楊江濤 曾偉宏 田國力 趙 明 江劍輝 王治國

中國婦幼保健協(xié)會遺傳代謝病和維生素代謝專業(yè)委員會；

中國醫(yī)院協(xié)會臨床檢驗專業(yè)委員會出生缺陷防控實驗技術(shù)與管理學組；

深圳罕見病代謝組學精準醫(yī)學工程研究中心；《罕少疾病雜志》編輯委員會

1 GC-MS技術(shù)應(yīng)用概況

氣相色譜技術(shù)(gas chromatography，GC)是一種經(jīng)典的分析技術(shù)方法，該技術(shù)根據(jù)待測物質(zhì)在被載氣攜帶進入填充柱或毛細色譜柱中氣相和固定相間分配系數(shù)的不同，各組分經(jīng)過反復多次分配從而實現(xiàn)分離和依次出峰(定性)。質(zhì)譜技術(shù)(mass spectrometry，MS)是一種通過檢測目標樣品帶電離子的質(zhì)荷比(m/z)來進行分析的方法。MS技術(shù)檢測具有強特異性和高靈敏度的優(yōu)勢，質(zhì)譜分析可提供豐富的結(jié)構(gòu)及特征離子峰信息，可根據(jù)目標化合物質(zhì)譜的特征離子峰來確定分子結(jié)構(gòu)，也可通過譜庫檢索來定性。將GC與MS聯(lián)合，則可對待測物質(zhì)進行精準定性定量，稱為氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。GC-MS技術(shù)可用于分析尿液樣本中數(shù)百種有機酸，自1966年Tanaka運用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)報告首例異戊酸血癥以來，已有250多種具有臨床意義的有機酸指標被檢出。尿液中有機酸的升高或異常出現(xiàn)與體內(nèi)碳水化合物、脂肪酸、氨基酸、維生素、糖、電解質(zhì)類的代謝紊亂或遺傳代謝障礙導致底物貯積和旁路代謝物大量產(chǎn)生有關(guān)。基于尿液有機酸檢測，很多遺傳代謝病逐漸被發(fā)現(xiàn)。目前GC-MS較多用于有機酸尿癥為主的遺傳代謝病檢測，逐步在多種遺傳代謝病篩查診斷和出生缺陷防控中發(fā)揮作用[1-4]。GC-MS檢測技術(shù)具有高特異性、高靈敏度、高準確性、高通量、快速、自動化等優(yōu)點，已成為遺傳代謝性疾病輔助診斷和高危篩查的重要手段之一，國外于20世紀70年代就開始應(yīng)用于有機酸尿癥的篩查診斷，我國近20年來逐步引進GC-MS技術(shù)，尤其是近三年來步伐明顯加快，全國各地開展GC-MS遺傳代謝病檢測的實驗室越來越多，大家對遺傳代謝病的關(guān)注也越來越多，幫助很多遺傳代謝病患者獲得了正確的診斷與治療[5-7]。

2 GC-MS實驗室檢測技術(shù)

GC-MS是對尿樣多種有機酸進行檢測的一種新技術(shù)。在尿液或尿濾紙片復溶液樣本中加入穩(wěn)定內(nèi)標，經(jīng)過一段時間的肟化反應(yīng)后進行有機溶劑液萃取，轉(zhuǎn)移提取物氮氣吹干，衍生化后用GC-MS儀進行分析，使用GSMS數(shù)據(jù)庫檢測系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析。

2.1 檢測原理GC-MS由氣相色譜儀和單級四極桿質(zhì)譜儀兩個部分組成，利用氣相色譜儀的分離能力對尿中多種有機酸代謝物有效分離后，再通過質(zhì)譜部分鑒定分離的組分(定性)，基于內(nèi)標技術(shù)半定量計算出相應(yīng)含量。由于尿液中代謝終產(chǎn)物濃度高于血液，且尿液樣本可通過體外無創(chuàng)的方式進行收集，大部分尿液中的代謝產(chǎn)物具有容易揮發(fā)的特性，故而通過該分析技術(shù)檢測尿液樣本中的特異性代謝產(chǎn)物，可為遺傳代謝病的篩查與診斷提供可靠依據(jù)。

氣相色譜分析通常使用高純氦氣(He)為載氣，在色譜柱中的固定相為吸附劑，利用吸附劑對待測樣品中各組分的吸附力不同的特性以及親和力、溶解度、陰滯等物理性質(zhì)的不同，物質(zhì)隨載氣移動經(jīng)過一定時間后，不同組分在相對運動的兩相中具有不同的分配系數(shù)即在色譜柱中的運行速度差異，基于以上原理待測樣本不同組分得以在色譜柱中實現(xiàn)分離。根據(jù)分離后各組分在色譜柱中保留時間不同進行待測樣本的定性，其檢測結(jié)果為不同色譜峰，不同時間段的色譜峰代表不同成分，色譜峰的豐度和響應(yīng)值表示該成分含量的多少。

