李 彬，韓曉青，劉 平，劉紅祥，宋姍姍，于 靜，范慶增，張宇龍，譚 鵬，杜元釗，劉 東

（青島易邦生物工程有限公司，動物基因工程疫苗國家重點實驗室，山東青島 266032）

禽呼腸孤病毒（avian reoviruses，ARV）屬于呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬，基因組為雙股分節(jié)段 RNA。根據(jù) SDS-PAGE 電泳遷移率不同，可將ARV 的RNA 分為10 個節(jié)段，依次為L（L1、L2、L3）、M（M1、M2、M3） 和S（S1、S2、S3、S4）。S1基因編碼σC、P10、P17 3 種蛋白，其中P10 和P17 是非結(jié)構(gòu)蛋白，σC 是外殼蛋白。σC 蛋白參與細胞吸附，可誘發(fā)機體產(chǎn)生特異性中和抗體，是ARV 的主要抗原決定簇，其變異可導(dǎo)致病毒致病性變化，在ARV 感染及致病中發(fā)揮重要作用。ARV 可影響各種禽類，包括雞、鴨和鵝，肉雞感染后表現(xiàn)腱鞘炎、心肌炎、免疫抑制和發(fā)育遲緩綜合癥等臨床癥狀，對養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[1-3]。

近年來，我國ARV 引起的白羽肉雞發(fā)病率明顯升高[4]，發(fā)病日齡大多在15 日齡以后直至出欄，發(fā)病率為5%～20%。發(fā)病雞群的上一代種雞群大多免疫過經(jīng)典ARV 疫苗[5]，說明這種常規(guī)疫苗并沒有提供足夠的臨床保護。ARV 易變異重組，因此全面了解其分子流行病學(xué)特征具有十分重要的意義。為了解我國雞群中ARV 的遺傳變異特點，2020—2021 年從山東、河北、遼寧、江蘇、福建等省份收集疑似ARV 感染樣品，采用RT-PCR 方法篩選陽性樣本，然后對陽性樣本進行σC基因（1 088 bp）測序，并根據(jù)測序結(jié)果分析ARV 不同基因型的分布規(guī)律，以期為我國ARV 感染的防控提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣品及來源

2020—2021 年從山東、河北、福建、安徽、遼寧、江蘇等6 個省，采集疑似感染ARV 白羽肉雞的腿或肌腱等組織樣本共253 份。采樣雞群涵蓋網(wǎng)養(yǎng)、地面平養(yǎng)、籠養(yǎng)等多種飼養(yǎng)方式（表1）。疑似ARV 感染發(fā)病雞群日齡多為15～25 日齡，個別為10 日齡左右；采食、飲水正常，表現(xiàn)趴臥、不愿走動等癥狀（圖1），隨病程發(fā)展病雞撇腿明顯，多為單側(cè)腿外撇；前期無死亡，后期因癱瘓被踩踏或繼發(fā)細菌性疾病，導(dǎo)致死淘率增加，至出欄時累計淘汰率為3%～20%。解剖可見，跗關(guān)節(jié)發(fā)青，肌腱水腫、炎性滲出、出血（圖2）。

表1 部分樣品來源雞群的流行病學(xué)信息

1.2 試劑與耗材

RT-PCR 試劑（一步法試劑盒）和Marker，為Takara 公司產(chǎn)品；50×TAE buffer，為上海生工公司產(chǎn)品；Goldview 核酸染料，為labest 公司產(chǎn)品；瓊脂糖，為康為世紀(jì)公司產(chǎn)品；核酸提取純化試劑盒，為杭州博日公司產(chǎn)品。

1.3 儀器與設(shè)備

超凈工作臺DL-CJ-INDII，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；離心機TD24-WS，eppendorf公司產(chǎn)品；核酸提取純化儀NPA-32P，杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；電泳儀DYY-6C，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像儀JS-2000，上海培清科技有限公司產(chǎn)品；移液器，eppendorf 公司產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 病料RNA 提取 取腿或肌腱等組織病料約2 g，加入4～5 mL 滅菌PBS 或者生理鹽水，置研磨器（滅菌）中研磨或者用剪刀細心剪碎，置-20 ℃中反復(fù)凍融3 次，離心取上清備用。取上述病料樣品上清約300 μL 置1.5 mL 的離心管，取樣加入自動核酸提取板中，按照說明書操作提取RNA。

1.4.2 RT-PCR 檢測 根據(jù)NCBI 上發(fā)表的ARVσC基因序列設(shè)計特異性引物（表2）用于樣品檢測。引物由上海生工生物工程有限公司合成。RTPCR 反應(yīng)條件（一步法試劑盒）：50 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸90 s，共32 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。RT-PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用凝膠成像儀觀察和記錄結(jié)果。

