王志彬，羅 慶，李寶林，唐 敏，張 章，劉靳波

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)部（瀘州 646000）

2019 年12 月武漢爆發(fā)由新型冠狀病毒引發(fā)的肺炎，并迅速在全國(guó)蔓延[1]，其傳播速度超過(guò)2003年爆發(fā)的“非典”[2]。2020 年1 月10 日，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）將該病原體命名為2019-nCoV（2019 novel coronavirus），2 月11 日，國(guó)際病毒分類委員會(huì)（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）正式宣布該病毒為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）。

SARS-CoV-2 為正義鏈、單鏈線狀RNA 冠狀病毒[3]，該病毒典型特征之一為無(wú)癥狀傳播[4]，傳染者和被傳染者在感染初期可能無(wú)癥狀[5]，使得防控難度加大。疫情發(fā)生以來(lái)，中國(guó)政府及時(shí)采取強(qiáng)有力、高效能的措施使得疫情得到初步控制，但截至目前，SARS-CoV-2在許多國(guó)家和地區(qū)仍在快速傳播和蔓延。感染者的及時(shí)確診是疫情防控的關(guān)鍵一環(huán)，目前臨床診斷主要基于臨床病史、胸部CT和病毒核酸檢測(cè)[6-7]。相較于臨床癥狀的出現(xiàn)，核酸檢測(cè)結(jié)果在促進(jìn)感染者隔離、治療、出院以及評(píng)估感染活動(dòng)中起重要作用。根據(jù)WHO 診療指南，目前診斷SARS-CoV-2 感染的金標(biāo)準(zhǔn)是基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果，但由于RT-qPCR 技術(shù)本身的靈敏性較低，加之標(biāo)本取材差異大等，許多低拷貝病毒核酸感染者不能在一次核酸檢測(cè)中檢出，給疫情防控帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)[8]。

微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）的工作原理是由微滴發(fā)生器將20 μL RT-qPCR反應(yīng)體系分割成約20 000 個(gè)油包水的液滴單獨(dú)進(jìn)行PCR 反應(yīng)，再通過(guò)微滴分析儀對(duì)每個(gè)油滴進(jìn)行熒光信號(hào)采集，采用泊松分布概率函數(shù)計(jì)算起始模板的拷貝數(shù)[9]。與RTqPCR相比，ddPCR不需要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，對(duì)低拷貝核酸檢出具有優(yōu)勢(shì)[10]。咽拭子等取樣工作給醫(yī)護(hù)人員帶來(lái)暴露風(fēng)險(xiǎn)，尤其當(dāng)防疫物資緊缺時(shí)。如果能通過(guò)尿液等標(biāo)本代替咽拭子等進(jìn)行核酸檢測(cè)，將大大降低醫(yī)護(hù)人員的暴露風(fēng)險(xiǎn)。研究報(bào)告指出，陽(yáng)性病人尿液中含有SARS-CoV-2 核酸[11]。本研究針對(duì)5 例咽拭子陽(yáng)性標(biāo)本，同時(shí)進(jìn)行ddPCR 和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，比較了兩種技術(shù)在準(zhǔn)確性和靈敏度上的差別，建立了最佳ddPCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)程序；同時(shí)為了開(kāi)發(fā)定量標(biāo)本的采集方法進(jìn)而應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)系統(tǒng)，使用ddPCR 技術(shù)檢測(cè)了另外12 例陽(yáng)性病人的尿液標(biāo)本，評(píng)價(jià)了以尿液作為檢驗(yàn)樣本的可行性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采取

2019 年12 月25 日至2020 年3 月4 日期間在西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院發(fā)熱門診就診病人和有武漢接觸史的人群進(jìn)行了SARS-CoV-2 病毒檢測(cè)，共收集到陽(yáng)性標(biāo)本17份（均屬不同病人），其中包括咽拭子標(biāo)本5份，尿液標(biāo)本（隨機(jī)尿）12 份。病人納入標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》[12]中病原學(xué)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)本收集之前病人尚未接受藥物治療以及其他治療，標(biāo)本收集后RT-PCR檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性。

1.2 儀器與試劑

儀器：EX3600 核酸自動(dòng)提取儀（上海之江生物科技股份有限公司）、Bio-Rad CFX96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-rad 公司）、Bio-Rad QX200 微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)（美國(guó)Bio-rad公司）。