當通過色譜柱分離的各組分進入質(zhì)譜后，分離后的這些中性化合物分子組分在質(zhì)譜離子源中發(fā)生電離，產(chǎn)生不同質(zhì)荷比的帶電離子在四級桿電場的作用下形成離子束，由于每種化合物分子具有特殊的化學結(jié)構(gòu)，故不同的化合物分子被電離后產(chǎn)生具有特征性的碎片離子，最后經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量檢測器得到每個組分的碎片離子質(zhì)量數(shù)分布圖稱為質(zhì)譜圖，檢測得到的質(zhì)譜圖通過與美國國家標準與技術(shù)研究院(national institute of standards and technology，NIST)譜庫的標準質(zhì)譜圖對比確定該組分是什么物質(zhì)，即定性分析。再通過計算每個分析物和檢測中同時加入的已知濃度內(nèi)標物之間信號強度比率作半定量分析，最后將所有目標分析物與其特異性對應(yīng)的疾病信息進行關(guān)聯(lián)，基于正常人群化合物建立的參考區(qū)間，綜合分析進一步推測罹患某種遺傳性代謝病的可能[8]。

質(zhì)譜儀器建議由專人進行管理，周期性進行性能核查、使用記錄登記和維護保養(yǎng)，并按照實驗室要求制定相應(yīng)的儀器操作、維護標準作業(yè)流程模板。儀器需貼有相關(guān)設(shè)備標識，內(nèi)容應(yīng)包括：儀器型號、用途、使用狀態(tài)及檢查周期等信息。

2.2 實驗檢測操作流程依據(jù)《新生兒疾病篩查管理辦法》(衛(wèi)生部令第64號)及《新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范》(2010版)的規(guī)范要求[9-10]，實驗室檢測工作流程符合規(guī)范，并制定從樣本接收、報告解讀以及隨訪復查全流程環(huán)節(jié)的操作標準，見圖1[11-13]。

圖1 GC-MS實驗檢測操作流程

3 試 劑

3.1 試劑要求(1)實驗所需化學試劑均要求色譜級或以上；(2)配制各種試劑和標準溶液必須遵守操作規(guī)程，試劑配制完成后及時貼標注明試劑名稱、濃度、配制日期、批號、有效期和配置人；(3)試劑存管規(guī)范化：專人負責，分類存放，并定期檢查使用及余量情況。領(lǐng)用時需填寫記錄，過期或失效試劑經(jīng)審核后作報廢處理；(4)建立?；芳耙字贫驹噭┕芾沓绦?，分類專柜存放，由兩人以上人員保管，要填寫相關(guān)實驗記錄，保護人員安全[14]。

試劑組成：由尿素分解試劑、肟化反應(yīng)試劑、液液萃取試劑、衍生化試劑組成。(1)尿素分解試劑：尿素酶和超純水按照一定比例混合組成；(2)肟化反應(yīng)試劑：鹽酸羥胺、氫氧化鈉及鹽酸；(3)液液萃取試劑：主要采用色譜純乙酸乙酯；(4)衍生化試劑：N，O-雙(三甲基硅)三氟乙酰胺(含三甲基氯硅烷)(N,OBis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with Trimethylchlorosilane,BSTFA:TMC S=99:1)，如使用商品化檢測試劑盒，則按說明書進行相應(yīng)操作。

3.2 內(nèi)標內(nèi)標包含十七烷酸，托品酸，二十四烷，稀釋液采用色譜純乙酸乙酯，使用稀釋液將十七烷酸、托品酸和二十四烷配制為濃度分別為0.5mg/mL、0.5mg/mL和1mg/mL的混標溶液。選擇這三種內(nèi)標理由如下，首先常規(guī)尿液中含量極低，和代謝障礙沒有關(guān)聯(lián)，樣本前處理中硅烷化衍生后結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不與目標有機酸發(fā)生反應(yīng)，且儀器分析中出峰時間分布整個分析過程的前、中、后段。以十七烷酸作為定量內(nèi)標，目標物有機酸的峰面積和十七烷酸峰面積進行比值，得到半定量的結(jié)果；托品酸及二十四烷作為內(nèi)標質(zhì)控，可準確監(jiān)測樣本前處理和儀器分析是否符合質(zhì)控要求。

3.3 樣本尿液樣本：(1)干燥潔凈容器采集新鮮隨機中段尿液；(2)分裝至容量為10mL的帶蓋EP管中；(3)樣本量要求≥6mL(2mL 檢測；2mL 復檢；2mL 留樣)；(4)冰凍保存，冷鏈運輸至檢測機構(gòu)。

尿濾紙片[15]：(1)專用濾紙片三片(新華3號濾紙，規(guī)格4cm×4cm)完全浸透于尿液中；(2)樣本量要求≥6mL (2mL 檢測；2mL 復檢；2mL 留樣)；(3)浸泡時間≥15min，于干燥陰涼避光處晾干，密封儲存；(4)長期留樣則冷藏密閉保存(溫度≤-20℃)，建議優(yōu)先使用原始尿液進行檢測，尿濾紙片便于樣本長期保存和運輸，但尿濾紙片樣本分析過程中，由于增加了濾紙片制作及超純水復溶等流程，會造成不可預知的誤差[16]。

