馮勇 ,任政偉

(1.重慶商務(wù)職業(yè)學(xué)院 馮勇中式烹調(diào)技能大師工作室,重慶 401331；2.四川旅游學(xué)院 烹飪與食品實(shí)驗(yàn)管理中心,成都 610100)

草果屬于姜科豆蔻屬多年生草本植物，主要分布于東南亞熱帶和亞熱帶地區(qū)[1-2]。在我國(guó)，大約有30多個(gè)該屬物種，該屬的大部分物種都可以作為食物或藥物被使用[3]，特別是在云南地區(qū)，草果作為當(dāng)?shù)刂匾慕?jīng)濟(jì)作物被栽培[4-5]。2020年，草果入選了云南省十大名藥材，此外，草果也是重要的藥食同源植物，被稱為五大香料之一，還被應(yīng)用在治療消化系統(tǒng)疾病的藥物中[6]。

近代研究結(jié)果表明，草果中具有多種生物活性物質(zhì)，這些物質(zhì)具有抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤、降血糖、降血脂等多種生物活性功能[7]。

微生物多樣性與草果的品質(zhì)關(guān)系密切，了解草果儲(chǔ)藏過(guò)程中微生物多樣性和微生物的群落結(jié)構(gòu)[8]，是保障草果品質(zhì)的關(guān)鍵措施。在草果儲(chǔ)藏過(guò)程中，國(guó)內(nèi)外對(duì)于倉(cāng)庫(kù)中的微生物多樣性變化相關(guān)的研究報(bào)道較少[9]。

草果采摘主要在山區(qū)，交通不便，故大部分干品草果被保存在當(dāng)?shù)豙10]。由于在不同的倉(cāng)庫(kù)中，引起草果品質(zhì)變化的因素眾多，因此草果的品質(zhì)存在著較大差異。本研究基于此，采用抽樣調(diào)查的方式，利用宏基因組對(duì)樣本中的微生物多樣性進(jìn)行研究，同時(shí)對(duì)不同儲(chǔ)藏時(shí)間草果中的生物活性酶進(jìn)行測(cè)定，旨在為草果的倉(cāng)庫(kù)儲(chǔ)藏提供一些理論依據(jù)，同時(shí)也為草果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展奠定一些基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

1.1.1 草果儲(chǔ)藏倉(cāng)庫(kù)的選擇

草果儲(chǔ)藏的3個(gè)倉(cāng)庫(kù)：1號(hào)倉(cāng)庫(kù)位于云南昆明；2號(hào)倉(cāng)庫(kù)位于云南貢山彝族自治州；3號(hào)倉(cāng)庫(kù)位于云南西雙版納。

1.1.2 草果樣品

在2018年12月-2021年12月期間，分別從3個(gè)倉(cāng)庫(kù)中取樣13次。采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)所有的草果樣品進(jìn)行測(cè)序分析。

1.1.3 試驗(yàn)試劑

牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、氯化鈉、可溶性淀粉、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵、硫酸鎂、蛋白胨、葡萄糖、馬鈴薯、Ezup柱式真菌基因組DNA提取試劑盒和Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 微生物菌落的統(tǒng)計(jì)和分析

將每一個(gè)平板中的微生物多樣性和數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算出所有采樣地點(diǎn)中的菌落種類和平均菌落數(shù)，結(jié)果以每個(gè)立方中菌落的種類或者每個(gè)立方中菌落的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，最后根據(jù)標(biāo)本采集時(shí)間，分析生物豐富度與微生物多樣性隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)變化[11-12]。

1.2.2 微生物的群落結(jié)構(gòu)分析

利用分子生物學(xué)方法，對(duì)草果儲(chǔ)藏倉(cāng)庫(kù)中的優(yōu)勢(shì)微生物種類進(jìn)行鑒定和分析，初步對(duì)倉(cāng)庫(kù)中的微生物群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行研究[13]。分別按照純化菌落，進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增、序列比對(duì)和物種的鑒定，最后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和鑒定[14]。

1.2.3 草果中生物活性酶的測(cè)定

1.2.3.1 中性蛋白酶活性

根據(jù)商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10317—1999對(duì)草果中的中性蛋白酶活性進(jìn)行測(cè)定，稱取1 g草果樣品，在40 ℃和pH為7.5的條件下制作待測(cè)酶液。待測(cè)溶液中含有酚基的氨基酸與福林試劑接觸，產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)，顏色的深淺與溶液中的氨基酸含量成正比。在波長(zhǎng)680 nm處測(cè)定其吸光值，從而計(jì)算中性蛋白酶的活性[15]。

1.2.3.2 淀粉酶活性

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 24401—2009中的方法，稱取1 g草果樣品，制作待測(cè)酶液，在70 ℃條件下水浴15 min，添加3,5-二硝基水楊酸，與淀粉溶液進(jìn)行充分的化學(xué)反應(yīng)，之后在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定其吸光值，從而計(jì)算淀粉酶活性[16-17]。

