劉文文 楊巍

[摘要]目的：觀察脈沖電磁場刺激對新型低彈多孔鈦合金支架表面的成骨效應。方法：使用3D打印技術(shù)制備多孔鈦合金（Ti-24Nb-4Zr-8Sn，Ti2448）支架，并使用掃描電鏡對支架的表面形貌進行觀察;將成骨細胞接種于支架表面，給予脈沖電磁場刺激的支架為實驗（PMEF）組，不給予脈沖電磁場刺激的支架為對照組;使用CCK-8（Cell Counting Kit-8）試劑盒檢測兩組細胞的增殖能力;使用活/死細胞染色觀察兩組細胞在支架上的活性;使用掃描電鏡觀察兩組細胞在支架上的形態(tài);通過實時定量PCR觀察兩組細胞相關(guān)成骨基因分化;通過兔股骨外側(cè)髁缺損模型進行體內(nèi)骨長入分析，分別使用熒光標記和Van Gieson染色觀察兩組支架的骨長入情況。結(jié)果：使用3D打印技術(shù)成功制備實驗所需的多孔鈦合金支架;PMEF組成骨細胞的增殖能力、細胞活性明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;PMEF組成骨細胞可見明顯細胞偽足，細胞狀態(tài)良好;PMEF組成骨細胞的成骨相關(guān)基因表達明顯高于對照組（P<0.05）;術(shù)后4周和12周，PMEF組新生骨沉積速率（兩種熒光間距）均高于對照組（P<0.05），Van Gieson染色發(fā)現(xiàn)PMEF組骨長入明顯多于對照組（P<0.05）。結(jié)論：脈沖電磁場刺激和多孔Ti2448植入物的組合可為骨科、口腔和整形等領(lǐng)域的骨修復重建提供一種新方法和新思路。

[關(guān)鍵詞]鈦合金;脈沖電磁場;多孔材料;骨整合;成骨

Abstract： Objective? Observe the osteogenic effect of PEMF stimulation on the surface of the new low-elasticity porous titanium alloy scaffold. Methods? The new low-elasticity porous titanium alloy （Ti-24Nb-4Zr-8Sn， Ti2448） scaffolds were prepared by 3D printing technology. The surface morphology of the scaffolds were characterized by scanning electron microscopy （SEM）. The osteoblast-like cell line MC3T3-E1 was cultured in the absence （control） or presence of PEMF stimulation on porous Ti2448 disc surface， and the adhesion and proliferation of the cells were investigated by SEM， live/dead cell imaging kit and CCK-8 assay. Furthermore， the expression of osteogenesis-related genes was also examined by quantitative real-time PCR. The porous Ti2448 scaffolds for animal experiment were implanted into the lateral femoral epicondyle of female New Zealand white rabbits. All of the 24 rabbits were then randomly divided equally into two groups， one group with PEMF stimulation for 2 h everyday and the other with no stimulation as control. After 4 weeks and 12 weeks， fluorescent markers and Van Gieson staining were used to observe the bone ingrowth of the two groups of scaffolds. Results? The porous titanium alloy scaffolds required for the experiment were successfully prepared. The proliferation ability and cell activity of MC3T3-E1 in PMEF group were significantly higher than those in control group （P<0.05）. The cells in the PMEF group showed obvious cell pseudopodia， the osteoblast-related genes expression of cells in PMEF group were significantly higher than that in control group （P<0.05）. At 4 and 12 weeks after surgery， the rate of new bone deposition （two types of fluorescence spacing） in the PMEF group was higher than that in the control group （P<0.05）. Van Gieson staining showed that the bone growth in the PMEF group was significantly more than that in the control group （P<0.05）. Conclusion? The combination of PMEF and porous Ti2448 implant can provide a new idea for bone repair and reconstruction in the fields of orthopedics， oral cavity and plastic surgery.

