羅龍輝，張興楠，孟 芳，黃裕鑫，劉吉平

(華南農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院, 廣東 廣州 510642)

桑樹Morus alba是多年生木本植物，廣泛分布于亞洲、非洲、歐洲等地區(qū)，具有良好的經(jīng)濟效益[1]?，F(xiàn)代的蠶桑產(chǎn)業(yè)不再拘泥于傳統(tǒng)的“種桑養(yǎng)蠶”，更多的是朝著蠶桑資源綜合利用的方向發(fā)展[2-3]，以蠶桑產(chǎn)業(yè)作為扶貧項目的手段已經(jīng)在我國廣西、云南等地廣泛實施。隨著蠶桑產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，桑樹的種植面積也不斷擴大，但作為蠶桑產(chǎn)業(yè)基石的桑樹卻受到諸多病害的影響，尤其是桑樹真菌性病害嚴重影響了桑葉的質(zhì)量與產(chǎn)量。

桑樹褐斑病與桑輪紋病同屬于桑樹2種主要的真菌性病害。桑褐斑病主要癥狀為桑樹葉片出現(xiàn)褐色斑點，病原菌為黏隔孢Septogleum mori和褐斑殼豐孢Phloeospora maculans2 種病原真菌[4-5]。Hong等[6]研究認為黏隔孢與褐斑殼豐孢屬于同種異名。2017年，Videira等[7]將二者名稱統(tǒng)一更正為如今的新褐斑殼豐孢Neophloeospora maculans。桑褐斑病分布廣泛，在巴西、土耳其及印度等地均有報道[8-10]，桑感染褐斑病后桑葉中的主要營養(yǎng)成分含量會顯著降低，對家蠶的消化吸收率、蟲蛹生命率均有影響[11]。與褐斑病導(dǎo)致的癥狀類似，桑輪紋病的主要癥狀為桑葉出現(xiàn)輪紋型斑塊[12],主要病原菌為膝節(jié)霉Gonatophragmium triuniae。該病原菌寄主有?？粕俸蜔o花果屬等共15科22屬的木本和草本植物，危害嚴重[13]。桑褐斑病與桑輪紋病病原菌具有較強的生命活力，尤其是輪紋病病原菌膝節(jié)霉，菌絲的致死溫度可達到85 ℃[14]。不僅如此，褐斑病與輪紋病病原菌均以分生孢子盤遺落在病葉或者土壤中，可長期存活，待適宜條件又可侵染桑樹，導(dǎo)致病害的大面積爆發(fā)[4]。目前，對2種病害病癥的識別主要是通過肉眼觀察法，但桑葉上觀測到2種病害癥狀的時候，病原菌的增殖已達到一定數(shù)量，給病害的防控工作帶來極大的困擾。因此，如何建立一種快速、準確的桑樹褐斑病與輪紋病病原菌的檢測技術(shù)是桑褐斑病與輪紋病早期防控的關(guān)鍵。

常見的植物病原菌核酸檢測方法主要有聚合酶鏈式反應(yīng) (Polymerase chain reaction，PCR)擴增法[15]、實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(Real-time quantitative PCR，qPCR)擴增法[16]、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增 (Loop mediated isothermal amplification，LAMP)法等[17]。目前，對桑樹病害的檢測多為普通PCR和LAMP檢測[18-19]，不同的檢測技術(shù)各有優(yōu)勢，但多局限于對單個病原的檢測。對于多種病原菌復(fù)合侵染的情況，或?qū)τ诎Y狀相似的病害，目前還鮮有較實用的快速檢測方法，且針對于桑輪紋病和桑褐斑病2種危害嚴重的桑樹真菌病害仍需相應(yīng)的檢測技術(shù)。多重PCR技術(shù)是指在同一個反應(yīng)體系中加入2對或2對以上的引物，可以同時擴增出2組或2組以上的核酸片段，實現(xiàn)多種病原菌的快速檢測[20]。本研究建立了桑褐斑病與桑輪紋病病原菌的多重PCR檢測技術(shù)，為桑樹真菌性病害的防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