3.4 進樣前處理

3.4.1樣本準備 樣本前處理基于溶液進行，如采用尿濾紙片，則需要進行超純水復溶，流程如下：(1)取一片尿濾紙片，剪至1cm×1cm合計16個碎片，放置于10mL離心管中，加入2.5mL超純水，浸泡10min；(2)離心4000rpm，5分鐘后，取上清液(注意須無紙片殘渣)。

3.4.2 尿肌酐測定[17]尿肌酐為尿液中最穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物，本實驗需采用0.2mg當量尿肌酐的尿液進行分析，參考《尿中肌酐分光光度測定方法》(WS/T97-1996)標準，采用紫外可見分光光度計對尿液或尿濾紙片復溶液中的尿肌酐進行定量檢測。3.4.3 前處理 取0.2mg肌酐當量的尿樣后，進行前處理，流程包括除尿素、添加內(nèi)標、肟化、液液萃取、氮吹、衍生、轉(zhuǎn)移上機等。(1)加入尿素酶試劑，37℃恒溫孵育30分鐘，分解尿素，消除干擾；(2)加入內(nèi)標，純水定容至2mL；(3)加入肟化反應(yīng)試劑，室溫下肟化反應(yīng)20分鐘；(4)色譜純乙酸乙酯萃取2次，充分混勻后離心，轉(zhuǎn)移至上層有機相至干潔離心管；(5)60℃氮氣吹干，注意應(yīng)避免吹干過度造成降解；(6)加入衍生化試劑，70℃孵育30min；(7)待樣本溫度降至室溫后，轉(zhuǎn)移至進樣瓶內(nèi)插管，上機分析[18-20]。

3.5 儀器與軟件選擇

3.5.1儀器選擇 首選用于新生兒遺傳代謝病尿液有機酸的檢測儀器是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)。首先，該儀器配備的電子電離源(electron ionization，EI)是最常用的離子化模式，電離效率高，譜圖特征性和重復性好，通過碎片模式可得到大量的結(jié)構(gòu)信息，被90%的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀所采用。其次，四級桿質(zhì)量分析器適用于中小有機酸化合物的定性和定量分析，實驗人員可靈活配置和調(diào)用全掃描(full-scan)模式和選擇離子掃描(selected ion monitoring，SIM)模式，更好地服務(wù)于臨床實驗。最后，選擇氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀時，需考慮：(1)精密度、檢出限、離子化效率、離子源峰型、數(shù)據(jù)采集時間、分辨率、檢測效率、背景噪聲、靈敏度等；(2)儀器檢測通量，即每天可檢測的標本量；(3)其他因素：實驗室使用習慣、儀器成本等。

3.5.2 軟件選擇 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀需配備軟件系統(tǒng)，用于對檢測樣本進行數(shù)據(jù)分析。GC-MS尿液有機酸檢測專用軟件應(yīng)最大程度簡化數(shù)據(jù)分析流程，具備以下特征：(1)可操控檢測儀器(即自動進樣器、氣相色譜和質(zhì)譜)；(2)分析樣本中各種有機酸目標物與內(nèi)標的峰面積，同時計算出多種分析物的半定量結(jié)果；(3)將分析物濃度與設(shè)定的正常參考區(qū)間進行自動比較，顯示標注超出正常參考區(qū)間的結(jié)果；(4)檢測結(jié)果與患者信息自動匹配導出結(jié)果數(shù)據(jù)；(5)可快速批處理分析樣本檢測結(jié)果及單個樣本快速分析；(6)允許設(shè)置定量積分參數(shù)進行檢測結(jié)果校正[21]。

3.5.3 數(shù)據(jù)采集模式選擇 (1)全掃描采集模式(full scan)：在一定掃描質(zhì)量范圍(m/z)內(nèi)，對所有質(zhì)量離子按照從小到大的順序連續(xù)掃描，可以得到最大的信息量，并利用譜圖進行檢索。質(zhì)譜儀采集尿液中所有有機酸衍生物質(zhì)量數(shù)范圍建議為50～500m/z，掃描450個質(zhì)量離子，一次掃描循環(huán)時間為0.05s，每個質(zhì)量離子采集時間約0.11ms。采集時間需涵蓋所有目標物有機酸出峰時間，且需避過溶劑峰出峰后開始采集，這樣可以保護燈絲及檢測器，例如7.5～60min。(2)選擇離子掃描模式(selected ion monitoring，SIM)：在選擇離子掃描模式下，對選定的某個或數(shù)個特征質(zhì)量峰進行單離子或多離子檢測，獲得這些離子流強度隨時間的變化曲線的掃描。在一般情況下可用于已知檢測物質(zhì)的特征離子，質(zhì)譜圖不能用于譜庫檢索。選擇離子掃描方式只選擇2～3個特征離子，一次掃描循環(huán)時間同樣為0.05s,則每個質(zhì)量離子的采集時間為16.7ms，時間增加150倍，相較于全掃描模式單個離子檢測時間長、離子響應(yīng)高、靈敏度好，但檢測的離子數(shù)有限。