Key words： titanium alloy; pulsed electromagnetic field; porous material; osseointegration; osteogenesis

多孔鈦合金與實體鈦合金相比能夠明顯改善植入物的骨整合，是近年金屬植入物研究熱點[1-3]。但是多孔鈦合金（Ti6Al4V）孔隙結(jié)構(gòu)內(nèi)部骨長入不是十分理想，特別是體積較大多孔材料的中心骨長入較少[4-5]。而多孔Ti6Al4V材料骨長入不佳的可能原因為：①多孔結(jié)構(gòu)的采用僅能降低鈦合金部件表觀彈性模量，而材料本身力學性能沒有實質(zhì)變化，與骨組織微觀力學性能不匹配的問題依然存在[6];②正常骨組織具有壓電效應，其力與電轉(zhuǎn)換特性可將外界應力刺激轉(zhuǎn)換為內(nèi)部電磁信號，電信號對于骨修復與改建至關(guān)重要，而植入部位由于正常骨組織的缺失，無法產(chǎn)生骨修復所需的相應電磁信號[7-8]。為解決上述問題，本研究采用3D打印技術(shù)，以新型低彈性模量Ti-24Nb-4Zr-7.9Sn（Ti2448）合金粉末制備新型低彈性模量多孔鈦合金[9];同時，引入外源性脈沖電磁場（Pulsed electromagnetic fields，PEMF）進行干預，模擬正常骨組織產(chǎn)生的內(nèi)源性電磁信號。本研究通過細胞學實驗和動物骨缺損模型對PEMF促進多孔Ti2448合金材料內(nèi)部的成骨效應進行觀察，旨在為骨科、口腔和整形等領(lǐng)域的骨修復重建提供一種新方法和新思路。

1? 材料和方法

1.1 多孔Ti2448植入物的制備及表征：使用3D打印的電子束熔融技術(shù)（Electron beam melting，EBM）制備實驗所需的多孔Ti2448支架，其中體外實驗為直徑10mm，高3mm的多孔圓盤，體內(nèi)實驗為直徑6mm，高10mm的多孔圓柱體。本研究所用支架由沈陽金屬研究所制備。使用掃描電鏡（FE-SEM;S-4800，Hitachi，Japan）觀察支架表面形貌及其表面元素。使用Qualitative micro-computed tomography （Micro-CT）（Y. Cheetah，YXLON，Germany）對材料的孔隙結(jié)構(gòu)進行檢測。所有支架使用之前在121℃（103.4kPa）環(huán)境下進行高溫高壓滅菌。

1.2 細胞培養(yǎng)：成骨細胞（MC3T3-E1）在加有10%胎牛血清（Gibco）和抗生素（青霉素100U/ml，鏈霉素100U/ml，Sigma）的α-MEM（Hyclone）培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為含5% CO2的37℃溫箱。

1.3 脈沖電磁場（PEMF）刺激系統(tǒng)：PEMF刺激系統(tǒng)由一個PEMF發(fā)生器和兩個螺線管組成，他們以5cm的間隔放置在一條線上。將一個包含帶有MC3T3-E1細胞的Ti2448圓盤的24孔培養(yǎng)板放置在兩個螺線管之間。將螺線管連接到PEMF發(fā)生器（中國西安，F(xiàn)MMU，GHY-Ⅲ;中國專利號ZL02224739.4），以產(chǎn)生特定的開路輸出波形PEMF，已證明對成骨有積極作用[10]。使用高斯計（455 DSP高斯計，美國Lake Shore Cryotronics型號）將螺線管兩端的峰-峰磁場確定為20高斯。在對照組中，將培養(yǎng)板也放置在相同的螺線管之間，但沒有輸出波形。將PEMF組和對照組每天放置在螺線管之間2h。

