史志蕓，鄒蓉芳，時(shí) 權(quán)，陳 飛，翟玉潔，黃 陽

近年來，2型糖尿病因患病人數(shù)迅速增多，已成為嚴(yán)重危害人類生活健康的全球性公共衛(wèi)生問題。2型糖尿病患者體內(nèi)的高糖環(huán)境可抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone-marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨分化并影響種植體的初期穩(wěn)定性，進(jìn)而降低口腔種植手術(shù)的成功率。新近有研究發(fā)現(xiàn)，鳶尾素能促進(jìn)高糖環(huán)境中BMSCs成骨分化，但是其作用機(jī)制目前還不清楚。因自噬是維持干細(xì)胞的干性和分化能力所必需的，高糖環(huán)境中干細(xì)胞活性受抑制，而且鳶尾素能激活自噬。因此，本研究將探討鳶尾素促進(jìn)高糖環(huán)境中BMSCs成骨分化是否是通過激活自噬實(shí)現(xiàn)的。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑 新西蘭大白兔BMSCs(解放總醫(yī)院骨科研究所惠贈)。鳶尾素(美國Phoenix Pharmaceuticals)；α-MEM培養(yǎng)液(美國Gibco)；葡萄糖(湖北科倫藥業(yè))；胎牛血清(杭州四季青)；胰蛋白酶、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide， DMSO； 美國Sigma)；成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(賽業(yè)生物)；青霉素、鏈霉素(石家莊華北制藥)；Trizol(美國Invitrogen)；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)試劑盒(上海碧云天生物)；一抗[P62抗體(貨號：#5114, 美國Cell Signaling Technologies)；LC3B抗體(貨號：Ab192890, 英國Abcam)；β-actin抗體(貨號：BM0627，武漢博士德)]、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔單克隆二抗(美國Cell Signaling Technology)；BCA測定試劑盒(南京建成)；PVDF膜(美國Millipore)。

1.2 主要儀器 MCO-15AC型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(日本三洋)；SW-CJ-1FD型生物凈化工作臺(蘇州安泰)；5702R型低速離心機(jī)、Bio-photometer核酸蛋白測定儀(德國艾本德)；340型酶標(biāo)儀(英國BDSL)；DYY-7C型電泳儀、DYCZ-40型轉(zhuǎn)膜儀(北京六一儀器)；流式細(xì)胞儀(CytoFLEX，美國Beckman Coulter)；正置熒光顯微鏡(BX-53，日本奧林巴斯)。

1.3 兔BMSCs復(fù)蘇、培養(yǎng) 從液氮中取出凍存的兔BMSCs，直接將凍存管浸沒在溫水中，并不斷搖動凍存管使凍存液快速融化。5 ml PBS重懸細(xì)胞沉淀，離心(716 g，5 min)后棄上清。最后，將BMSCs接入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，3 d后首次換培養(yǎng)液并在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4 干性鑒定 0.5%胰蛋白酶消化BMSCs，將其制成單細(xì)胞懸液(2×10/ml)備用。在EP管中分別加入異硫氰酸熒光素(fluorescein Isothiocyanate；FITC)標(biāo)記的抗CD11b、CD45、CD29和CD90抗體，低溫環(huán)境中避光孵育30 min后洗脫未結(jié)合的抗體，流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 細(xì)胞分組 將兔BMSCs接種于24孔板(6.0×10/孔)，當(dāng)細(xì)胞長滿孔底面積的80 %時(shí)，換為成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)并將細(xì)胞分為4組：對照組，高糖組(培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度為44 mmol/L)，鳶尾素組[高糖(44 mmol/L)+鳶尾素(100 ng/ml)]和氯喹組[高糖(44 mmol/L)+鳶尾素(100 ng/ml)+氯喹(20 μmol/L)]。各組細(xì)胞成骨誘導(dǎo)5 d后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)檢測 以β-actin為內(nèi)參，按照Western blotting常規(guī)步驟檢測自噬相關(guān)蛋白P62和LC3B的相對表達(dá)。步驟如文獻(xiàn)[5]：裂解各組細(xì)胞并提取總蛋白。測定總蛋白濃度后，各樣本取50 μg蛋白進(jìn)行凝膠電泳(200 mA, 90 min)，將蛋白轉(zhuǎn)膜于PVDF膜上。室溫條件下封閉2 h，分別滴加特異性一抗封閉過夜(P62抗體的稀釋比例1∶1000；LC3B抗體的稀釋比例1∶2000；β-actin抗體的稀釋比例1∶200)，再以辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗封閉2 h，最后用化學(xué)發(fā)光劑顯影，采用Image J軟件分析膠片灰度值。

