林裕勝，余明興，陳長福，張 龍，江錦秀，張靖鵬，劉維巍，，劉慶華，胡奇林

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建福州 350013；2.浦城縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，福建浦城 353400；3.龍巖市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，福建龍巖 364000；4.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002）

圓圈病毒3 型（gyrovirus 3，GyV3）屬于細(xì)環(huán)病毒科（Anelloviridae）圓圈病毒屬（Gyrovirus）A 分支。該分支包括雞傳染性貧血病毒（chicken infectious anemia virus，CIAV）、人環(huán)狀病毒（human gyroviruses，HGyV）、禽環(huán)狀病毒2（avian gyrovirus 2，AGV2）、環(huán)狀病毒6（gyrovirus 6，GyV6）、環(huán)狀病毒7（gyrovirus 7，GyV7）和環(huán)狀病毒9（gyrovirus 9，GyV9）[1]。2012 年，Phan等[1]從急性胃腸炎患兒糞便中首次檢測出GyV3；2018 年，Li等[2]首次從患有典型雞傳染性腺胃炎的病雞腺胃中鑒定出GyV3。2020 年，袁世玉[3]通過雞和小鼠致病性試驗(yàn)證實(shí)：GyV3 可引起雞的傳染性腺胃炎和貧血，并且可跨種感染小鼠，引起小鼠胃腸炎和貧血；該病毒在雞群和鼠群中均呈水平傳播。

GyV3 基因組大小為2 356～2 359 bp，含有3個(gè)同向重疊的開放閱讀框架，以及衣殼蛋白基因VP1、骨架蛋白基因VP2和凋亡蛋白基因VP3，其中VP2基因大小為720 bp，編碼239 個(gè)氨基酸[1-2]。CIAV 的VP2基因編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，其較為保守，常作為分子流行病學(xué)檢測的首選基因[4]。而GyV3 與CIAV 的VP2基因編碼蛋白氨基酸序列同源性為63%左右，又同屬一個(gè)分支，為此本研究選用VP2作為目的基因進(jìn)行遺傳變異分析。2018 年GyV3 在肉雞中被鑒定出來后，2021 年在福建省龍巖市部分雞場中也檢測到了該病毒[5]。為進(jìn)一步了解GyV3 在福建省養(yǎng)雞場的流行及其VP2基因變異情況，2021 年在福州市、南平市、龍巖市等家禽養(yǎng)殖區(qū)，采集疑似腺胃炎病雞的腺胃樣品進(jìn)行GyV3 核酸檢測，并對部分陽性樣品進(jìn)行VP2基因序列分析。

1 材料與方法

1.1 材料

雞傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）、GyV3 分離株，均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所畜病室分離、鑒定及保存。EasyPure Genomic DNA Kit、pEASY?-Blunt Zero Cloning Kit，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；CataAmp High Fidelity PCR Mix，購自北京開拓思生物技術(shù)有限公司；DNA Marker，購自寶生物（北京）工程有限公司；凝膠回收試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司。2021年在福州市、南平市、龍巖市等36 個(gè)養(yǎng)雞場采集疑似腺胃炎的病雞腺胃樣品365 份。

1.2 引物設(shè)計(jì)

下載GenBank 中收錄的8 株GyV3 全基因組序列中的VP2基因，經(jīng)對比分析后選用從肉雞上分離的GyV3 SDAU-1 株（No.MG366592）VP2基因序列作為引物設(shè)計(jì)的參考基因，利用oligo 7 軟件設(shè)計(jì)1 對特異性引物（上游VP2F：ATGTCATCCGGCGGTCTAG；下游VP2R：TTACCAGGTAAGATCCCGGATG），擴(kuò)增片段大小為720 bp，委托鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成。

1.3 樣品處理

在生物安全柜中，將每份腺胃組織樣品用剪刀剪碎，按1:5 的體積比加入PBS 研磨成漿，將研磨后的勻漿于-20 ℃冷凍保存。經(jīng)凍融3 次后，5 000 r/min 離心15 min，取上清液備用。

1.4 核酸提取

按照EasyPure Genomic DNA Kit 說明書提取上清液DNA。

1.5 PCR 檢測

PCR反應(yīng)體系：CataAmp High Fidelity PCR Mix 10 μL，VP2 F/R 引物各1 μL，1.4 中提取的核酸3 μL，無菌去離子水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃，7 min。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠，125 V 電泳25 min，置于凝膠成像系統(tǒng)下觀察并保存結(jié)果。

1.6 VP2 基因克隆與序列分析

將PCR 檢測陽性的代表樣品，通過膠回收試劑盒回收目的片段，連接pEASY?-Blunt Zero Cloning Vector，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 菌株，挑取單個(gè)菌落；將經(jīng)PCR 鑒定為陽性的克隆質(zhì)粒送至福州博尚生物有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果利用MegAlign 和MEGA7.0 軟件進(jìn)行序列比對和遺傳進(jìn)化樹分析。參考毒株序列見表1。

表1 GyV3 參考毒株相關(guān)信息

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床樣品PCR 檢測

在福州市、南平市和龍巖市36 個(gè)雞場采集的365 份臨床樣品中，檢出GyV3 核酸陽性55 份，陽性檢出率為15.06%。部分臨床樣品的PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。

