HP-PRRSV，代表毒株JXA1），其中2006 年以后HP-PRRSV 為主要流行毒株，其致病力比經(jīng)典PRRSV 明顯增強(qiáng)[3-4]。2012 年NADC30-like PRRSV 被報(bào)道。該類毒株易重組，彼此間同源性低，且臨床致病性具有明顯差異。2017 年后，我國多省發(fā)現(xiàn)NADC34-like PRRSV[5-6]。當(dāng)前，我國主要流行毒株已逐漸 由HP-PRRSV 轉(zhuǎn) 為NADC30-like PRRSV[7]。NADC30-like PRRSV 毒株與美國1-7-4 分支毒株相似，而1-7-4 分支毒株已對(duì)美國及秘魯?shù)酿B(yǎng)豬業(yè)造成重大影響。2020 年美國報(bào)道一種美洲型HPPRRSV 毒株，被命名為ORF5 1-4-4 Lineage 1C 變異株（簡寫為PRRSV 1-4-4）[8]。該毒株傳播力強(qiáng)，致死率高，已嚴(yán)重影響美國養(yǎng)豬業(yè)。NADC30-like PRRSV、NADC34-like PRRSV 及PRRSV 1-4-4 均為PRRSV2（美洲株），且屬于譜系1[9]。

本試驗(yàn)收集2020 年我國部分地區(qū)PRRSV 感染臨床可疑樣品，通過ORF5 基因測序比對(duì)分析，了解國內(nèi)PRRS 的分子流行病學(xué)變化情況，旨為PRRS 防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料收集處理

2020 年從山東、河北、江蘇、安徽等7 個(gè)省，采集570 份疑似PRRSV 感染的病料（胎衣和組織）、血液（全血和臍帶血）及精液，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室處理后，按照文獻(xiàn)[10]的RT-PCR 方法進(jìn)行抗原檢測。

檢測用ORF5 基因引物如下：

上 游：CATTTCATGACACCTGAGACCA；下游：AGAGCATATATCATCACTGGCG。

RT-PCR 擴(kuò)增條件如下：

94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性15 s，54 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，32 個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸10 min。

1.2 主要試劑

RNA 提取試劑盒，購于TAKARA 公司；高保真反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購于羅氏公司；LATaqDNA聚合酶，購于寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 PRRSV GP5 測序

將PRRSV RT-PCR 陽性產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.4 核苷酸進(jìn)化分析

通過軟件DNAstar Lasergene，對(duì)送檢測序PRRSV ORF5 基因進(jìn)行序列同源性比對(duì)分析；利用MEGA 6.0 軟件，對(duì)ORF5 基因序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

1.5 氨基酸進(jìn)化分析

通過軟件DNAstar Lasergene，對(duì)送檢測序PRRSV GP5 蛋白氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行分析，并基于ORF5 基因編碼序列，通過NetNGlyc l.0 Sever 在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/），預(yù)測并分析相應(yīng)氨基酸序列的糖基化位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR 檢測

將2020 年采集的570 份疑似PRRSV 感染病料進(jìn)行RT-PCR 檢測，目的條帶大小為603 bp。結(jié)果（圖1、表1）顯示：從送檢的疑似PRRSV 感染病料中檢出PRRSV 病原陽性135 份，陽性檢出率為23.68%，其中保育豬病料的陽性檢出率最高，為32.24%，哺乳豬次之，為19.09%。

表1 2020 年不同豬群送檢病料的PRRSV 陽性檢出結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.2 ORF5 基因同源性比對(duì)分析

隨機(jī)送檢60 份PRRSV 陽性樣品的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行ORF5 基因測序，經(jīng)比對(duì)后確認(rèn)得到60個(gè)603 bp 的ORF5基因序列。將 這60 個(gè)ORF5基因序列按照“送檢年月-樣品編號(hào)-送檢省份縮寫”進(jìn)行編號(hào)?；蛐蛄袑?duì)應(yīng)省份及數(shù)量分布見表2。60 個(gè)ORF5 基因序列與不同譜系標(biāo)準(zhǔn)毒株序列通過DNAstar 軟件的比對(duì)結(jié)果（表3、圖2）顯示，60 個(gè)ORF5 基因序列彼此間同源性為79.9%～100%，與國內(nèi)流行的PRRSV2 4 個(gè)譜系標(biāo)準(zhǔn)毒株同源性為81.3～99.7%，與PRRSV1 標(biāo)準(zhǔn)毒株同源性僅為60.7%～63.8%，表明這60 個(gè)PRRSV毒株均為PRRSV2。

表2 60 個(gè)PRRSV 基因序列區(qū)域分布及數(shù)量 單位：個(gè)