實現(xiàn)一次進樣完成尿液多種有機酸同時檢測，質(zhì)譜儀必須具備快速掃描、連續(xù)循環(huán)掃描和跳躍循環(huán)掃描的能力，以適應(yīng)GC-MS的全掃描采集(full scan)和選擇離子掃描模式(SIM),并確保足夠靈敏度，質(zhì)譜峰能進行譜庫檢索結(jié)合出峰時間雙重定性化合物。

3.5.4 儀器校驗 儀器調(diào)諧：儀器只有在密封性、質(zhì)量數(shù)、響應(yīng)度良好的條件下才能保證分析結(jié)果可靠，因此在首次裝機或進行維護后對氣質(zhì)聯(lián)用儀進行漏氣檢查及儀器調(diào)諧。打開燈絲，通過對水峰、氮氣峰、氧氣峰的比例，判定儀器是否存在漏氣，若漏氣需檢查進樣口端、載氣凈化單元、色譜柱接口部分等部位排除漏氣問題。不同品牌、型號的儀器調(diào)諧指標略有差異，以日本島津GC-MSQP2020為例，調(diào)諧指標有7點：(1)檢查m/z 69、m/z 219、m/z 502的FWHM(半峰寬)值是否在0.5～0.7之間；(2)檢查檢測器電壓是否有超過2kV；(3)檢查基峰值是否為質(zhì)荷比(m/z)18或69；(4)檢查質(zhì)荷比(m/z) 502的相對強度比率是否至少為2%；(5)檢查質(zhì)荷比(m/z) 69的峰強度是否至少是質(zhì)荷比(m/z) 28峰強度的兩倍；(6)檢查峰形是否有明顯的分叉，峰型是否對稱；(7)檢查質(zhì)荷比(m/z)理論值與實際測定值相差是否在0.1之內(nèi)。性能驗證：儀器只有在靈敏度、重現(xiàn)性等狀態(tài)良好的條件下才能保證分析結(jié)果的可靠。因此，在首次裝機或做完全面性維護后需要對氣質(zhì)聯(lián)用儀進行性能驗證。不同品牌、不同配置的儀器所使用的性能驗證標準品不同，以日本島津GC-MS-QP 2020為例，重復性性能驗證時，采用八氟萘(octafluoronaphthalene，OFN)100pg/μL，連續(xù)5個數(shù)據(jù)峰面積重現(xiàn)性CV%≤5.00%，保留時間重現(xiàn)性CV%≤1.00%；儀器檢測限(instrumental detection limit，IDL)測試采用使用OFN 100fg/μL，連續(xù)8個數(shù)據(jù)IDL≤10 fg；靈敏度(EI源)測試采用OFN 1pg/μL(1ppb)，高靈敏度模式下要求信噪比(signalnoise ratio，S/N)≥1500。若使用其他品牌與型號的儀器，校準需按照相應(yīng)的條件與標準來完成。儀器校準：每次檢測樣本前應(yīng)當對儀器進行校準。校準通常采用正構(gòu)烷烴混準液，根據(jù)正構(gòu)烷烴的保留指數(shù)及保留時間計算目標物有機酸實際保留時間，從而排除因保留時間漂移對目標物有機酸定性的影響，使檢測結(jié)果更準確。正構(gòu)烷烴混標原液使用正己烷按照一定比例稀釋至目標物濃度左右以獲得日常校準液，日常校準液一般作為每天第一個樣品進行檢測分析，無需經(jīng)過前處理，可直接上機分析。在檢測完成時，對其總離子流圖(TIC)峰形、離子強度和保留時間進行分析，用以評估儀器當前的性能狀態(tài)。記錄正構(gòu)烷烴保留時間，用于計算目標物有機酸的保留時間。目標有機酸的保留時間計算包含幾個變量，需要將這些變量錄入到數(shù)據(jù)處理軟件的方法文件中，方能實現(xiàn)目標物有機酸保留時間的自動計算，計算公式如下：RTT=RTcn+(RTcn+1-RTcn)*(RIT-RIcn)/(RIcn+1-RIcn)。注：RTT=目標組分保留時間；RIT=目標組分保留指數(shù)；RTcn=第n個組分保留時間；RIcn=第n個組分保留指數(shù)；RTcn+1=第n+1個組分保留時間；RIcn+1=第n+1個組分保留指數(shù)。

3.5.5 結(jié)果計算 目標物有機酸定性：(1)通過正構(gòu)烷烴校準液校正保留時間，根據(jù)目標物有機酸保留時間初步定性；(2)使用NIST譜庫或?qū)嶒炇易越ㄗV庫或商品化有機酸譜庫中的標準質(zhì)譜圖對目標物有機酸進行相似度檢索定性。目標物有機酸定量：通過測定有機酸目標物的峰面積與內(nèi)標物十七烷酸峰面積求得比值×100，得到半定量結(jié)果[15]。