表2 引物序列和擴增目的片段大小

1.4.3σC基因測序及遺傳進化分析 將RT-PCR產(chǎn)物進行電泳后，對目的條帶進行膠回收，回收產(chǎn)物與pMD18-T 載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細胞，然后將其涂在氨芐板上，37 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)過夜；挑取單個白色菌落，接種到含有氨芐的LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)8 h 以上；對菌液進行RT-PCR 檢測，將陽性菌液送至生工基因公司進行測序。將測序結(jié)果拼接，采用MegAlign 軟件將檢測序列與NCBI 中發(fā)表的已知序列（表3）進行比對，并采用鄰接法（MEGA6.0 軟件）構(gòu)建進化樹。

表3 不同基因型ARV 參考序列

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 檢測

對253 份疑似ARV 感染樣品進行RT-PCR 檢測，檢出ARV 陽性157 份，平均陽性檢出率為62.1%；6 個省份均有陽性檢出，其中山東的陽性檢出率為64.2%（68/106），福建為58.6%（34/58），江蘇為60.5%（23/38），遼寧為77.3%（17/22），安徽為55.0%（11/20），河北為44.4%（4/9）。具體檢測結(jié)果見表4、圖3。

表4 2020—2021 年疑似ARV 感染樣本檢測統(tǒng)計結(jié)果

2.2 σC 基因分子進化分析

將157 份ARV 陽性樣本進行σC基因序列測序，然后與GenBank 上發(fā)表的ARV 參考毒株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進行比對。結(jié)果顯示：157 份ARV 陽性樣本共分為6 個基因型。61 份（38.8%）屬于基因1 型，其中38 份與標(biāo)準(zhǔn)ARV 疫苗株（S1133）屬于同一亞分支，另外23 份處于單獨分支，與4599 參考株處于另一亞分支；41 份（26.11%）為基因2 型，15 份（9.6%）為基因3 型，9 份（5.73%）為基因4型，30份（19.11%）為基因5型，1份（0.64%）為基因6型。根據(jù)σC基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。

3 討論

ARV 是無囊膜的dsRNA 病毒，其基因組由10 個節(jié)段組成。其中S1基因片段的σC基因編碼的細胞附著蛋白，是ARV的主要抗原決定簇。因此，σC基因常被用作ARV 毒株分型的依據(jù)[6]。根據(jù)σC基因不同，可將其分為6 種基因型[7]。ARV 容易變異重組。近年來，美國、巴西、日本、韓國等國家均有種雞免疫過ARV 商品化疫苗（如1133、1733、2408）但下一代雞群仍然發(fā)病的現(xiàn)象。國外學(xué)者對ARV 分離毒株σC基因進行分析研究發(fā)現(xiàn)，目前廣泛使用的商品化疫苗（如S1133、1733、2408 等）均為基因I 型，而ARV 的臨床分離株多為基因2～6 型，而且不同基因型之間的交叉保護存在較大差異[7-8]。

近年來，我國白羽肉雞群ARV 感染的發(fā)病率呈明顯上升趨勢[4]，造成發(fā)病雞跛行、行走困難、撇腿等，尤其是屠宰時青腿現(xiàn)象異常增加，造成廢棄率升高，給養(yǎng)殖企業(yè)帶來了較大困擾。針對該問題，我國學(xué)者也做了相關(guān)研究[9-10]，發(fā)現(xiàn)國內(nèi)存在多種基因型ARV 流行，其與廣泛使用的經(jīng)典疫苗株S1133 有較大差異。本調(diào)查對我國部分省份的157 份ARV 陽性樣品進行σC基因分析，發(fā)現(xiàn)6 種基因型在我國均有流行，與國內(nèi)此前的研究[4，9，11-12]結(jié)論一致。本次研究還系統(tǒng)分析了國內(nèi)部分省份的不同ARV 基因型占比，發(fā)現(xiàn)基因1 型、2 型、5 型占比較高。其中，基因1 型分屬于2 個不同的分支，兩分支同源性僅為73.9%～76.7%，說明我國存在基因1 型變異毒株。從以上分析結(jié)果來看，我國流行的ARV 基因型較為復(fù)雜。從送檢樣品的上游種雞群免疫背景來看，大多免疫過經(jīng)典ARV 株疫苗（如S1133、2408 等），但保護效果不甚理想，說明當(dāng)前的疫苗株已不能對國內(nèi)流行的ARV 提供足夠的保護，需要進一步開展監(jiān)測，評估病毒流行及變異情況，調(diào)整免疫策略，加快新疫苗等疫病防控新技術(shù)、新產(chǎn)品研發(fā)。