1.2.3.3 果膠酶活性

根據(jù)輕工業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)QB 1502—1992中的方法，稱取1 g草果樣品，制作待測(cè)酶液，在50 ℃的條件下與果膠發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，并與DNS試劑作用，在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定其吸光值，并計(jì)算果膠酶活力。

1.2.3.4 纖維素酶活性

根據(jù)輕工業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)QB 2583—2003中的方法，稱取1 g草果樣品，制作待測(cè)酶液，在37 ℃的條件下水浴，與葡萄糖溶液發(fā)生生化反應(yīng)，之后與DNS試劑作用，并在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定其吸光值，計(jì)算纖維素酶活力[18]。

2 結(jié)果與討論

2.1 倉(cāng)儲(chǔ)環(huán)境空氣中可培養(yǎng)微生物的采集

在2018-2021年期間分別對(duì)云南地區(qū)3個(gè)儲(chǔ)藏草果的倉(cāng)庫(kù)中的微生物多樣性進(jìn)行分析，3個(gè)草果儲(chǔ)藏倉(cāng)庫(kù)中微生物多樣性見表1。對(duì)環(huán)境中的微生物進(jìn)行13次調(diào)查分析，表1中的微生物數(shù)量均為13次測(cè)量的平均值。

表1 3個(gè)草果倉(cāng)庫(kù)中微生物多樣性分析Table 1 Microbial diversity analysis in three warehouses of Amomum tsao-ko

對(duì)3個(gè)儲(chǔ)藏草果的倉(cāng)庫(kù)中的微生物多樣性進(jìn)行檢測(cè)。由表1可知，3號(hào)倉(cāng)庫(kù)的微生物總量明顯多于其他兩個(gè)倉(cāng)庫(kù)，3號(hào)倉(cāng)庫(kù)中的微生物總量分別約為1號(hào)倉(cāng)庫(kù)和2號(hào)倉(cāng)庫(kù)的11倍和13.7倍，另外，3號(hào)倉(cāng)庫(kù)細(xì)菌數(shù)量比真菌和放線菌數(shù)量相對(duì)多些。而1號(hào)和2號(hào)倉(cāng)庫(kù)真菌數(shù)量比細(xì)菌和放線菌數(shù)量多。3號(hào)倉(cāng)庫(kù)細(xì)菌數(shù)量多，為2781.2 CFU/m3，真菌為2671.2 CFU/m3，放線菌數(shù)量為2081.2 CFU/m3。這是由于3號(hào)倉(cāng)庫(kù)所處的地理位置潮濕，微生物更加容易繁殖。

2.2 倉(cāng)儲(chǔ)環(huán)境中可培養(yǎng)微生物多樣性分析

由表1數(shù)據(jù)對(duì)3個(gè)倉(cāng)庫(kù)中微生物在Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Simpson多樣性指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，3號(hào)倉(cāng)庫(kù)空氣中微生物的Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)明顯高于其他兩個(gè)倉(cāng)庫(kù)，分別達(dá)到了1.15，0.98，表明3號(hào)倉(cāng)庫(kù)中的物種豐富度更高。其次是1號(hào)倉(cāng)庫(kù)，Shannon-Wiener指數(shù)是1.10，Simpson指數(shù)是0.91。2號(hào)倉(cāng)庫(kù)的Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)最低，分別是0.81，0.68。

2.3 倉(cāng)儲(chǔ)環(huán)境空氣中可培養(yǎng)微生物動(dòng)態(tài)變化

在2018年12月—2021年12月期間，對(duì)3個(gè)倉(cāng)庫(kù)中的微生物多樣性進(jìn)行分析，草果陳化時(shí)間越長(zhǎng)，3個(gè)倉(cāng)庫(kù)中微生物表現(xiàn)得越穩(wěn)定。由于倉(cāng)庫(kù)屬于密封的情況，倉(cāng)庫(kù)中的微生物數(shù)量基本不受季節(jié)變化的影響，沒有明顯的演替現(xiàn)象，為草果的保存提供了穩(wěn)定的微生物環(huán)境[19]。

由圖1可知，3個(gè)倉(cāng)庫(kù)中微生物的豐富度和數(shù)量均存在一定程度的差異。從微生物的數(shù)量圖來(lái)看，在1號(hào)倉(cāng)庫(kù)中，真菌的變化最為明顯，其次是細(xì)菌，變化最小的是放線菌的數(shù)量。從整體來(lái)看，1號(hào)倉(cāng)庫(kù)中的真菌物種數(shù)量明顯多于細(xì)菌和放線菌。1號(hào)倉(cāng)庫(kù)中的真菌、細(xì)菌和放線菌物種多樣性差異不大。真菌和細(xì)菌的物種數(shù)量基本一致，但是多于放線菌。在2號(hào)倉(cāng)庫(kù)中，細(xì)菌和真菌的數(shù)量多于放線菌。但在2021年4月，檢測(cè)的結(jié)果表明，放線菌的數(shù)量多于細(xì)菌和真菌，這是由于一批草果在4月份從外面進(jìn)入倉(cāng)庫(kù)，倉(cāng)庫(kù)中的放線菌數(shù)量增多，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)逐漸趨于平緩。在2020年12月以前，2號(hào)倉(cāng)庫(kù)中的放線菌微生物數(shù)量較低，而真菌和細(xì)菌的物種數(shù)量基本一致，并沒有明顯的變化。3號(hào)倉(cāng)庫(kù)中的微生物數(shù)量變化較大，不同的采樣時(shí)間，微生物的多樣性變化也很明顯。針對(duì)3號(hào)倉(cāng)庫(kù)而言，不同的采樣時(shí)間，微生物數(shù)量的差異較為明顯。3號(hào)倉(cāng)庫(kù)中的微生物種類隨著時(shí)間的變化并無(wú)明顯差異，但有兩次采樣微生物中的細(xì)菌數(shù)量明顯多于真菌和放線菌。