3.6 檢驗程序確認和驗證遺傳代謝病尿液檢測的方法評估十分重要，用于確保目標樣本中有機酸的準確定性與定量。方法評估包含檢測方法調(diào)研、試劑采購、方法研發(fā)、檢驗程序確認及方法學驗證。新建立的檢測方法需具有先進性、科學性、準確性，應(yīng)進行嚴格的靈敏度、精密度、準確度、特異性及檢測范圍方法評價，以評估檢驗效能。用于驗證的實驗樣本為尿液或尿濾紙片復溶溶液，也可以是跨越可報告范圍的質(zhì)控品、標準品或者已完成檢測的已知樣本。如果該方法展示出如聲明一樣的檢測性能，則認為其通過“驗證”，可以用于臨床服務(wù)。如果實驗室修改了商業(yè)化體外診斷(in vitro diagnostic，IVD)試劑盒的操作方法，那么該方法應(yīng)被歸類為實驗室自建方法(laboratory developed tests，LDT)，在臨床應(yīng)用前需執(zhí)行完整的確認方案以建立性能指標。檢測指標及其分析參數(shù) 基于儀器方法，分析有機酸指標(見表1)，如果新增有機酸標記物，則可在如下表格中酌情增加并進行驗證。

表1 GC-MS檢測有機酸指標

?63 2-Propyl-5-hydroxy-pentanoic acid 2-丙基-5-羥基戊酸 304 64 3-methylglutaconic 3-甲基戊烯二酸 288 65 Isovalerylglycine 異戊酰甘氨酸 231 66 Butyrylglycine 丁酰甘氨酸 289 67 Malic acid 蘋果酸 350 68 Adipic acid 己二酸 290 69 Isovalerylglycine 異戊酰甘氨酸 303 70 2-Hexenedioic acid 2-己烯二酸 288 71 5-oxoproline 5-羥脯氨酸 273 72 3-methyladipic acid 3-甲基己二酸 304 73 Thiodiglycolic acid 亞硫基二乙酸 294 74 2-propylglutaric 2-丙基戊二酸 318 75 7-hydroxyoctanoic acid 7-羥基辛酸 304 76 5-hydroxy-methyl-2-furoic acid 5-羥甲基-2-糠酸 286 77 Tiglylglycine acid 巴豆酰甘氨酸 301 78 3-Methylcrotonylglycine 3-甲基巴豆酰甘氨酸 229 79 Tiglylglycine acid 巴豆酰甘氨酸 229 80 3-Methylcrotonylglycine 3-甲基巴豆酰甘氨酸 301 81 2-hydroxyglutaric acid 2-羥基戊二酸 364 82 3-hydroxyglutaric acid 3-羥基戊二酸 364 83 Phenyllactic acid 苯乳酸 310 84 Pimelic acid 庚二酸 304 85 3-hydroxy-3-methylglutaric acid 3-羥基-3-甲基戊二酸 378 86 3-hydroxy-phenylacetic acid 3-羥基苯乙酸 296 87 2-ketoglutaric(1) 2-酮戊二酸(1) 377 88 4-hydroxy-benzoic acid 4-羥基安息香酸 282 89 4-hydroxy-phenylacetic acid 4-羥基苯乙酸 296 90 2-ketoglutaric(2) 2-酮戊二酸(2) 377 91 Hexanoylglycine 己酰甘氨酸 317 92 Phenylpyruvic acid 苯丙酮酸 323 93 N-Acetylaspartic acid N-乙酰天冬氨酸 319 94 2-hydroxy-adipic acid 2-羥基己二酸 378 95 Octenedioic acid 辛烯二酸 316 96 3-hydroxy-adipic acid 3-羥基己二酸 378 97 Suberic acid 辛二酸 318 98 3-methylglutaconic(4) 3-甲基戊烯二酸(4) 360 99 2-Keto-adipic acid 2-酮己二酸 391 100 Aconitic acid 烏頭酸 390 101 Orotic acid 乳清酸 372 102 Vanillic acid 香草酸 312 103 Homovanillic acid(HVA) 高香草酸 326 104 Azelaic acid 壬二酸 332 105 Hippuric acid 馬尿酸 323 106 Isocitric acid 異枸櫞酸 480 107 Citric acid 枸櫞酸 480 108 Homogentisic acid 尿黑酸 384 109 Hippuric acid-1 馬尿酸 251 110 Methylcitric acid(1) 甲基枸櫞酸(1) 494 111 3-(3-hydroxy-phenyl)-3-hydroxy-propionic acid 3-(3-羥苯基)-3-羥基丙酸 398 112 Methylcitric acid(2) 甲基枸櫞酸(2) 494 113 3-hydroxy-octenedioic acid 3-羥基辛烯二酸 404 114 3-hydroxy-suberic acid 3-羥基辛二酸 406 115 Vanillymandelic acid(VMA) 香草扁桃酸 414 116 Sebacic acid 癸二酸 346 117 Decadienedionic acid 癸二烯酸 342 118 4-hydroxy-phenyllactic acid(PHPLA) 4-羥基苯乳酸 398 119 4-OH-phenylpyruvic 4-羥基苯丙酮酸 411 120 2-hydroxy-hippuric acid 2-羥基馬尿酸 411 121 Indole-3-acetic acid 吲哚-3-乙酸 319 122 Suberylglycine acid 辛二酰甘氨酸 375 123 Palmitic acid 棕櫚酸 328 124 2-hydroxy-sebacic acid 2-羥基癸二酸 434 125 3-hydroxy-sebacic acid 3-羥基癸二酸 434 126 2-hydroxy-hippuric acid 2-羥基馬尿酸 339 127 Dodecanedioic acid 十二烷二酸 374 128 N-acetyl-tyrosine acid N-乙酰酪氨酸 439 129 Uric acid 尿酸 456 130 3，6-Epoxydodecanedioic acid 3，6-環(huán)氧-十二烷二酸 388 131 3-hydroxy-dodecanedioic acid 3-羥基-十二烷二酸 462 132 3，6-Epoxytetradecanedioic acid 3，6-環(huán)氧-十四烷二酸 416