試劑：Bio-Rad Droplet Generation Oil（美國(guó)Bio-rad公司）、Bio-Rad Droplet Reader Oil（美國(guó)Bio-rad公司）、Bio-Rad 2×ddPCR supermix for probes（美國(guó)Bio-rad 公司）、引物（中國(guó)生工）、探針（中國(guó)生工）、新型冠狀病毒2019-nCoV 核酸檢測(cè)試劑盒（上海之江生物科技股份有限公司）。

1.3 方法

本文的方法學(xué)研究主要參照康鳳鳳等[13]和黃斐等[14]的報(bào)道，并參考2012 年6 月美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究院頒布的EP17-A2文件[15]。

1.3.1 核酸提取 咽拭子SARS-CoV-2 RNA的提?。喝? 倍于咽拭子體積的4%NaOH 溶液，加入咽拭子采集管中液化30 min，液化過(guò)程中每10 min振蕩一次，直至樣本無(wú)拉絲。取1 mL 液化后樣本于13 000 rpm 離心10 min，棄上清后用生理鹽水洗滌，13 000 rpm 離心10 min，留取300 μL 上清，棄除多余的上清后將剩余的300 μL上清與沉淀混勻，將混合物吸入到EX3600核酸自動(dòng)提取儀配套的核酸提取預(yù)裝板A 孔中（一次性可以提取36個(gè)標(biāo)本），將預(yù)裝版置于設(shè)備固定位置，啟動(dòng)核酸提取程序提取核酸。

尿液SARS-CoV-2 RNA 的提取：取尿液1.5 mL，8 000 rpm 離心5 min，棄上清1.2 mL，剩余混勻后進(jìn)行核酸提取，具體步驟同上。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒制備與稀釋 CDC-陽(yáng)性質(zhì)粒V2，全長(zhǎng)2 983 bp，載體pUC57，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒起始濃度為7.84×1010copies/μL。用ddH2O 將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒做10 倍系列稀釋，共7 個(gè)濃度（7.84×107copies/μL～7.84×101copies/μL）。

1.3.3 引物和探針 引物序列采用國(guó)家微生物科學(xué)數(shù)據(jù)中心（National Microbiology Data Center，NMDC）公布的信息，目的序列為新冠肺炎SARS-CoV-2 病毒核殼蛋白（nucleoprotein，N）基因，序列信息見(jiàn)表1。

表1 SARS-CoV-2病毒核殼蛋白基因引物信息Table 1 Primer information of SARS-CoV-2 virus nucleocapsid protein gene

1.3.4 ddPCR 反應(yīng)體系和條件優(yōu)化 進(jìn)行ddPCR 之前，通過(guò)溫度梯度PCR，設(shè)置51 ℃～62 ℃之間不同的溫度對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。使用Bio-Rad QX200微滴式數(shù)字PCR 系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，具體操作步驟參照實(shí)驗(yàn)儀器及試劑說(shuō)明書(shū)，略有改動(dòng)，主要包括PCR反應(yīng)體系制備（見(jiàn)表2）、微滴發(fā)生、PCR 反應(yīng)程序設(shè)定和微滴信號(hào)檢測(cè)等。

表2 ddPCR反應(yīng)體系Table 2 ddPCR reaction system

將上述反應(yīng)體系混勻后加入微滴發(fā)生卡中間一排，在微滴發(fā)生卡Oil標(biāo)志列加入70 μL微滴生成油，及時(shí)蓋好專用膠墊后將微滴發(fā)生卡水平放置在微滴發(fā)生器的槽中制備油滴，待指示燈亮后取出微滴發(fā)生卡，將droplet 列微滴（約45 μL）全部轉(zhuǎn)入96 孔板，封鋁膜后置于PCR 儀中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃10 min，94 ℃30 s，60 ℃1 min，溫度變化設(shè)置為2 ℃，共40個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增結(jié)束后98 ℃酶失活10 min。每個(gè)模板設(shè)置2個(gè)技術(shù)重復(fù)。擴(kuò)增結(jié)束后，將96孔板放入微滴讀取儀中檢測(cè)探針信號(hào)，并使用QuantaSoft 軟件（Bio-Rad，USA）分析數(shù)據(jù)。