2019—2021 年從廣東、廣西、云南和陜西主要種桑地區(qū)不同品種上采集褐斑病和輪紋病病樣共250份，樣本詳細信息見表1。

表1 樣本材料收集信息Table 1 Sample material collection information

1.2 供試真菌與試劑耗材

主要病原菌：新褐斑殼豐孢N.maculans與膝節(jié)霉G.triuniae等均分離保藏于亞太地區(qū)蠶桑培訓中心。

其他真菌：致密鏈格孢Alternaria compacta、黑鏈格孢A.solani、棒狀孢子菌Corynespora cassiicola、博寧炭疽菌Colletotrichum boninese、木賊鐮刀菌Fusarium equiseti、禾谷鐮刀菌F.graminearum、膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides、暹羅炭疽菌Colletotrichum siamense等均分離保藏于亞太地區(qū)蠶桑培訓中心。

Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、植物總DNA提取試劑盒購于生工生物工程(上海)股份有限公司，T3 PCR Mix、高純度低電滲瓊脂糖、DL 2000 DNA marker、TS-GelRed 核酸凝膠染料、1×TBE速溶顆粒均購于北京擎科生物科技有限公司，電泳儀 (Powerpac Basci )采購于伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司，PCR儀(A200)采購于杭州朗基科學儀器有限公司，超微分光光度計(NDlife)和全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(Tanon-120)采購于廣州譽維生物科技儀器有限公司。

1.3 病菌、病樣及健康桑樹DNA的提取

供試真菌總DNA提取采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒。供試樣本總DNA提取采用植物總DNA抽提試劑盒。提取后的DNA用分光光度計測量DNA的濃度，使DNA的D260nm/D280nm控制在 1.8～2.0，質(zhì)量濃度為 1 ng/μL 左右。

1.4 多重PCR引物設(shè)計及特異性測定

根據(jù)多重PCR的反應(yīng)原理，采用引物對ITS1/ITS4[21]對新褐斑殼豐孢與膝節(jié)霉的核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (Internal transcribed spacer)進行擴增，擬擴增片段大小為560 bp左右，經(jīng)比較NCBI數(shù)據(jù)庫中新褐斑殼豐孢與膝節(jié)霉的核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列與2種病原菌的測序結(jié)果,使用DNAMAN軟件和Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計特異性引物對 HBF6 (5′-GACCTCCAACCCCCTGTG-3′)/HBR6(5′-CGCGACTCTTCAGCGACATA-3′) 和LWF2(5′-CCTTTGCACAACCGTATCCC-3′)/LWR2(5′-GACATGCTCCCTGGAGAACC-3′),并通過Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)查詢引物的具體參數(shù)及特異性。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以“1.3”中提取的新褐斑殼豐孢與膝節(jié)霉DNA為陽性對照，以健康桑葉總DNA 為空白對照，以“1.2”中其他真菌的DNA為陰性對照，進行多重PCR擴增，驗證引物的特異性。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。

1.5 多重PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

多重PCR反應(yīng)體系為25 μL 擴增體系：T3 PCR Mix 22 μL,引物 HBF6/HBR6 和 LWF2/LWR2 各 1 μL、DNA 模板 1 μL。擴增程序：98 ℃預(yù)變性 4 min；98 ℃ 變性 10 s，56 ℃ 退火 10 s，72 ℃延伸 15 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 延伸 2 min，于 4 ℃ 保存。取PCR產(chǎn)物在110 V下經(jīng)過12 g/L 瓊脂糖凝膠電泳30 min，用凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。