4 切 值

切值建立與評估：每個實驗室應(yīng)建立本實驗室尿液多種有機酸檢測的切值，在指定的一段時間內(nèi)，執(zhí)行建立好的實驗流程，大量檢測樣本，獲得數(shù)據(jù)，結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜檢測結(jié)果及基因確診實驗結(jié)果進行定期評估，以驗證切值確立的正確性與合理性[22]。

4.1 切值建立切值建立應(yīng)符合以下步驟：(1)方法確認：對已建立好的氣質(zhì)尿液有機酸檢測方法進行確認，通過確認的方法才能用于檢測切值建立。(2)樣本分析：收集2000例以上健康嬰兒樣本及一定數(shù)量的陽性嬰兒樣本進行數(shù)據(jù)結(jié)果分析，樣本根據(jù)年齡段分為新生兒期及非新生兒期。一些檢測指標在新生兒中的檢測切值與非新生兒有差異，故需要分別建立不同濃度切值。(3)切值驗證：實驗室初次建立的切值需與其它實驗室及已發(fā)表的文獻切值對比，若實驗室新建立的切值與國內(nèi)其它實驗室切值結(jié)果相差較大時，需要分析原因，給予合理解釋。(4)切值計算：推薦采用百分位數(shù)法計算切值，以排除檢測指標濃度值非正態(tài)分布的影響。百分位數(shù)范圍從98.0%～99.9%，具體取決于檢測指標在疾病組和正常組分布的重疊情況。

4.2 切值評估設(shè)定實驗檢測切值需持續(xù)評估驗證。人體代謝檢測指標可受多種因素影響：例如藥物、特殊食物的攝入、疾病發(fā)展階段差異等情況。故需綜合分析待檢測人員情況制定合適切值，盡可能降低假陽性及假陰性率的發(fā)生。當儀器型號、品牌、方法學、試劑發(fā)生更換或檢測人群發(fā)生改變時，應(yīng)當重新評估檢測指標。