1.7 成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)檢測 按照qRT-PCR常規(guī)步驟檢測成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Runt-related transcription factor 2，Runx2)、ALP、I型膠原(collagen type I，COL-I)和骨鈣素(osteocalcin, OCN)的相對表達(dá)量：提取各組細(xì)胞的總RNA并檢測RNA含量，再將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并按95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變30 s，58 ℃退火30 s，70 ℃延伸45 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后72℃ 延伸15 min的條件進(jìn)行擴(kuò)增。成骨相關(guān)基因序列見表1。

1.8 ALP活性定量 按照試劑盒說明書行ALP活性定量檢測，方法參照文獻(xiàn)[13]。吸去孔板中的成骨誘導(dǎo)液，PBS緩沖液漂洗，加入30 μl Triton X-100，4℃過夜。然后，每孔加入ALP緩沖液和基質(zhì)液各50 μl，室溫下孵育0.5 h后加入ALP顯色液100 μl，酶標(biāo)儀520 nm處檢測OD值。每孔重復(fù)測試3次。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs形態(tài)觀察及干性鑒定 兔BMSCs復(fù)蘇后貼壁生長，總體觀察呈旋渦狀，單個(gè)細(xì)胞在形態(tài)上呈長條狀或者紡錘狀(圖1)。干性鑒定結(jié)果顯示：兔BMSCs低表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物： CD11b(4.28%)，CD45(7.41%)；高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物：CD29(99.4%)和CD90(99.6%)。

2.2 自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) Western blotting結(jié)果顯示，與對照組相比，高糖顯著升高P62蛋白的表達(dá)，同時(shí)明顯降低LC3B-II的表達(dá)(均<0.05)。鳶尾素干預(yù)能顯著降低P62蛋白的表達(dá)，同時(shí)明顯升高LC3B-II的表達(dá)(均<0.05)。加入自噬抑制劑氯喹后，P62和LC3B-II的蛋白表達(dá)量均升高(<0.05，表2)。

2.3 成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá) qPCR檢測結(jié)果(表3)顯示：與對照組相比，高糖組成骨相關(guān)基因Runx2、ALP和COL-I的轉(zhuǎn)錄表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均<0.05)；鳶尾素組Runx2、ALP和COL-I的表達(dá)水平顯著升高(均<0.05)；當(dāng)加入氯喹后，Runx2和ALP的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均<0.05)。

2.4 ALP活性 在成骨誘導(dǎo)5 d后：與對照組相比，高糖組細(xì)胞的ALP活性顯著降低[(0.171±0.033)(0.257±0.046)；<0.05]；而鳶尾素組細(xì)胞的ALP活性明顯升高[(0.276±0.017)(0.171±0.033)；<0.05]；加入氯喹后，ALP活性明顯下降[(0.182±0.029)(0.276±0.017)；<0.05]。

3 討 論

鳶尾素是運(yùn)動誘導(dǎo)產(chǎn)生的肌源性細(xì)胞因子，具有抗炎和抗分解代謝的作用，鳶尾素也能抑制胰島β細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。而且，鳶尾素可通過激活自噬緩解壓力誘導(dǎo)的心肌肥大和血管緊張素II誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。而本研究發(fā)現(xiàn)鳶尾素通過激活自噬促進(jìn)高糖環(huán)境中BMSCs成骨分化。