1.4 CCK-8檢測細胞增殖能力：將1ml等分試樣的MC3T3-E1細胞懸液（1×105個細胞）接種到24孔培養(yǎng)板中的每個多孔Ti2448圓盤上。12h后，將圓盤用PBS洗滌3次，然后轉(zhuǎn)移至每個孔中含1ml培養(yǎng)基的新培養(yǎng)板中。PEMF刺激1、4或7d后，按照Cell Counting Kit-8（CCK-8，Dojindo）的說明評估細胞增殖水平。使用分光光度計（Labsystems Dragon Wellscan Mk3）測量450nm處的吸光度。

1.5 活/死細胞染色檢測細胞活性：激光共聚焦掃描顯微鏡（Confocal laser scanning microscopy，CLSM;Olympus Fluo View FV-1000）用于檢查接種在多孔Ti2448光盤表面上的MC3T3-E1細胞的活力。在PEMF刺激48h后，按照說明（綠色熒光為活細胞;紅色熒光為死細胞;Life Technologies），用活/死細胞成像試劑盒對細胞染色，并使用CLSM成像。

1.6 掃描電鏡觀察細胞形態(tài)：將1ml細胞懸液的等分試樣以1×105細胞/ml的密度接種到多孔Ti2448圓盤上。48h后，將圓盤用PBS輕輕清洗3次，然后在4℃的1ml 2.5%戊二醛溶液中固定過夜。將圓盤用PBS沖洗3次，并在一系列乙醇洗滌中脫水。將所有樣品進行干燥，涂鉑，并通過掃描電鏡（Hitachi S-4800）進行觀察。

1.7 成骨相關(guān)基因表達：使用實時PCR評估成骨相關(guān)基因的表達水平。將細胞以每孔1×105個細胞接種。培養(yǎng)4或7d后，使用Trizol試劑（TaKaRa）分離總RNA。使用PrimeScript RT試劑盒（TaKaRa）將每個樣品的RNA反轉(zhuǎn)錄為互補DNA（cDNA）。使用實時熒光定量PCR（Bio-Rad CFX96實時系統(tǒng)）和SYBR Premix Ex TaqⅡ定量檢測成骨相關(guān)基因ALP（alkaline phosphatase），Col-1（type 1 collagen），OCN（osteocalcin），OPN（osteopontin），Runx2（runt-related transcription factor 2）和BMP-2（bone morphogenetic protein-2）的表達水平。表1列出了靶基因的引物。將β-actin基因表達作為參照。

1.8 兔股骨外側(cè)髁缺損模型的建立：將24只新西蘭白兔（3±0.5）kg隨機分為兩組，麻醉并暴露股骨外側(cè)髁。制作直徑6mm，高10mm的圓柱形缺陷，并隨機植入Ti2448支架。每天將PEMF組暴露于PEMF刺激下2h，將對照組也置于未通電的線圈中而不暴露于PEMF。

1.9 順序熒光染料標記：在處死動物前14d，肌肉注射四環(huán)素（50mg/kg），連續(xù)2d，1次/d;取材前2d，肌注鈣黃綠素（8mg/kg）。

1.10 定量組織學分析：在第4周和12周通過耳靜脈空氣栓塞處死實驗兔，并分離雙側(cè)股骨。在制備組織切片前，將樣品固定2周（75%乙醇）。準備組織切片，并使用共聚焦激光掃描顯微鏡獲得熒光色素標記圖像，Image-Pro Plus 6.0軟件用于定量分析新骨組織。同時，進行Van Gieson染色。檢查所有染色的切片，并獲得圖像。使用image-Pro Plus 6.0軟件計算新形成的骨骼的體積分數(shù)（骨骼體積/支架的總體積，BV/TV）并進行統(tǒng)計比較。

1.11 統(tǒng)計學分析：使用SPSS 20.0軟件分析數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析，再進行兩次樣本t檢驗，確定顯著性水平。結(jié)果以（x?±s）表示。P<0.05被認為有顯著差異，P<0.01被認為有高度顯著差異。