5 實驗室質(zhì)量控制

5.1 室內(nèi)質(zhì)量控制(1)通過內(nèi)標質(zhì)控化合物二十四烷和托品酸實際保留時間、與十七烷酸峰面積比值，監(jiān)測整個樣本檢測流程。(2)質(zhì)控品的基質(zhì)需為正常尿液，至少設(shè)定兩個濃度值，濃度區(qū)間需包含目標化合物的切值。(3)質(zhì)控品穩(wěn)定性要求：通過商品化途徑購買的質(zhì)控品，其產(chǎn)品說明書中需標明靶值及適用范圍、生產(chǎn)批號、有效期。實驗室自配質(zhì)控品需標注生產(chǎn)批號、生產(chǎn)日期、有效日期，-20℃以下冷凍保存。進行穩(wěn)定性實驗連續(xù)監(jiān)測，確保質(zhì)控品中化合物無降解情況，并建立每批次靶值及質(zhì)控限。(4)質(zhì)控品評價：購買的商品化質(zhì)控品及實驗室自制質(zhì)控品在日常檢測前需進行質(zhì)控品合格評估：外觀評估：質(zhì)控品是否完全溶解，有無沉淀物。性能評估：進行多次質(zhì)控測試(≥20次)，計算平均值和標準偏差，按照質(zhì)控可接受標準進行評價，評價不符合項需棄用重配。(5)質(zhì)控規(guī)則：實驗室應(yīng)建立適用的質(zhì)控規(guī)則用來監(jiān)控隨機誤差和失控原因。選擇Westgard多規(guī)則質(zhì)控技術(shù)有6個質(zhì)控規(guī)則，其中有些規(guī)則對隨機誤差敏感，有些對系統(tǒng)誤差敏感，由此可提高系統(tǒng)誤差的檢出概率。繪制質(zhì)控圖每次質(zhì)控結(jié)果做好質(zhì)控記錄。(6)質(zhì)控規(guī)則與偏移：依據(jù)每次質(zhì)控實驗記錄繪制Westgard多規(guī)則質(zhì)控表，判斷誤差偏移類型和失控原因的關(guān)系，采取從易到難的糾正措施，必要時重新制作檢測質(zhì)控樣本。(7)質(zhì)控月度回顧：每月進行至少一次室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果統(tǒng)計，計算平均值、方差和標準變異系數(shù)，對出現(xiàn)明顯的偏差趨勢或位移變化需要分析原因并采取相應(yīng)措施。(8)TIC圖譜：數(shù)據(jù)分析時觀察TIC圖譜，重點觀察樣本信號強度，內(nèi)標峰是否正確出峰，基線是否有漂移，是否出現(xiàn)異常雜峰，判斷質(zhì)譜運行無異常。(9)健康人群統(tǒng)計：實驗室對健康人群分析物結(jié)果數(shù)據(jù)進行監(jiān)測，每個化合分析物的平均值在每次實驗條件不變的情況下計算，得到數(shù)據(jù)累計平均值及標準方差，將單次結(jié)果與累計數(shù)據(jù)展開對比，若本次結(jié)果超出累計數(shù)據(jù)結(jié)果，則表明本次實驗過程可能出現(xiàn)偏差，問題點可能發(fā)生在檢測試劑成分或使用環(huán)節(jié)錯誤、尿濾紙片的收集或復溶錯誤、尿肌酐濃度測定誤差，或樣本運輸保存環(huán)節(jié)錯誤。發(fā)現(xiàn)問題應(yīng)即時遵從質(zhì)量控制糾錯方案執(zhí)行改正優(yōu)化工作。[23-26]

5.2 室間質(zhì)量評價室間質(zhì)量評價(EQA，external quality assessment)是我國衛(wèi)生行政主管部門和醫(yī)院管理者對實驗室質(zhì)量實施監(jiān)督的重要方法。其中NCCL-E-25 新生兒遺傳代謝病氣質(zhì)聯(lián)用檢測尿液有機酸室間質(zhì)量評價項目是由國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心發(fā)起的室間質(zhì)量評價活動。評價項目為各有機酸的峰面積與內(nèi)標物十七烷酸峰面積的比值×100 的結(jié)果，內(nèi)標物采用十七烷酸，質(zhì)控品采用正二十四烷和托品酸。檢測目標物甄選八種與遺傳代謝病高度相關(guān)的特征有機酸，分別為3-羥基丙酸、甲基丙二酸、戊二酸、琥珀酰丙酮、3-羥基-3-甲基戊二酸、4-羥基苯乳酸、2-羥基異戊酸、2-羥基異己酸。這8種有機酸目標物與遺傳代謝病關(guān)聯(lián)性表述如下：(1)3-羥基丙酸升高在遺傳代謝病中需注意丙酸血癥、甲基丙二酸血癥、多種羧化酶缺乏癥，結(jié)合其它有機酸綜合分析確診疾病。3種遺傳代謝病在罕見病中綜合發(fā)病率高。(2)甲基丙二酸升高在遺傳代謝病中需注意甲基丙二酸血癥、維生素B12不足或葉酸缺乏，臨床醫(yī)生應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗判斷患兒是否患有甲基丙二酸血癥采取正確治療方案。(3)戊二酸升高在遺傳代謝病中需注意戊二酸血癥1型、戊二酸血癥2型、2-酮己二酸血癥、3-羥基-3-甲基戊二酸血癥，結(jié)合其它有機酸綜合分析確診疾病。戊二酸是戊二酸血癥的特異性指標可根據(jù)戊二酸升高倍數(shù)判斷患兒戊二酸血癥類型采取正確治療方案。(4)琥珀酰丙酮升高在遺傳代謝病中需注意酪氨酸血癥Ⅰ型，琥珀酰丙酮是酪氨酸血癥1型特異性指標結(jié)合血氨基酸檢測結(jié)果可確診疾病，盡快采取正確治療方案。(5)3-羥基-3-甲基戊二酸升高在遺傳代謝病中需注意3-羥基-3-甲基戊二酸血癥，3-羥基-3-甲基戊二酸是3-羥基-3-甲基戊二酸血癥特異性指標，尿液多種有機酸結(jié)果升高可確診疾病，盡快采取正確治療方案。(6)4-羥基苯乳酸升高在遺傳代謝病中需注意Zellweger綜合癥、高酪氨酸血癥Ⅰ型、新生兒短暫性高酪氨酸血癥、嚴重肝損傷結(jié)合其它有機酸綜合分析確診疾病。在檢測的樣本中4-羥基苯乳酸較常升高，其中大部分為肝損傷患兒。(7)2-羥基異戊酸與2-羥基異己酸均為楓糖尿癥特異性指標結(jié)合血氨基酸檢測結(jié)果可確診疾病，盡快采取正確治療方案。