按照 T3 PCR Mix試劑盒說明，當引物LWF2/LWR2達到試劑盒使用濃度時（用量1 μL，在 25 μL PCR 體系中濃度為 0.4 mmol/L），電泳結(jié)果中已出現(xiàn)明亮條帶，因此確定LWF2/LWR2的用量為1 μL。在這基礎(chǔ)上，對引物HBF6/HBR6用量進行優(yōu)化，分別加入 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μL 的初始濃度為 10 μmol/L 的引物 HBF6/HBR6，確定引物最終用量后，將2對引物加入同一體系中，待測病原菌新褐斑殼豐孢與膝節(jié)霉的DNA模板各1 μL，進行不同的退火溫度(55～65 ℃)(儀器自設(shè))最優(yōu)條件探究，產(chǎn)物經(jīng)過12 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，根據(jù)全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)中條帶的亮度選擇最優(yōu)參數(shù)。

1.6 多重PCR靈敏度分析

將“1.3”提取的桑褐斑病病原菌新褐斑殼豐孢與桑輪紋病病原菌膝節(jié)霉的DNA質(zhì)量濃度分別梯度稀釋為 1 000、 100、 10、1、0.1、0.01、0.001 pg/μL，采用“1.5”最佳擴增體系及程序進行擴增，取病原菌新褐斑殼豐孢及膝節(jié)霉 DNA模板各1 μL加入同一體系中，根據(jù)全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)中有無目的條帶判斷該多重PCR的靈敏度。

1.7 多重PCR田間樣本檢測

對部分收集的田間病樣提取總DNA，以健康樣本DNA為陰性對照。根據(jù)最優(yōu)的多重PCR反應(yīng)體系進行PCR擴增，檢測45份田間病樣DNA是否存在新褐斑殼豐孢與膝節(jié)霉。最后根據(jù)全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)中有無目的條帶判斷其對應(yīng)的病原菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 多重PCR檢測的特異性

經(jīng)過引物篩選，本研究確定了引物組HBF6/HBR6 和LWF2/LWR2，設(shè)計的新褐斑殼豐孢特異引物HBF6/HBR6擴增出的目的片段大小為406 bp(圖1A)；膝節(jié)霉特異引物LWF2/LWR2擴增出的目的片段大小為248 bp(圖1B)，2組引物只對陽性待測菌進行特異性擴增，且條帶明亮單一，而空白對照及其他8種陰性對照真菌無法擴增出目的條帶，且PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果與目的基因一致，表明本研究設(shè)計的引物HBF6/HBR6 和LWF2/LWR2具有良好的特異性。

圖1 HBF6/HBR6 (A) 和LWF2/LWR2 (B)引物特異性檢測結(jié)果Fig.1 The specificity detection results using primer sets HBF6/HBR6 (A) and LWF2/LWR2 (B)

2.2 多重PCR擴增體系的優(yōu)化與建立

多重PCR擴增體系優(yōu)化結(jié)果顯示，引物組HBF6/HBR6 和 LWF2/LWR2 在 25 μL 的反應(yīng)體系中用量分別為 0.6 μL(0.24 mmol/L)和 1.0 μL(0.40 mmol/L)時，多重PCR的檢測結(jié)果最好，條帶最亮(圖2)。其次，根據(jù)引物退火溫度的篩選結(jié)果(圖3)，2組混合引物的最佳退火溫度為59 ℃。因此，確定最優(yōu)的多重 PCR 反應(yīng)體系為：T3 PCR Mix 21.7 μL、10 μmol/L 引物 HBF6/HBR6 各 0.6 μL、LWF2/LWR2 各 1.0 μL、DNA 模板 1 μL；最佳的擴增程序的退火溫度為59 ℃。利用最優(yōu)條件對2種病原菌DNA進行擴增，當只存在新褐斑殼豐孢N.maculans時，僅檢測到1條大小為406 bp的條帶；當只存在膝節(jié)霉G.triuniae時，僅檢測到1條大小為248 bp的條帶；當存在2種病原菌的時候可以同時檢測到上述2種條帶(圖4)。表明本研究經(jīng)優(yōu)化的多重PCR檢測方法可靠。