1.3.5 假病毒樣本的ddPCR 擴(kuò)增 假病毒、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照均來(lái)自新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑盒（上海之江生物科技股份有限公司）。假病毒標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為108copies/mL，分別稀釋為105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、10 copies/μL和1 copies/μL，共6個(gè)濃度進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。假病毒核酸稀釋后，在最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行ddPCR擴(kuò)增。每次反應(yīng)中設(shè)置一個(gè)陰性對(duì)照和一個(gè)空白對(duì)照。將反應(yīng)體系離心混勻，放入微滴發(fā)生卡中，通過(guò)微滴發(fā)生器產(chǎn)生微滴，之后將制備好的微滴（水、油分層）緩慢加入96孔板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序同上，每個(gè)假病毒標(biāo)本均做3個(gè)相同模板的平行反應(yīng)。

1.3.6 空白限評(píng)估 空白限評(píng)估(limit of blank，LOB)：參照黃斐等[14]的研究方法，檢測(cè)8份（3次重復(fù)）不同濃度陰性樣本核酸中SARS-CoV-2 的拷貝數(shù)，計(jì)算應(yīng)用該檢測(cè)平臺(tái)可能出現(xiàn)的假陽(yáng)性微滴數(shù)及概率大小。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用兩組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的t檢驗(yàn)方法比較兩組間差異性。

2 結(jié)果

2.1 陽(yáng)性質(zhì)控制備與引物特異性驗(yàn)證

通過(guò)溫度梯度PCR，退火溫度設(shè)為51℃～62 ℃，確定引物的最佳退火溫度為60 ℃。以稀釋后的7個(gè)不同濃度質(zhì)粒為模板，以核殼蛋白基因序列為目的基因，驗(yàn)證引物特異性并確定陽(yáng)性質(zhì)控的最佳濃度。RT-qPCR結(jié)果顯示見(jiàn)圖1，每?jī)蓚€(gè)相鄰濃度模板之間擴(kuò)增曲線相差約3.3個(gè)循環(huán)，除模板濃度（編號(hào)g）（7.84×101copies/μL）的Ct 值大于30 之外，其余各濃度模板擴(kuò)增曲線擴(kuò)增效率良好。陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增，表明該體系無(wú)污染。

圖1 不同濃度CDC-陽(yáng)性質(zhì)粒V2模板擴(kuò)增曲線Figure 1 Amplification curve of CDC-positive plasmid V2 template at different concentrations

不同濃度質(zhì)粒模板經(jīng)40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后，溶解曲線為單峰見(jiàn)圖2，無(wú)引物二聚體及其它非特異性擴(kuò)增，表明引物特異性良好，能用于SARS-CoV-2的檢驗(yàn)。

圖2 不同濃度CDC-陽(yáng)性質(zhì)粒V2模板溶解曲線Figure 2 Template dissolution curves of CDC-positive plasmid V2 at different concentrations

2.2 ddPCR反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果的精密度評(píng)價(jià)

以上述7 個(gè)不同濃度的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板進(jìn)行ddPCR 反應(yīng)。結(jié)果顯示，以陽(yáng)性質(zhì)粒為模板（3.92 ×104copies/μL）進(jìn)行ddPCR 擴(kuò)增，微滴發(fā)生器生成的微滴數(shù)大于10 000，見(jiàn)圖3。在陰性對(duì)照中，無(wú)陽(yáng)性液滴生成，表明反應(yīng)體系和微滴發(fā)生程序正常，能滿足基本擴(kuò)增和檢測(cè)。

圖3 ddPCR方法擴(kuò)增CDC-陽(yáng)性質(zhì)粒V2模板一維散點(diǎn)圖Figure 3 One dimensional scatter diagram of CDC-positive plasmid V2 template amplified by ddPCR

ddPCR 可靠性檢測(cè)結(jié)果顯示：所有反應(yīng)中油滴總數(shù)均超過(guò)10 000，最低數(shù)量為11 343，最高數(shù)量為15 136，表明該數(shù)字PCR 平臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)良好，微滴生成數(shù)量能夠滿足泊松分布函數(shù)。與質(zhì)粒模板的理論濃度相比，ddPCR檢測(cè)結(jié)果較理論值偏低，見(jiàn)表3。兩個(gè)機(jī)械重復(fù)之間相比較，ddPCR 結(jié)果重復(fù)性較好。ddPCR 檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)CV值介于0.04～12.09，表明ddPCR檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度較好。