2? 結(jié)果

2.1 材料表面掃描電鏡結(jié)果：通過掃描電鏡檢查多孔Ti2448圓盤的表面形態(tài)。由于金屬粉末顆粒部分熔化到多孔Ti2448圓盤的支桿上，因此在支架上觀察到一個粗糙的表面（見圖1A～B）。對三個隨機選擇區(qū)域的表面進行能譜分析發(fā)現(xiàn)，Ti2448支架由Ti，Nb，Zr和Sn組成（見圖1E和表2）。從體外及體內(nèi)實驗用的支架大體觀可以發(fā)現(xiàn)，Ti2448支架呈金黃色，具有明顯開放孔徑結(jié)構(gòu)（見圖1C～D）。支架的孔徑大小為（710±42）μm，孔隙率為（68±5.3）%。

2.2 兩組細胞增殖能力比較：如圖2所示，在培養(yǎng)1d后，在PEMF組和對照組間細胞粘附和增殖能力比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。然而，在第4天和第7天，PEMF組的細胞數(shù)量顯著高于對照組，PEMF組的吸光度分別較對照組高144%和126%（P<0.01）。

2.3 兩組細胞活性比較：在對照組和PEMF組中，大多數(shù)具有綠色熒光（活細胞）的細胞都具有成骨細胞樣的形狀，并且延伸良好。在綠色細胞中檢測到紅色熒光的偶發(fā)斑點，代表死亡細胞。與對照組相比（見圖3A～B），PEMF組觀察到綠色熒光的細胞更多，紅色熒光的細胞更少，且PEMF組中形成了更多的細胞簇（見圖3C～D）。

2.4 兩組細胞形態(tài)比較：使用掃描電鏡觀察支架表面細胞形態(tài)。在低倍視野下，對照組（見圖4A）支架表面細胞數(shù)量明顯少于PEMF組（見圖4C），且PEMF組支架表面細胞形成了明顯的細胞簇。在高倍視野下，對照組（見圖4B）細胞伸展狀態(tài)明顯較PEMF組（見圖4D）差，且PEMF組細胞偽足更明顯，更具有成骨樣細胞的典型形態(tài)。

2.5 成骨相關(guān)基因表達：圖5顯示了成骨相關(guān)基因的表達水平，包括ALP，Col-1，OCN，OPN，Runx2和BMP-2。PEMF刺激通常會上調(diào)所有目標基因的mRNA水平。在第4天，對照組和PEMF組ALP和BMP-2的表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但PEMF組的Col-1，OCN，OPN和Runx2 的mRNA的表達較對照組分別上調(diào)了1.3倍，3.3倍，1.7倍和1.4倍。在第7天，PEMF刺激后，ALP，Col-1，OCN，Runx2和BMP-2分別上調(diào)了4.2倍，1.9倍，2.0倍，1.3倍和4.0倍， 而對照組和PEMF組之間的OPN表達比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.6 順序熒光染料標記分析：熒光標記結(jié)果示如圖6（100×）所示。在顯微鏡下，材料周圍的新骨頭在同一時間點以線性排列沉積。術(shù)后4周，PEMF組（見圖6B）中多孔Ti2448周圍四環(huán)素標記的（黃色熒光）新骨與鈣黃綠素標記的（綠色熒光）新骨之間的間隔（45.37±6.29）μm大于對照組的（24.12±3.08）μm的間隔（見圖6A），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;術(shù)后第12周，PEMF組（見圖6D）材料周圍熒光雙標記新骨沉積的距離為（66.18±5.97）μm，也高于對照組[（41.45±4.25）μm，P<0.05，見圖6C]，見圖6E。