表3 60 個(gè)PRRSV ORF5 基因序列與標(biāo)準(zhǔn)毒株同源性對(duì)比結(jié)果 %

2.3 ORF5 基因遺傳進(jìn)化分析

60 個(gè)PRRSV 的ORF5 基因序列通過MEGA 6.0 軟件繪制遺傳進(jìn)化樹。結(jié)果（圖3）顯示，31個(gè)PRRSV 屬于譜系1，占比達(dá)51.67%，26 個(gè)屬于譜系8，占比達(dá)43.33%。此外，1 個(gè)PRRSV 屬于譜系3，1 個(gè)屬于譜系5，而剩余1 個(gè)（20200624-262-JS）介于譜系5 和譜系8（可能為疑似PRRSV重組毒株，有待進(jìn)一步研究），占比均為1.67%。

2.4 GP5 蛋白氨基酸位點(diǎn)變異分析

將60 個(gè)PRRSV GP5 蛋白氨基酸序列通過DNAstar 軟件與相應(yīng)譜系的標(biāo)準(zhǔn)毒株進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果（圖4）顯示，60 個(gè)PRRSV GP5 蛋白氨基酸以點(diǎn)突變?yōu)橹?，其?0 個(gè)PRRSV 分別在33 aa 或34 aa 處存在缺失突變；信號(hào)肽區(qū)域（1～25 aa）以及27～39、57～61、120～125、167～170 及189～196 aa等6 個(gè)區(qū)域的氨基酸點(diǎn)突變集中程度較高。

60個(gè)PRRSV GP5蛋白的2個(gè)非中和表位（27～30和180～197 aa）、1 個(gè)中和表位（37～45 aa）及2 個(gè)潛在毒力位點(diǎn)（R13和R151）氨基酸變化及相應(yīng)譜系占比詳見表4。從表4 可知：60 個(gè)PRRSV 在非中和表位（180～197 aa）突變比例最高，平均為96.67%；其次為R13潛在毒力位點(diǎn)，突變比例平均為53.33%；非中和表位（27～30 aa）突變比例最低，平均為35.00%；而中和表位及R151潛在毒力位點(diǎn)也發(fā)生不同程度突變，平均分別為51.67%和48.33%。

表4 60 個(gè)PRRSV 的GP5 蛋白重要氨基酸位點(diǎn)變化及相應(yīng)譜系占比 %

2.5 GP5 蛋白潛在N-糖基化位點(diǎn)變異分析

通過NetNGlyc l.0 Sever 在線軟件，對(duì)60 個(gè)PRRSV GP5 蛋白氨基酸序列的N-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測分析。結(jié)果（表5）顯示，譜系1 參考毒株NADC30、PRRSV 1-4-4 和NADC34 潛在糖基化位點(diǎn)數(shù)量分別為3、4 和5 個(gè)，而潛在糖基化位點(diǎn)數(shù)量為4 個(gè)的樣品占比最高，為48.39%（15/31）；譜系3、譜系5 參考毒株與其相應(yīng)樣品PRRSV 潛在糖基化位點(diǎn)數(shù)量一致；20200624-262-JS 潛在糖基化位點(diǎn)數(shù)量為3 個(gè)；譜系8 參考毒株CH-1a和JXA1 潛在糖基化位點(diǎn)數(shù)量分別為3 和4 個(gè)，潛在糖基化位點(diǎn)數(shù)量為4 個(gè)的樣品占比最高，為73.08%（19/26）。60 個(gè)PRRSV 的潛在N-糖基化位點(diǎn)位置主要集中在34～35、43～44 和50～51 aa，占比分別為65.00%（39/60）、96.67%（58/60）和100%（60/60）。

表5 60 個(gè)PRRSV 的GP5 蛋白潛在N-糖基化位點(diǎn)數(shù)量及位置分布 單位：個(gè)

3 討論

PRRS 是豬場防控的重要豬病。我國豬群PRRSV 感染較普遍，田間流行毒株復(fù)雜多樣[11]。從PRRSV 的RT-PCR 抗原檢測結(jié)果可知，疑似發(fā)病場的PRRSV 陽性檢出率為23.68%，其中保育豬群最高（32.24%），這與豬場臨床發(fā)病情況相符，主要與保育階段豬只免疫力低、應(yīng)激因素多以及環(huán)境因素等直接相關(guān)[12]。

通過60 個(gè)PRRSV 的ORF5 基因同源性比對(duì)結(jié)果可知，不同PRRSV 毒株間同源性差異較大，譜系1 中PRRSV 與NADC30、NADC34及PRRSV 1-4-4 的同源性為87.1%～97.7%，與其他譜系參考毒株同源性＜88.2%；譜系8 中PRRSV 與JXA1、HuN4 及TJ PRRSV 的同源性為97.2%～99.7%，與其他譜系參考毒株同源性＜89.1%。由此可知，不同譜系PRRSV 的ORF5 基因同源性較低，而PRRSV 同源性高低對(duì)PRRSV疫苗保護(hù)效果產(chǎn)生影響[13]。

通過進(jìn)化樹結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)：59 個(gè)PRRSV分別屬于譜系1、譜系3、譜系5 和譜系8，剩余1 個(gè)介于譜系5 與譜系8；譜系1 占比最高，為51.67%，其中30 個(gè)為NADC30-like PRRSV，僅1 個(gè)河北樣品為NADC34-like PRRSV，未發(fā)現(xiàn)PRRSV 1-4-4 及MN184B PRRSV。結(jié)果表明，國內(nèi)流行的PRRSV 毒株復(fù)雜多樣，但以NADC30-like PRRSV 為主流流行毒株。該結(jié)果與張洪亮等[5]、楊漢春等[14]的報(bào)道相符。