BMSCs具有分化成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等多種細(xì)胞的潛能，是防治種植術(shù)區(qū)骨量不足的重要調(diào)控靶點(diǎn)。因此，本研究選擇BMSCs研究自噬在干細(xì)胞成骨分化中的作用。自噬是一個(gè)吞噬細(xì)胞自身蛋白或細(xì)胞器并將其包裹到囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解和再利用其包裹的內(nèi)容物的過程，生物體借此滿足自身代謝或者細(xì)胞器更新的需求。自噬作為多種疾病的發(fā)生機(jī)制再過去幾十年被廣泛研究。本研究發(fā)現(xiàn)，在BMSCs成骨分化的過程中，高糖環(huán)境降低BMSCs的自噬活性，而鳶尾素干預(yù)能重新激活自噬。當(dāng)采用自噬抑制劑氯喹抑制自噬后，鳶尾素促進(jìn)高糖環(huán)境中BMSCs成骨分化的作用明顯減弱，這至少在某種程度上說明鳶尾素促進(jìn)高糖環(huán)境中BMSCs成骨分化是通過激活自噬實(shí)現(xiàn)的。既往的研究與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，即激活自噬能促進(jìn)BMSCs成骨分化，而使用巴弗洛霉素A1抑制自噬后導(dǎo)致骨生成減少。而且，自噬激活劑雷帕霉素能抑制骨吸收并促進(jìn)骨生成。

Runx2是BMSCs在成骨分化的過程中發(fā)揮啟動作用的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，本研究的PCR結(jié)果顯示，當(dāng)采用氯喹抑制自噬后，鳶尾素促進(jìn)高糖環(huán)境中BMSCs細(xì)胞Runx2轉(zhuǎn)錄表達(dá)的作用明顯減弱。而啟動Runx2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)能夠促進(jìn)BMSCs成骨分化的早期標(biāo)志物ALP和COL-I的表達(dá)。當(dāng)采用氯喹抑制自噬后，鳶尾素促進(jìn)高糖環(huán)境中BMSCs細(xì)胞ALP轉(zhuǎn)錄表達(dá)的作用也明顯減弱，COL-I的轉(zhuǎn)錄表達(dá)亦呈下降的趨勢。與此同時(shí)，ALP活性檢測也證實(shí)，抑制自噬后，鳶尾素促進(jìn)高糖環(huán)境中BMSCs細(xì)胞ALP活性的作用明顯降低。但是，鳶尾素對BMSCs成骨分化標(biāo)志物OCN的轉(zhuǎn)錄表達(dá)卻無影響。抑制自噬后，OCN的轉(zhuǎn)錄表達(dá)也無明顯改變。造成這種差異的原因可能是基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)具有時(shí)間效應(yīng)。因?yàn)镺CN是在成骨晚期，即骨質(zhì)沉積階段才高表達(dá)的，而本研究進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)的時(shí)間是在成骨誘導(dǎo)后的第5天。

自噬主要受哺乳動物雷帕霉素受體(mammalian target of rapamycin，mTOR)依賴性和mTOR非依賴性信號通路的調(diào)節(jié)，AMP依賴的蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK)是細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP比例敏感性的能量感受器，AMPK激活后可直接抑制mTOR，進(jìn)而激活自噬。Sirt1是細(xì)胞內(nèi)NAD依賴性的能量感受器，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量代謝和細(xì)胞生存，也可以通過使幾種自噬相關(guān)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子去乙酰化來調(diào)節(jié)自噬。本研究僅表明鳶尾素通過激活自噬促進(jìn)高糖環(huán)境中BMSCs成骨分化，但對鳶尾素干預(yù)激活自噬的信號途徑未進(jìn)行探討。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)需進(jìn)一步明確鳶尾素激活自噬的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鳶尾素在體外促進(jìn)高糖環(huán)境中BMSCs成骨分化是通過激活自噬實(shí)現(xiàn)的，而這對于加深認(rèn)識鳶尾素的作用機(jī)制具有重要意義。