李雙慶,崔書偉,武瑞臣

(1.滄州市中心醫(yī)院骨三科，河北滄州 061000;2.冀中能源峰峰集團(tuán)總醫(yī)院邯鄲院區(qū)骨四科，河北邯鄲 056000;3.邯鄲市中心醫(yī)院急診外一科，河北邯鄲 056000)

激素性股骨頭壞死主要是短期或長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素所致的代謝性疾病，臨床特征包括股骨頭結(jié)構(gòu)壞死、股骨頭塌陷、關(guān)節(jié)功能障礙等[1]。miRNA是一種非蛋白編碼小RNA分子，可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種病理生理過程[2]。有研究發(fā)現(xiàn)[3]，激素性股骨頭壞死可能是因激素作用導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)一些miRNA表達(dá)改變，調(diào)控相應(yīng)靶基因表達(dá)，對正常骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenhymal stem cells，BMSCs)成骨分化造成干擾，影響正常骨細(xì)胞修復(fù)。還有報道顯示[4]，miR-152-3p在地塞米松刺激的BMSCs中表達(dá)上調(diào)，但就其對激素性股骨頭壞死BMSCs成骨分化作用及機(jī)制尚無明確定論。本研究重點(diǎn)分析miR-152-3p對激素性股骨頭壞死BMSCs成骨分化的作用，探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 病例選擇

收集2019年1月至2020年1月滄州市中心醫(yī)院10例確診激素性股骨頭壞死并行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)患者及10例健康志愿者骨髓組織各10 mL，患者及健康志愿者平均年齡相近[(50.63±7.15)歲vs.(51.87±8.09)歲]。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(CZSZXYY20190006)，研究對象均自愿簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

LipofectamineTM3000試劑、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(賽默飛世爾科技公司)，miR-152-3p小干擾RNA(siRNA)、陰性對照NC-siRNA質(zhì)粒(美國Applied Biosystems公司)，實(shí)時熒光定量PCR(RT-PCR)試劑盒(德國Qiagen公司)，兔抗人雙特異性磷酸酶1(dual specificity phosphatase 1，DUSP1)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)、磷酸化p38 MAPK(phosphorylated-p38 MAPK，p-p38 MAPK)、胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracelluar signal-regulated kinase，ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(phosphorylated-ERK1/2，p-ERK1/2)一抗及山羊抗兔IgG二抗(美國Abcam公司)，DMIL-PH1型倒置相差顯微鏡(德國徠卡微系統(tǒng)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1BMSCs分離、培養(yǎng)及鑒定

取健康人、激素性股骨頭壞死患者骨髓組織，置于含5 mL PBS離心管，吹打混勻，制備細(xì)胞懸液。置于含1.073 g/mL淋巴細(xì)胞分離液離心管內(nèi)，2 000 r/min離心30 min，離心半徑8 cm，收集白膜層單個核細(xì)胞，置于含10%胎牛血清、低糖型DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞密度5×103/cm2。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔3 d更換1次培養(yǎng)液。觀察細(xì)胞生長融合率≥80%，培養(yǎng)瓶內(nèi)加含0.25%胰蛋白、0.02% EDTA的細(xì)胞消化液1 mL，1∶2傳代比例轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)取第3代細(xì)胞，鏡下觀察BMSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)。

1.3.2RT-PCR檢測健康人與激素性股骨頭壞死患者BMSCs中miR-152-3p、DUSP1 mRNA表達(dá)

取健康人、激素性股骨頭壞死患者對數(shù)生長期BMSCs，Trizol法提取總RNA，純化，逆轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)鏈cDNA。反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex TaqTM12.5 μL，cDNA模版2 μL，上下游引物各1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性5 s；60 ℃退火延伸20 s，40個循環(huán)。引物設(shè)計(jì)：miR-152-3p：上游引物5′-TCG TCG AAG TGT TTC AGC A-3′，下游引物5′-TGG CAC CTC TCA AGC GTC A-3′。DUSP1：上游引物5′-GAA CTT CAG TGT TCG TGC A-3′，下游引物5′-CTC GCA CTG TCC GTC AAG A-3′。GAPDH：上游引物5′-AAT CAC TAC GTC CAC TTC T-3′，下游引物5′-CTG GTT GTC ATC ACA CTC G-3′。凝膠電泳，觀察電泳條帶，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算miR-152-3p、DUSP1 mRNA相對表達(dá)情況(2-ΔΔCT)。

1.3.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

取人激素性股骨頭壞死對數(shù)生長期BMSCs，以含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)70%時，根據(jù)LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染。以轉(zhuǎn)染miR-152-3p-siRNA細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染NC-siRNA質(zhì)粒細(xì)胞作為對照組，未經(jīng)任何處理BMSCs為空白組。轉(zhuǎn)染48 h后，經(jīng)倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率(發(fā)綠色熒光細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%)，重復(fù)5次，取平均值。

1.3.4轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞miR-152-3p mRNA表達(dá)