2.7 兩組支架的Van Gieson染色分析結(jié)果：Van Gieson 染色結(jié)果如圖7（10×）所示，可以發(fā)現(xiàn)新形成的骨（紅色）直接從骨骼缺損的邊界向支架內(nèi)部發(fā)散。術(shù)后4周，對照組（見圖7A）和PEMF組（見圖7B）中的多孔Ti2448材料被新的骨骼組織包圍，新骨與材料之間存在明顯的間隙。在對照組中，只有少量不規(guī)則的新骨在多孔材料邊緣形成，而PEMF組在材料邊緣的中有更多的新骨，兩組材料孔隙內(nèi)部均為出現(xiàn)明顯的新生骨。術(shù)后12周，兩組多孔材料的新骨形成明顯更多。與對照組（見圖7C）相比，PEMF組（見圖7D）有更多的骨進入材料內(nèi)部。對照組中材料與新骨之間仍然存在很小的間隙。在PEMF組中，新骨和材料緊密結(jié)合，并且骨整合良好。進一步對骨體積分數(shù)進行對比發(fā)現(xiàn)，在4周和12周PEMF組的骨體積分數(shù)均明顯大于對照組（P<0.05，見圖7E）。

3? 討論

多孔鈦合金因其在較好保留鈦合金機械強度的同時具有更低的彈性模量和多孔特性，從而成為骨修復重建領(lǐng)域的優(yōu)勢材料[1]。隨著金屬3D打印技術(shù)的出現(xiàn)，不僅可以實現(xiàn)多孔鈦合金材料的精確空間構(gòu)型設計與制造，同時可以制備出仿真的個性化金屬骨骼，達到骨缺損精準修復重建的目的，由此具有極為良好的應用前景。近年來，國內(nèi)外先后研發(fā)出可應用于不用部位的多孔鈦合金植入修復體并成功應用于臨床。例如，國內(nèi)張慶福等[3]采用EBM技術(shù)制備個體化3D打印多孔鈦合金下頜骨修復體實現(xiàn)了下頜骨缺損的精確重建，獲得了滿意的外形和功能恢復效果。有學者[11]將EBM技術(shù)制備的3D打印多孔鈦合金人工椎體應用于脊柱腫瘤切除后骨缺損修復，術(shù)后脊柱外形與功能得到良好重建。盡管多孔鈦合金植入物取得了較好的早期臨床效果，但是對于多孔鈦合金內(nèi)部骨形成不良和應力遮擋導致骨吸收的問題仍然是目前多孔鈦合金臨床應用亟待解決的問題。

多孔結(jié)構(gòu)只是降低了鈦合金材料的整體表觀彈性模量，鈦合金材料本身較高彈性模量并未得到實質(zhì)改善，導致多孔鈦合金內(nèi)部孔隙之間依然存在應力遮擋效應，孔隙的應力依然由彈性模量高的金屬小梁承受，引發(fā)的應力遮擋效應可以導致多孔材料內(nèi)部骨吸收，影響材料內(nèi)部骨整合，發(fā)生植入體松動[12]。因此，研發(fā)新型低彈鈦合金，獲得與人體組織更佳的力學匹配，一直是鈦合金材料研發(fā)的熱點。本研究采用的一種新型Ti2448合金，彈性模量僅42GPa，遠低于目前臨床常用Ti6Al4V合金的彈性模量（110GPa），經(jīng)動物實驗證實該新型低彈鈦合金材料與傳統(tǒng)Ti6Al4V合金相比能夠顯著減輕應力遮擋效應導致的骨吸收[13]。本研究以Ti2448合金為原材料，采用EBM技術(shù)進行3D打印制備，從而使多孔鈦合金材料力學性能更好的匹配天然骨組織。當前對于支架的物理參數(shù)，如孔隙率、孔徑大小以及孔徑結(jié)構(gòu)仍然沒有統(tǒng)一的標準，這還需要在下一步的科研中進行優(yōu)化。根據(jù)當前研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，隨著孔隙率及孔徑尺寸的增加，可長入材料內(nèi)部的骨與血管的量會增加，但這會降低材料的力學強度，且過于開放的孔徑結(jié)構(gòu)不利于骨組織在材料支架上結(jié)合;同時如果孔隙率及孔徑尺寸過小，雖然對維持材料的力學強度有明顯優(yōu)勢，但是過小的孔徑會使得細胞或骨組織在材料內(nèi)部的遷移變得困難。綜合當前的研究結(jié)果認為孔徑400～1 200μm可以確?？紫秲?nèi)部細胞保持足夠活力[14-15]。本研究制備的支架材料孔徑為（710±42）μm，對于促進骨組織向材料內(nèi)部長入具有較好的優(yōu)勢。