表3 核殼蛋白基因的ddPCR精密度檢驗(yàn)Table 3 ddPCR precision test of nucleoprotein gene

以ddPCR檢出結(jié)果和質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)濃度之間做相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩者之間具有極強(qiáng)的相關(guān)性，兩者之間的線性關(guān)系見(jiàn)圖4，ddPCR 檢出結(jié)果與理論值呈極度正相關(guān)，ddPCR 結(jié)果正確可靠。當(dāng)模板濃度超過(guò)7.84×105copies/μL 時(shí)，微滴分析儀讀取不到陰性微滴，全部體系均為陽(yáng)性微滴，超過(guò)機(jī)器檢出限，導(dǎo)致讀取結(jié)果錯(cuò)誤，ddPCR檢測(cè)上限應(yīng)低于7.84×105copies/μL。

圖4 ddPCR方法與RT-qPCR之間的線性相關(guān)性Figure 4 Linear correlation between ddPCR and RT-qPCR

2.3 ddPCR反應(yīng)與RT-qPCR反應(yīng)組間重復(fù)

將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的7 個(gè)濃度稀釋液作為模板，以核殼蛋白（nucleoprotein，N）基因?yàn)闉槟康男蛄性O(shè)計(jì)引物，進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)，構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=-3.317lgx+39.831，線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.999，y為Ct值，x為濃度（copies/μL）。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)對(duì)未知樣本測(cè)定的Ct 值便可得出樣本中SARS-CoV-2 的起始拷貝數(shù)，見(jiàn)表4。

表4 ddPCR與RT-qPCR之間的組間重復(fù)Table 4 Intergroup duplication between ddPCR and RT-qPCR

2.4 ddPCR反應(yīng)重復(fù)性和可報(bào)告范圍

在重復(fù)性分析實(shí)驗(yàn)中，ddPCR 定量檢測(cè)中CV最小值為2.31%，最大值為38.35%，結(jié)果表明，ddPCR 方法具有較好的重復(fù)性。不同濃度假病毒方法間重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該平臺(tái)系統(tǒng)偏差為-17.33%～-3.80%，見(jiàn)表5。在重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，使用ddPCR檢測(cè)到的所有結(jié)果均未超出假病毒標(biāo)準(zhǔn)品的理論濃度，表現(xiàn)出較高的一致性。

表5 不同濃度假病毒樣本ddPCR方法組間重復(fù)Table 5 The ddPCR method of pseudovirus samples with different concentrations were repeated between groups

2.5 空白限評(píng)估

ddPCR 檢測(cè)陰性標(biāo)本核酸中SARS-CoV-2 拷貝數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度（隨機(jī)）樣本產(chǎn)生的微滴數(shù)在11 101～14 805之間，陽(yáng)性微滴數(shù)＞1即判斷為假陽(yáng)性，在本實(shí)驗(yàn)中該平臺(tái)假陽(yáng)性出現(xiàn)概率為1/24。LOB最大估計(jì)值為0.09 copies/μL。

2.6 尿液標(biāo)本中SARS-CoV-2拷貝數(shù)檢測(cè)

為了能使標(biāo)本量化檢測(cè)，同時(shí)避免咽拭子等取樣工作帶來(lái)的暴露風(fēng)險(xiǎn)，本研究嘗試用尿液檢測(cè)SARSCoV-2。12份尿液標(biāo)本全部來(lái)自確診病人。臨床上使用某公司生產(chǎn)的核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)病人痰液SARS-CoV-2陽(yáng)性，而檢測(cè)尿液結(jié)果全部為陰性，表明尿液中該病毒核酸為低拷貝。

使用ddPCR 檢測(cè)這12 份尿液樣本，其靈敏度增加，共9例檢出，3例未檢出，檢出率為75%。所檢出濃度范圍為5.4 copies/μL～30 copies/μL。

從圖5、圖6 可以看出，陰性對(duì)照均無(wú)陽(yáng)性微滴檢出，陽(yáng)性對(duì)照分別檢出陽(yáng)性微滴數(shù)2 226和2 561，分別對(duì)應(yīng)檢出濃度為4 520 copies/μL和5 500 copies/μL。

圖5 尿液標(biāo)本1～6號(hào)檢測(cè)結(jié)果Figure 5 Detection results of urine samples 1～6

圖6 尿液標(biāo)本7～12號(hào)檢測(cè)結(jié)果Figure 6 Detection results of urine samples 7～12