取1.3.3 中細(xì)胞，接種于96孔板，各組設(shè)5個復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后，以Trizol法提取總RNA，按照1.3.2步驟進(jìn)行RT-PCR檢測，反應(yīng)體系、反應(yīng)條件、引物設(shè)計(jì)保持一致，計(jì)算miR-152-3p mRNA相對表達(dá)水平(2-ΔΔCT)。

1.3.5成骨分化能力評估

取1.3.3中細(xì)胞，接種于96孔板，細(xì)胞密度2×104/cm2。細(xì)胞生長至70%～80%，將培養(yǎng)液更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。每隔2 d更換1次培養(yǎng)液。誘導(dǎo)后第12天，RT-PCR檢測成骨表型標(biāo)志基因堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)mRNA相對表達(dá)水平，評估成骨分化能力。

1.3.6miR-152-3p與DUSP1的靶向關(guān)系驗(yàn)證

利用生物信息學(xué)軟件TargetScan初步預(yù)測miR-152-3p與DUSP1 3′UTR的結(jié)合位點(diǎn)。含miRNA可能結(jié)合位點(diǎn)的DUSP1 mRNA的3′UTR質(zhì)粒由上海生工生物工程股份有限公司合成并鑒定，轉(zhuǎn)染前24 h，取對數(shù)生長期BMSCs，在96孔板內(nèi)接種。觀察細(xì)胞生長至70%，將DUSP1 mRNA 3′UTR野生型和突變型熒光素酶報告質(zhì)粒與內(nèi)參海腎熒光素酶質(zhì)粒pRLTK轉(zhuǎn)染至空白組、轉(zhuǎn)染組、對照組，孵育48 h。檢測熒光素酶強(qiáng)度，計(jì)算相對熒光素酶活性(螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性)。

1.3.7DUSP1、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/ERK1、p-ERK2/ERK2蛋白表達(dá)

取1.3.3中細(xì)胞，PBS清洗2次，冰上裂解。4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，離心半徑8 cm，取上清液。二奎啉甲酸法行蛋白定量，加上樣緩沖液，沸水浴10 min，變性。凝膠電泳，分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，加5%脫脂奶粉封閉1 h。加DUSP1、p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-ERK1、ERK1、p-ERK2、ERK2一抗(1∶1 000)，4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗膜4次，每次10 min。加二抗(1∶2 500)，室溫孵育2 h。TBST洗膜4次，每次10 min。加ECL試劑，顯影曝光。以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值比值表示目的蛋白相對表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)

BMSCs呈長梭形，表現(xiàn)為典型成纖維細(xì)胞生長；培養(yǎng)第8～10天，細(xì)胞生長達(dá)80%以上，見圖1。

圖1 BMSCs細(xì)胞形態(tài)(×200)

2.2 不同研究對象BMSCs中miR-152-3p、DUSP1 mRNA表達(dá)比較

與健康人比較，激素性股骨頭壞死患者BMSCs中miR-152-3p mRNA表達(dá)升高，DUSP1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組miR-152-3p、DUSP1 mRNA表達(dá)比較

2.3 轉(zhuǎn)染效率

鏡下觀察顯示，轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染效率91.12%，對照組轉(zhuǎn)染效率89.45%，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖2。

圖2 BMSCs轉(zhuǎn)染后顯微鏡下綠色熒光情況(×200)

2.4 各組細(xì)胞miR-152-3p mRNA表達(dá)比較

轉(zhuǎn)染組miR-152-3p mRNA表達(dá)(0.48±0.17)與空白組(1.12±0.18)、對照組(1.13±0.21)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組miR-152-3p mRNA表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 各組細(xì)胞ALP、BMP-2 mRNA表達(dá)比較

各組ALP、BMP-2 mRNA表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白組、對照組比較，轉(zhuǎn)染組ALP、BMP-2 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)；空白組與對照組ALP、BMP-2 mRNA表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組ALP、BMP-2 mRNA表達(dá)比較

2.6 驗(yàn)證結(jié)果

TargetScan軟件分析發(fā)現(xiàn)，DUSP1 3′UTR含有miR-152-3p的結(jié)合位點(diǎn)，見圖3。各組DUSP1 mRNA 3′UTR野生型熒光素酶報告質(zhì)粒相對活性值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各組DUSP1 mRNA 3′UTR突變型熒光素酶報告質(zhì)粒相對活性值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對照組和空白組比較，轉(zhuǎn)染組DUSP1 mRNA 3′UTR野生型熒光素酶報告質(zhì)粒相對活性值下降(P<0.001)；對照組與空白組DUSP1 mRNA 3′UTR野生型熒光素酶報告質(zhì)粒相對活性值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 miR-152-3p與DUSP1 3′UTR的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果

2.7 各組細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)比較

各組DUSP1、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/ERK1、p-ERK2/ERK2蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白組、對照組比較，轉(zhuǎn)染組DUSP1蛋白表達(dá)升高，p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/ERK1、p-ERK2/ERK2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；空白組和對照組DUSP1、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/ERK1、p-ERK2/ERK2蛋白表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4、表4。