天然骨組織可以通過機械應力改變產(chǎn)生電磁場，而此種微電磁環(huán)境對于骨修復和重塑的調(diào)控至關(guān)重要[16]。然而，由于各種原因造成的骨缺損會導致上述微電磁環(huán)境的缺失，這會使得植入物材料的成骨作用和骨整合不令人滿意。因此有學者提出，在使用骨植入物時，應充分考慮模仿骨骼的微電磁特征[17]。根據(jù)之前的發(fā)現(xiàn)，PEMF刺激是實現(xiàn)此目的的一種有價值的方法[18]。自從Bassett于1974年發(fā)表報告稱PEMF對骨不連骨折的有益作用以來[19]，PEMF在骨科的可能的用法和潛在機制中引起了極大的關(guān)注。許多研究表明，PEMF促進骨組織修復的作用主要是通過增加成骨細胞的活性，抑制骨重塑的吸收相，刺激鈣化和增加血液供應來完成的。還有研究表明，PEMF對成骨細胞的粘附，增殖，分化和轉(zhuǎn)錄具有明顯的促進作用。但是，PEMF對多孔鈦合金支架骨形成的作用的研究未見報道。

Ti2448作為一種新開發(fā)的植入材料，應首先考慮其生物相容性。在本研究中，使用活/死細胞成像試劑盒直接確定了Ti2448支架上的細胞的活力。對照組和PEMF組中的大多數(shù)細胞均存活。SEM圖像進一步表明，Ti2448支架表面上的細胞看起來很健康，并具有良好的細胞延伸性。以上所有結(jié)果表明，Ti2448合金具有高生物相容性和極低的細胞毒性。為進一步提高Ti2448植入物表面的成骨能力，使用PEMF對Ti2448支架表面細胞進行刺激。研究發(fā)現(xiàn)成骨相關(guān)基因在PEMF刺激下普遍的到了上調(diào)，同時PEMF也增加了Ti2448支架表面成骨細胞的增殖能力。隨后又通過體內(nèi)實驗進一步證實這兩種組合的骨再生效果。熒光標記和Van Gieson染色結(jié)果均證實，PEMF刺激可起到更好的骨整合和成骨作用。

綜上，本研究結(jié)果為多孔Ti2448合金植入材料的臨床應用提供了實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)，并有望為骨科、口腔和整形等領(lǐng)域骨缺損的修復重建提供一種新方法。最后，盡管本研究在體外和體內(nèi)均證實了PEMF對多孔鈦合金支架具有良好的促骨形成作用，但研究中仍尚有不足之處，例如PEMF刺激的參數(shù)優(yōu)化以及PEMF促進多孔鈦合金支架內(nèi)部骨形成的機制等方面尚需下一步深入研究加以揭示。

[參考文獻]

[1]Ottria L，Lauritano D，Bassi MA，et al. Mechanical， chemical and biological aspects of titanium and titanium alloys in implant dentistry[J].J Bio Reg Homeos Ag，2018，32（2）：81-89.

[2]Yin B，Xue B，Wu Z，et al.A novel hybrid 3D-printed titanium scaffold for osteogenesis in a rabbit calvarial defect model[J].Am J Transl Res，2018，10（2）：474-482.

[3]張慶福，劉剛，劉國勤，等.個體化3D打印鈦合金下頜骨植入體的設計制作與臨床應用[J].口腔醫(yī)學研究，2015，31（1）：48-51.