尿液標(biāo)本同時(shí)使用RT-qPCR 和ddPCR進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果12 份尿液標(biāo)本使用ddPCR 技術(shù)檢出9 份，使用RT-qPCR 檢出0 份，表明ddPCR 方法在低拷貝核酸定量檢測(cè)中具有明顯優(yōu)勢(shì)。

3 討論

SARS-CoV-2 爆發(fā)以來(lái)，中國(guó)政府及時(shí)采取強(qiáng)有力的防控措施，使得疫情得到初步控制。但是，SARSCoV-2在許多國(guó)家和地區(qū)還有蔓延趨勢(shì)。研究報(bào)告表明，關(guān)于該病毒的致病性、遺傳特征等方面的認(rèn)知相對(duì)缺乏[15]，因此很難在短時(shí)間內(nèi)制定一套有效的治療方案，而快速診斷疑似病人并采取隔離防控措施，成為疫情防控的關(guān)鍵。

SARS-CoV-2 傳播能力強(qiáng)而且存在無(wú)癥狀感染的特性。相比于CT（computed tomography）或抗體檢測(cè)，核酸檢測(cè)克服了滯后性，同時(shí)也是目前臨床上感染者確診和出院的主要依據(jù)[16]。但核酸檢測(cè)易出現(xiàn)假陰性，標(biāo)本采集部位、方法以及RNA 提取等過(guò)程均是SARS-CoV-2 病毒核酸檢測(cè)出現(xiàn)假陰性的原因[8]。另外，RT-qPCR由于其檢出限的限制，在臨床上的應(yīng)用弊端日漸突出，加之不同公司生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差別很大，致使許多疑似病例甚至陽(yáng)性感染者無(wú)法在第一時(shí)間檢出陽(yáng)性結(jié)果，從而導(dǎo)致診斷延遲，給疫情防控帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。

ddPCR 技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯，是繼常規(guī)PCR 技術(shù)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)精密檢測(cè)技術(shù)，最初ddPCR 技術(shù)被用來(lái)分離單基因[17-18]，在臨床檢驗(yàn)中使用較少。有報(bào)道指出，當(dāng)ddPCR 應(yīng)用于檢測(cè)系統(tǒng)時(shí)，能夠檢測(cè)到低至0.001%的突變基因，相比于RT-qPCR，靈敏性提高1 000 倍[19]。趙欣[20]的研究結(jié)果顯示，ddPCR 在臨床樣本定量檢測(cè)時(shí)其檢出率高于RT-qPCR，這與本研究得出結(jié)果相同。本研究中，RT-qPCR 可檢出4 號(hào)咽拭子中1.41 copies/μL的SARS-CoV-2，卻無(wú)法檢出尿液中5.4～30 copies/μL（ddPCR檢出值）的SARS-CoV-2。假設(shè)上述兩種方法檢出值都在真值范圍內(nèi)，這一現(xiàn)象無(wú)法僅僅以“尿液中該病毒核酸為低拷貝”作出解釋?；氐絉T-qPCR 檢測(cè)，在臨床上針對(duì)新冠病毒的“判陽(yáng)”是依據(jù)Ct值大小，如第九版新冠肺炎診療方案中明確規(guī)定連續(xù)兩次新冠核酸檢測(cè)Ct 值≥35 即可解除隔離或出院。在本研究中，4 號(hào)咽拭子中核酸濃度1.41 copies/μL 對(duì)應(yīng)的Ct 值為36.03，通過(guò)常規(guī)PCR 技術(shù)檢測(cè)應(yīng)該判定為陰性，而ddPCR 與之相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果為37.00 copies/μL。由此可見(jiàn)，ddPCR 檢測(cè)可以補(bǔ)充RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果，而RT-qPCR 不能補(bǔ)充ddPCR 的檢測(cè)結(jié)果。因此，當(dāng)ddPCR 檢測(cè)結(jié)果為5.4～30 copies/μL 時(shí)，RT-qPCR 無(wú)法檢出就得到了很好的解釋。RT-qPCR檢出濃度是根據(jù)Ct value帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得，為理論值，4號(hào)咽拭子Ct 值兩次重復(fù)均超過(guò)35，隨著Ct 值增大，結(jié)果準(zhǔn)確性降低，國(guó)家微生物科學(xué)數(shù)據(jù)中心指南（https://nmdc.cn/nCoV）表明當(dāng)RT-qPCR 結(jié)果大于37，為不準(zhǔn)確。ddPCR將含有核酸分子的反應(yīng)體系分隔成“油包水”的小液滴，在模板量適當(dāng)?shù)那疤嵯拢_保每個(gè)小液滴最多包含一條核酸分子，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，利用微滴檢測(cè)儀對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行逐個(gè)掃描檢測(cè)，有熒光信號(hào)的微滴判讀為“1”，沒(méi)有熒光信號(hào)的微滴判讀為“0”，最后根據(jù)泊松分布原理及陽(yáng)性微滴的個(gè)數(shù)，分析軟件即可給出靶分子的絕對(duì)起始拷貝數(shù)及濃度，這個(gè)濃度的準(zhǔn)確性有待進(jìn)一步探討，趙欣在其碩士論文中也表示，RT-qPCR的定量值始終比ddPCR高10倍，推測(cè)其原因可能是標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度被高估所致[20]。