表4 各組相關(guān)蛋白表達(dá)比較

圖4 各組相關(guān)蛋白蛋白印跡圖

3 討 論

激素性股骨頭壞死為臨床常見病、多發(fā)病，其發(fā)生、發(fā)展與激素應(yīng)用劑量、療程密切相關(guān)，目前尚無特效治療方法[5]。BMSCs是一種多能干細(xì)胞，其自我更新及分化潛能在多種組織修復(fù)重建中發(fā)揮重要作用[6]。在較多非創(chuàng)傷性股骨頭壞死發(fā)生中，股骨骨髓內(nèi)BMSCs成骨分化能力改變發(fā)揮一定作用，逐漸引起廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)[7]，糖皮質(zhì)激素大劑量應(yīng)用可能引發(fā)BMSCs增殖、成骨能力減弱，但機(jī)制尚不明確。還有報道顯示[8]，激素性股骨頭壞死患者存在BMSCs功能丟失現(xiàn)象，其近端BMSCs增殖能力較股骨頸骨折患者低。因此，臨床研究影響激素性股骨頭壞死患者BMSCs成骨轉(zhuǎn)化的指標(biāo)，以探尋新的診斷和治療靶點(diǎn)，改善患者治療效果，提升生命質(zhì)量，具有重要意義。

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，可經(jīng)結(jié)合靶向mRNA 3′UTR，降解mRNA轉(zhuǎn)錄或翻譯，改變mRNA調(diào)控細(xì)胞信號通路，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、侵襲、凋亡等過程。有報道顯示[9]，在BMSCs增殖、分化、遷移等細(xì)胞生物學(xué)功能中，miRNA發(fā)揮一定作用，且有多種miRNA參與調(diào)控BMSCs成骨分化。miR-152-3p為miRNA家族成員之一，被證實(shí)可參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程，促進(jìn)成骨分化，在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生中有一定作用，但就miR-152-3p對激素性股骨頭壞死患者BMSCs分化影響尚無明確定論[10]。本研究結(jié)果顯示，激素性股骨頭壞死患者BMSCs中存在miR-152-3p高表達(dá)，且轉(zhuǎn)染組ALP、BMP-2 mRNA表達(dá)升高，提示低表達(dá)miR-152-3p可促進(jìn)激素性股骨頭壞死BMSCs成骨分化。

哺乳動物細(xì)胞中氧化應(yīng)激、生長因子可促使多種信號通路被激活，MAPK信號通路便是其中之一。研究發(fā)現(xiàn)[11]，MAPK通路參與細(xì)胞增殖、凋亡、生長、分化等多種病理生理過程，其持續(xù)激活可引發(fā)細(xì)胞過度增殖或細(xì)胞非程序性死亡。DUSP1為雙特異性蛋白磷酸酶家族成員之一，廣泛存在于人體細(xì)胞內(nèi)，可調(diào)控細(xì)胞生長、分化、凋亡及腫瘤形成過程。DUSP1屬于MAPK特異性抑制劑，能抑制MAPK信號通路，減輕炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞[12]。有報道顯示[13]，MAPK信號通路激活可引發(fā)DUSP1 gDNA染色質(zhì)重構(gòu)，誘導(dǎo)DUSP1轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞分化過程。但目前就DUSP1在激素性股骨頭壞死BMSCs中表達(dá)研究較少，且就miR-152-3p是否通過調(diào)控DUSP1表達(dá)影響B(tài)MSCs分化、機(jī)制如何尚未可知。本研究發(fā)現(xiàn)，激素性股骨頭壞死患者BMSCs中不僅存在miR-152-3p高表達(dá)，還存在DUSP1低表達(dá)。TargetScan軟件分析發(fā)現(xiàn)DUSP1 3′UTR含有miR-152-3p的結(jié)合位點(diǎn)，熒光素酶強(qiáng)度顯示miR-152-3p與DUSP1之間呈靶向關(guān)系，提示miR-152-3p可靶向作用于DUSP1。另外，轉(zhuǎn)染組DUSP1蛋白表達(dá)升高，p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-ERK1/ERK1、p-ERK2/ERK2蛋白表達(dá)降低，提示低表達(dá)miR-152-3p可靶向調(diào)控DUSP1表達(dá)，抑制MAPK信號通路，推測這是低表達(dá)miR-152-3p發(fā)揮促進(jìn)激素性股骨頭壞死BMSCs成骨分化作用的重要機(jī)制之一。但本研究未分析阻斷DUSP1表達(dá)是否可產(chǎn)生相反作用，今后仍需就該問題進(jìn)行深入研究。

綜上所述，低表達(dá)miR-152-3p可促進(jìn)激素性股骨頭壞死BMSCs成骨分化，作用機(jī)制可能與調(diào)控DUSP1表達(dá)，抑制MAPK信號通路有關(guān)。本研究未就其他通路進(jìn)行分析，而低表達(dá)miR-152-3p發(fā)揮作用是經(jīng)多種途徑進(jìn)行的，今后仍需進(jìn)一步深入分析。