[4]Gao R，Ji W，Xia T，et al.Three-dimensional-printed titanium alloy porous scaffold combined with trans-cinnamaldehyde for repairing osteonecrosis of the femoral head in a dog model[J].Am J Transl Res，2020，12（3）：1070-1079.

[5]Hu J，Zhong X，F(xiàn)u X，et al.Enhanced bone remodeling effects of low-modulus Ti-5Zr-3Sn-5Mo-25Nb Alloy Implanted in the mandible of beagle dogs under delayed loading[J].ACS Omega，2019，4（20）：18653-18662.

[6]Zhao S，Li SJ，Hou WT，et al.Microstructure and mechanical properties of open cellular Ti-6Al-4V prototypes fabricated by electron beam melting for biomedical applications[J].Materials Technology，2016，31（2）：98-107.

[7]Tandon B，Blaker JJ，Cartmell SH.Piezoelectric materials as stimulatory biomedical materials and scaffolds for bone repair[J].Acta Biomaterialia，2018，73（4）：1-20.

[8]Bai Y，Dai X，Yin Y，et al.Biomimetic piezoelectric nanocomposite membranes synergistically enhance osteogenesis of deproteinized bovine bone grafts[J].Int J Nanomedicine，2019，30（14）：3015-3026.

[9]Hao YL，Li SJ，Sun SY，et al.Elastic deformation behaviour of Ti-24Nb-4Zr-7.9Sn for biomedical applications[J].Acta Biomaterialia，2007，3（2）：277-286.

[10]Ferroni L，Gardin C，Dolkart O，et al.Pulsed electromagnetic felds increase osteogenetic commitment of MSCs via the mTOR pathway in TNF-α mediated infammatory conditions： an in-vitro study[J].Scientific Reports，2018，8（1）：5108-5123.

[11]Xu N，Wei F，Liu X，et al.Reconstruction of the upper cervical spine using a personalized 3D-printed vertebral body in an adolescent with ewing sarcoma[J].Spine（Phila Pa 1976），2016，41（1）：E50-54.

[12]Li Y，Yang W，Li X，et al.Improving osteointegration and osteogenesis of three-dimensional porous Ti6Al4V scaffolds by polydopamine-assisted biomimetic hydroxyapatite coating[J].Acs Applied Materials Interfaces，2015，7（10）：5715-5724.

[13]Shi L，Shi L，Wang L，et al.The improved biological performance of a novel low elastic modulus implant[J].PLoS One，2013，8（2）：e55015.

[14]Johan VDS ，Wang H，Amin Yavari S，et al.Enhanced bone regeneration of cortical segmental bone defects using porous titanium scaffolds incorporated with colloidal gelatin gels for time-and dose-controlled delivery of dual growth factors[J].Tissue Engineering Part A，2013，19（23-24）：2605-2614.

[15]Habibovic P，Kruyt MC，Juhl MV，et al.Comparative in vivo study of six hydroxyapatite-based bone graft substitutes[J].J Orthop Res，2008，26（10）：1363-1370.

[16]Lu ZF，Roohani-Esfahani SI，Wang G，et al.Bone biomimetic microenvironment induces osteogenic differentiation of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells[J].Nanomed：Nanotechnol， Biol Med，2012，8（4）：507-515.

[17]Zhang X，Zhang C，Lin Y，et al.Nanocomposite membranes enhance bone regeneration through restoring physiological electric microenvironment[J].ACS Nano，2016，10（8）：7279-7286.

[18]Lei Y，Su J，Xu H，et al.Pulsed electromagnetic fields inhibit osteoclast differentiation in RAW264.7 macrophages via suppression of the protein kinase B/mammalian target of rapamycin signaling pathway[J].Molecular Medicine Reports，2018，18（1）：447-454.

[19]Bassett CA，Pawluk RJ，Pilla AA.Acceleration of fracture repair by electromagnetic fields： A surgically noninvasive method[J].Ann N Y Acad Sci，1974，238（1）：242-262.