N 端胞外域27～41 aa 區(qū)域和C 末端180～197 aa 區(qū)域是PRRSV GP5 蛋白2 個(gè)重要抗原表位相關(guān)區(qū)域[15]。相關(guān)研究[16]顯示，GP5 蛋白的C端抗原表位在維持其蛋白構(gòu)象方面具有重要作用。GP5 蛋白具有3 個(gè)重要抗原表位，分別為中和抗原表位37～45 aa、非中和抗原表位（又稱誘餌表位）27～30 aa 和非中和抗原表位180～197 aa。非中和抗原表位27～30 aa 和中和抗原表位37～45 aa 在中和抗體產(chǎn)生過程具有關(guān)鍵作用，其中38 和42～44 aa是病毒中和表位的識(shí)別位點(diǎn)，39～41 aa 是病毒中和表位的結(jié)合位點(diǎn)[17]。通過氨基酸比對(duì)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，譜系1 中PRRSV 的中和表位及2 個(gè)非中和表位均有突變，其中中和表位突變率低，為9.68%，2 個(gè)非中和表位27～30 和180～197 aa 突變比例相比中和表位更高，180～197 aa 表位突變比例高達(dá)96.77%，這可能對(duì)中和抗體產(chǎn)生及GP5 蛋白構(gòu)象產(chǎn)生影響，導(dǎo)致PRRSV 免疫失敗[18-19]。

譜系3 中PRRSV 的3 個(gè)表位均發(fā)生突變；譜系5 中PRRSV 及20200624-262-JS 各有2 個(gè) 表位發(fā)生突變，其中180～197 aa 表位均發(fā)生突變；譜系8 中的PRRSV 只有中和表位及非中和表位180～197 aa 發(fā)生突變，且突變比例均為100%，其中中和表位突變位點(diǎn)主要為39 aa，而該位點(diǎn)是病毒中和表位的結(jié)合位點(diǎn)，這或?qū)P5 蛋白構(gòu)象及中和抗體對(duì)病毒的結(jié)合能力產(chǎn)生影響，也可能對(duì)蛋白免疫原性產(chǎn)生影響，更利于病毒免疫逃避，影響現(xiàn)有疫苗免疫保護(hù)效果[20]。

據(jù)相關(guān)研究[21]，GP5 蛋白R(shí)13和R151與PRRSV 毒力相關(guān)，是潛在毒力位點(diǎn)。60 個(gè)PRRSV僅20200624-262-JS 的2 個(gè)位點(diǎn)均未發(fā)生突變，其余59 個(gè)PRRSV 均發(fā)生不同程度突變，尤其譜系1中PRRSV 的R13位點(diǎn)突變比例高達(dá)96.77%，這對(duì)NADC30-like PRRSV 的毒力影響程度有待進(jìn)一步研究。GP5 蛋白具有多個(gè)糖基化位點(diǎn)，這些糖基化位點(diǎn)嚴(yán)重影響病毒蛋白的正確折疊及生物學(xué)特性，可形成糖基屏蔽效應(yīng)有利于病毒免疫逃避及持續(xù)性感染[21-22]。

通過N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，60 個(gè)PRRSV糖基化位點(diǎn)數(shù)量及分布相比各自譜系參考毒株均存在不同程度差異，這也表明不同PRRSV 免疫逃避能力存在差異，因而加重了PRRS 防控的復(fù)雜程度。

疫苗免疫是PRRS 防控的重要手段。我國目前商品化的PRRSV 疫苗均為PRRSV2 且屬于譜系8，與當(dāng)下田間流行的NADC30-like PRRSV 野毒株同源性較低。PRRSV 弱毒活苗對(duì)不同野毒株具有交叉保護(hù)性，其與野毒株同源性高低可能與保護(hù)率無關(guān)。Opriessnig 等[23]在豬群免疫PRRSV弱毒活苗后，用與疫苗毒同源性僅為76%的高毒力PRRSV 攻毒，發(fā)現(xiàn)免疫組比未免疫組肺臟損傷率低37.8%，僅為4.2%。據(jù)報(bào)道[24]，TJM-F92 等PRRSV 弱毒活苗與NADC-like PRRSV 同源性雖大多小于89%，但對(duì)NADC-like PRRSV 仍可提供有效臨床保護(hù)，減輕臨床癥狀，縮短發(fā)病時(shí)間，改善平均日增重。由此可知，PRRSV 弱毒活疫苗對(duì)同源性低的野毒株也可提供一定的交叉保護(hù)，對(duì)免疫豬群可提供有效的臨床保護(hù)，改善豬群體況?？傊?，PRRS 需要綜合防控，豬場除可選用安全有效的PRRSV 弱毒活疫苗外，豬場生物安全及飼養(yǎng)管理也具有重要作用。