2.2 VP2 基因序列分析

將檢出的5 份代表性陽性樣品FJ-FZ2021（福州）、FJ-LY2021（羅源）、FJ-SH2021（上杭）、FJ-WP2021（武平）、FJ-YP2021（延平）獲得的VP2基因序列提交到GenBank（取得的登錄號分別為ON012548、ON012549、ON012550、ON012551、ON012552），通過MegAlign 軟件進(jìn)行序列同源性分析。結(jié)果顯示：5 份GyV3 陽性樣品的VP2基因均由720 個(gè)堿基組成，編碼239個(gè)氨基酸；與山東SDAU-1 株VP2基因相比存在7～12 個(gè)堿基突變（表2）。5 份GyV3 陽性樣品的VP2基因核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列相似性分別 為98.6%～99.9% 和98.3%～100%，與Group A分支中山東SDAU-1 株的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列相似性分別為98.3%～99.0%和97.5%～99.2%，與GyV3 吉林分離株（17HRB0905、17CC0711、17CC0704）的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列相似性分別為98.5%～100%和98.3%～100%，與巴西參考株（BR_DF5、GyV3）的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列相似性分別為98.5%～99.2%和97.5%～99.2%，與智利FecGy 參考株的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列相似性分別為99.2%～100%和98.3%～100%，與匈牙利G19 參考株的核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列相似性分別為86.6%～87.1%和83.5%～84.7%；與 Group A 分支中HGyV、AVG2、GyV6 參考株的核苷酸序列相似性為76.1%～77.5%，與 Group B 分支的核苷酸序列相似性為39.2%～39.7%，與 Group C 分支的核苷酸序列相似性為55.2%～57.1%（圖2）。

表2 5 份GyV3 陽性樣品VP2 基因核苷酸變異情況

3 討論

雞傳染性病毒性腺胃炎（transmissible viral proventriculitis，TVP）自1996 年在我國江蘇省報(bào)道以來，現(xiàn)已在全國廣泛流行[2]。然而TVP 的致病因素較多，目前已知IBV、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（reticuloendothelial virus，REV）、腺胃壞死病毒（chicken proventricular necrosis virus，CPNV）、傳染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）、J 亞群禽白血病病毒（avian leukosis virus subgroup J，ALV-J）、馬立克病病毒（Marek's disease virus，MDV）、CIAV、腺病毒（adenovirus，AdV）均能引起TVP[6-13]，因此想要通過疫苗免疫來預(yù)防該病的發(fā)生顯然難以實(shí)現(xiàn)。Li等[2，14]2018 年利用高通量測序方法，在傳染性腺胃炎病雞的腫大腺胃中鑒定出了GyV3，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該病毒能夠引起雞免疫抑制、貧血以及腺胃腫大等TVP 典型癥狀。然而至今還沒有任何防控手段能夠預(yù)防GyV3 感染的發(fā)生，因此只有通過流行病學(xué)監(jiān)測，及時(shí)淘汰陽性雞群，才能有效減少養(yǎng)殖企業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失。

GyV3 感染是近年來新發(fā)現(xiàn)的疫病，還未引起有關(guān)機(jī)構(gòu)和部門的足夠重視，相關(guān)流行病學(xué)資料較少。山東農(nóng)業(yè)大學(xué)成子強(qiáng)團(tuán)隊(duì)中的賈梅玉[15]對336 份患有TVP 的肉雞進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果檢出42 份GyV3 核酸陽性樣品，陽性檢出率為12.5%；陳長福[4]對龍巖市297 份病死雞組織樣品進(jìn)行了GyV3 核酸檢測，結(jié)果檢出核酸陽性樣品52 份，陽性檢出率為17.51%。本研究從36個(gè)雞場采集365 份疑似TVP 病雞的腺胃樣品進(jìn)行GyV3 核酸檢測，結(jié)果檢出陽性樣品55 份，陽性檢出率為15.06%，與陳長福[4]的研究結(jié)果相近，表明GyV3 已在福建省部分地區(qū)雞場中流行。但是以上研究僅做了病原檢測，獲得了流行病學(xué)資料，未對GyV3 相關(guān)基因進(jìn)行遺傳變異分析。

VP2作為GyV3 第二大開放閱讀框，與CIAVVP2推導(dǎo)氨基酸序列同源性為63%；VP2基因推導(dǎo)的非結(jié)構(gòu)蛋白可能作為支架蛋白或者分子伴侶，在CIAV 核酸復(fù)制和病毒裝配過程中起著十分重要的作用[16]。通過GyV3VP2序列比對分析發(fā)現(xiàn)，5份陽性樣本中的VP2基因均由720 個(gè)堿基組成，編碼239 個(gè)氨基酸，與山東SDAU-1 株VP2基因相比存在7～12 處堿基差異。5 份陽性樣本的GyV3VP2基因核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列相似性分別為98.6%～99.9%和98.3%～100%；除匈牙利G19 毒株外，與GyV3 不同宿主分離株同源性均在97.5%以上，與Group A 分支的HGyV、AVG2、GyV6 核苷酸序列相似性為76.1%～77.5%，與Group B 分支的核苷酸序列相似性為39.2%～39.7%，與Group C分支的核苷酸序列相似性為55.2%～57.1%。因此，VP2基因可作為GyV3 感染流行病學(xué)監(jiān)測的首選基因。

綜上所述，本研究證實(shí)了福建省部分地區(qū)雞養(yǎng)殖場存在GyV3 流行，其VP2基因序列基本穩(wěn)定，可作為該病毒核酸檢測的目標(biāo)基因。