臨床上核酸檢測(cè)SARS-CoV-2的取樣主要包括鼻咽拭子、口咽拭子、痰液等，當(dāng)感染者病毒載量低時(shí)不能取到陽(yáng)性標(biāo)本，加之醫(yī)護(hù)人員取樣操作帶來(lái)的差異，導(dǎo)致所取樣本無(wú)法量化，也是核酸檢測(cè)假陰性的原因之一。同時(shí)，咽拭子取樣操作使得醫(yī)護(hù)人員暴露風(fēng)險(xiǎn)增加，在防護(hù)物資緊缺時(shí)增加醫(yī)護(hù)人員的感染風(fēng)險(xiǎn)。有研究表明新型冠狀病毒還會(huì)導(dǎo)致不同程度的心理抑郁[21]，因此快速、準(zhǔn)確檢出病毒，是疫情防控關(guān)鍵的一環(huán)。本研究開(kāi)發(fā)新的取樣方法和標(biāo)本內(nèi)容，以尿液為實(shí)驗(yàn)材料，定量至1.5 mL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以期在保證陽(yáng)性檢出率的同時(shí)，更加安全的進(jìn)行傳染性疾病的取樣工作，更完整地鑒定感染病例并避免交叉感染。

在低拷貝核酸樣本的檢測(cè)中，ddPCR 技術(shù)與RTqPCR相比具有顯著的優(yōu)勢(shì)[22-24]。臨床上根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行的確診，不同試劑盒廠家建議只需滿足在同一份標(biāo)本中SARS-CoV-2 的ORF1ab基因及核殼蛋白基因至少1 個(gè)靶標(biāo)特異性RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性即可，并且有研究報(bào)告指出，在檢測(cè)SARS 冠狀病毒時(shí)，ORF1b基因和核殼蛋白基因具有相似的準(zhǔn)確性[25]，因此本研究主要以核殼蛋白基因?yàn)榘行蛄?。雖然本研究證實(shí)，單拷貝核酸通過(guò)ddPCR 技術(shù)檢測(cè)具有優(yōu)越的靈敏性，但本研究依然存在局限性。①由于瀘州本地陽(yáng)性病例較少，使得本研究樣本量不夠大，重復(fù)性不好；②ddPCR 儀器操作要求較高，很容易在不同的加樣孔之間造成污染；③ddPCR 檢測(cè)成本較RT-qPCR 技術(shù)高，普及困難。本研究的結(jié)果顯示，12例痰液檢測(cè)為陽(yáng)性的感染者尿液標(biāo)本，RT-qPCR檢出0例，表明尿液中病毒載量低。ddPCR 技術(shù)檢出9 例，表明ddPCR 技術(shù)在低載量病毒核酸檢測(cè)過(guò)程中具明顯優(yōu)勢(shì)，這也為其他重大傳染性疾病的檢出提供新的思路與方法，其自動(dòng)化程度是值得繼續(xù)研究與開(kāi)發(fā)的方向。

4 結(jié)論

在低拷貝核酸樣本的檢測(cè)中，ddPCR 技術(shù)與RTqPCR相比，ddPCR技術(shù)在低載量病毒核酸檢測(cè)過(guò)程中具有明顯優(yōu)勢(shì)。這一結(jié)果也為其他類似的重大傳染性疾病的檢出提供了新的思路與方法。

（利益沖突：無(wú)）