在3個(gè)不同的倉(cāng)庫(kù)中，1號(hào)倉(cāng)庫(kù)和2號(hào)倉(cāng)庫(kù)中的微生物數(shù)量或微生物種類差異都不明顯。在3號(hào)倉(cāng)庫(kù)中，無(wú)論是微生物數(shù)量，還是微生物種類，都明顯多于其他兩個(gè)倉(cāng)庫(kù)。這是由于3號(hào)倉(cāng)庫(kù)位于云南西雙版納，具有高溫高濕的氣候條件，其倉(cāng)庫(kù)中微生物數(shù)量明顯多于其他倉(cāng)庫(kù)。

2.4 草果中真菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

2.4.1 草果樣本中的序列優(yōu)化

采用宏基因組測(cè)序后，在18個(gè)樣品中一共獲得1437842條ITS的原始序列，每個(gè)樣品中獲得的原始序列范圍大致為75012～82913條。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)拼接和數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，每個(gè)樣品中的有效序列為70149～80123條。樣品中有效序列的有效利用率范圍為93.18%～98.76%。

表2 3個(gè)草果儲(chǔ)藏倉(cāng)庫(kù)中的真菌多樣性分析Table 2 Analysis of fungal diversity in the three Amomum tsao-ko storage warehouses

2.4.2 3個(gè)草果倉(cāng)庫(kù)中真菌群落組成及變化

從3個(gè)草果倉(cāng)庫(kù)的不同樣品中一共分離出4個(gè)門，20個(gè)綱，38個(gè)科，100個(gè)屬和200個(gè)種，見表3。

表3 3個(gè)草果倉(cāng)庫(kù)真菌群落的組成Table 3 Composition of fungal community in the three Amomum tsao-ko warehouses

續(xù) 表

由表3可知，3個(gè)倉(cāng)庫(kù)中的微生物在門、綱、目、科4個(gè)級(jí)別上差異較小，在種的級(jí)別上差異最大。1號(hào)和3號(hào)倉(cāng)庫(kù)中，不同的樣本之間物種多樣性差異較大。2號(hào)倉(cāng)庫(kù)中的物種多樣性差異較小。這可能是由于隨機(jī)取樣時(shí)，樣品沒有被徹底干燥[20]。

2.5 草果中的優(yōu)勢(shì)微生物群落與生物酶活性

由圖2可知，3個(gè)倉(cāng)庫(kù)中生物酶活性變量基本一致。蛋白酶活性和果膠酶活性都隨著草果的存放時(shí)間增長(zhǎng)而逐漸降低，3個(gè)倉(cāng)庫(kù)中淀粉酶活性最強(qiáng)的是倉(cāng)儲(chǔ)18個(gè)月，纖維素酶活性最強(qiáng)的是倉(cāng)儲(chǔ)24個(gè)月。4種生物活性酶在3個(gè)儲(chǔ)藏倉(cāng)庫(kù)中儲(chǔ)藏相同的時(shí)間，活性酶的含量均不相同。從整體的結(jié)果來(lái)看，3號(hào)倉(cāng)庫(kù)中草果的生物活性酶要強(qiáng)于其他兩個(gè)倉(cāng)庫(kù)中草果的生物活性酶，說(shuō)明豐富微生物多樣性對(duì)草果中的生物活性酶具有一定的影響。

3 小結(jié)

在自然的條件下，草果在倉(cāng)庫(kù)中儲(chǔ)藏，其成分和生物酶活性會(huì)發(fā)生改變，而在草果的儲(chǔ)藏過(guò)程中，微生物因子對(duì)草果本身的品質(zhì)影響至關(guān)重要。一方面，微生物的活動(dòng)使草果中大分子物質(zhì)分解，從而容易被吸收和利用；另一方面，長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)藏也會(huì)造成草果中的生物酶活性降低，從而影響草果中活性物質(zhì)的生物活性功能。

研究結(jié)果表明，不同倉(cāng)儲(chǔ)草果的倉(cāng)庫(kù)中，微生物的多樣性不同，儲(chǔ)藏地一定程度上會(huì)對(duì)草果的活性物質(zhì)產(chǎn)生影響。由于儲(chǔ)藏物都為草果，所以3個(gè)草果儲(chǔ)藏倉(cāng)庫(kù)中的微生物種類基本一致。