質(zhì)量評價方案：新生兒遺傳代謝病氣質(zhì)聯(lián)用檢測尿液有機酸室間質(zhì)量評價方案，采用8種可為遺傳代謝病篩查與診斷提供重要臨床信息的有機酸。按5個濃度水平配比，每年2次活動檢測定量結(jié)果。根據(jù)各實驗室結(jié)果進行分組統(tǒng)計，計算出總均值。按照規(guī)范剔除離群值后再計算不同測定方法及儀器型號的均值作為該組方法的靶值。采用國際上通行的評價方式，即靶值±允許總誤差。

參與調(diào)查實驗室可根據(jù)本驗室的自身情況進行評價：中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準WS/T492-2016《臨床檢驗定量測定項目精密度與正確度性能驗證》，分別計算參與調(diào)查各實驗室的批內(nèi)方差、批間方差、總方差，以及實驗室內(nèi)變異系數(shù)。

6 檢測指標的臨床意義

6.1結(jié)果解釋 現(xiàn)階段氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法可同時檢測尿液中130多種有機酸，可提示幾十種遺傳代謝性疾病。該方法首先通過一定樣本量的檢測結(jié)果建立特定疾病關(guān)鍵生物標志物的切值(見表2)，然后以切值為依據(jù)，對患者的檢測值進行結(jié)果判斷。

表2 尿液GC-MS檢測目標疾病與生物標志物對應(yīng)表

結(jié)果解釋需結(jié)合患者其他檢測項目結(jié)果綜合考慮，例如干血斑濾紙片串聯(lián)質(zhì)譜檢測、基因檢測等。另外還需考慮嬰兒的臨床表征以及在采集時的年齡，藥物治療狀況，飲食狀況，體重及其他因素，綜合分析，給出合理解釋。

6.2 結(jié)果報告結(jié)果報告無論是陰性或陽性，均需符合以下患者報告信息模板：(1)患者姓名或父母姓名；(2)患者出生日期；(3)患者性別；(4)送檢單位名稱；(5)住院編號或?qū)嶒炇揖幪枺?6)樣本采集日期和時間；(7)樣本類型；(8)實驗室信息；(9)樣本接收與檢測日期；(10)檢測結(jié)果發(fā)布日期；(11)檢測人員及報告審核人員；(12)定量檢測結(jié)果；(13)解釋與結(jié)論[27]。

相較于傳統(tǒng)單病種新生兒遺傳代謝病篩查技術(shù)，氣質(zhì)聯(lián)用檢測尿液有機酸技術(shù)可同時進行多種遺傳代謝病篩查，是一項更為繁瑣復雜的系統(tǒng)性工程，要求更先進的檢測儀器、方法和更專業(yè)的技術(shù)人員[28-30]。檢測目標物的增多，對檢測質(zhì)量控制、不同實驗室間檢測結(jié)果可比性等提出了更大的挑戰(zhàn)[28]。制定本共識旨在規(guī)范不同檢測實驗室的檢測方案，提高檢測結(jié)果一致性，并督促各檢測實驗室加強質(zhì)量管理，提供標準化、同質(zhì)化的檢測服務(wù)。

執(zhí)筆者：楊江濤 江劍輝 曾偉宏 田國力 趙明

專家組成員：北京醫(yī)院國家老年醫(yī)學中心/國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心/北京市臨床檢驗工程技術(shù)研究中心(王治國，何法霖，王薇)；廣東省婦幼保健院廣東省新生兒遺傳代謝病篩查中心(江劍輝，曾偉宏)；深圳愛灣醫(yī)學檢驗實驗室(楊江濤，趙明，孫智勇，黃麗娟)；上海市兒童醫(yī)院(田國力，鄒琳)；上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院(韓連書)；貴州省疾病預防控制中心婦幼保健所(張宏紅)；湖北省婦幼保健院(王維鵬)；三亞市婦幼保健院(王潔)；浙江大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)院(曲一平，尚世強，黃新文)；福建省新生兒篩查中心(朱文斌)；青島市婦女兒童醫(yī)院(李文杰)；山東省青島大學附屬醫(yī)院 (劉世國)；寧波市婦女兒童醫(yī)院(陳意振)；四川省婦幼保健院新生兒篩查中心(歐明才)；山東省婦幼保健院(周玉俠)；廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院(范歆)；鄭州大學第三附屬醫(yī)院(河南省婦幼保健院)(趙德華)；湖南省婦幼保健院(唐華)；徐州市婦幼保健院(顧茂勝)；梅州市婦幼保健院(黃爍丹)；廈門市婦幼保健院(周裕林)；廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院(黎青)；云南省婦幼保健院(顧菀茜)；陜西省婦幼保健院新生兒篩查中心(強榮)；北京大學第一醫(yī)院(楊艷玲，宋金青，李夢秋，金穎)；中國科學院大學深圳醫(yī)院(光明)(吳本清，諶玉佳)