圖2 HBF6/HBR6 引物用量篩選結(jié)果Fig.2 HBF6/HBR6 primer dosage test results

圖3 多重PCR退火溫度篩選結(jié)果Fig.3 Screening results of multiplex PCR annealing temperature

圖4 多重PCR體系對2種病原菌的擴增效果Fig.4 Amplification results of two pathogenic fungus by multiplex PCR system

2.3 多重PCR檢測的靈敏度

經(jīng)過“2.2”優(yōu)化后多重PCR體系檢測不同質(zhì)量濃度的新褐斑殼豐孢與膝節(jié)霉混合DNA，結(jié)果表明新褐斑殼豐孢與膝節(jié)霉DNA最低檢測限分別達 0.1 和 1.0 pg/μL(圖5)。說明本研究建立的多重PCR體系靈敏度較高，可用于桑輪紋病與褐斑病早期菌量較少時的檢測。

圖5 多重PCR體系對2種病原菌的靈敏度檢測結(jié)果Fig.5 Sensitivity detection results of two pathogenic fungus by multiple PCR system

2.4 桑褐斑病及桑輪紋病田間樣品的檢測結(jié)果

采用“2.2”優(yōu)化的反應(yīng)體系及程序?qū)λ占?50份田間病樣隨機抽取45份加以檢測，結(jié)果(圖6、圖7)顯示，在廣東省英德蠶種場與廣西隆林縣的桑輪紋病病樣中均檢測到膝節(jié)霉，未檢測到新褐斑殼豐孢，表明該桑輪紋病樣本主要病原菌為膝節(jié)霉，未出現(xiàn)2種病原菌復(fù)合侵染的情況；而在廣西隆林縣收集的桑褐斑病病樣中，不僅檢測到新褐斑殼豐孢，也有部分檢測到膝節(jié)霉，表明在廣西隆林縣收集的桑褐斑病病樣中有輪紋病病原菌的存在，而在其他地區(qū)收集的多份桑褐斑病病樣中，唯有陜西石泉縣的1份樣本和陜西漢陰縣的1份樣本中檢測到2種病原菌，其余的均只檢測到新褐斑殼豐孢1種病原菌；部分病樣未檢測到新褐斑殼豐孢與膝節(jié)霉，出現(xiàn)了空白條帶，推測可能在取樣或DNA的提取過程中未提取到病原菌的DNA，其次，部分桑樹真菌病害的特征與桑褐斑病非常相似，導(dǎo)致出現(xiàn)了桑樹病害的誤判。綜上，本研究建立的多重PCR檢測方法特異性好、靈敏度高，能應(yīng)用于桑樹褐斑病與桑樹輪紋病病原菌的檢測。

圖6 桑樹桑輪紋病病原菌的多重PCR檢測結(jié)果Fig.6 Multiplex PCR detection results of mulberry ring leaf spot disease pathogen

圖7 桑樹褐斑病病原菌的多重PCR檢測結(jié)果Fig.7 Multiplex PCR detection results of mulberry brown spot disease pathogen

3 討論與結(jié)論

桑樹輪紋病與桑樹褐斑病危害嚴重，目前鮮見相關(guān)病原菌的檢測方法，而開發(fā)適用于桑樹褐斑病與輪紋病病原菌的檢測技術(shù)，是防控這2種病害的關(guān)鍵。桑樹病原菌的檢測方法分為傳統(tǒng)鑒定法及分子生物學鑒定法，傳統(tǒng)的鑒定方法以形態(tài)學觀察為主，因為觀察者的主觀臆斷易有較大的誤差，只能大體判斷病原菌的類群。隨著分子生物學的發(fā)展，多種核酸檢測技術(shù)得到開發(fā)與應(yīng)用。但多重PCR因具有提高檢測通量的優(yōu)點，而被廣泛運用于臨床上病原菌和轉(zhuǎn)基因作物的檢測。如Egea等[22]基于多重PCR檢測技術(shù)設(shè)計的反應(yīng)可用于呼吸道感染的急性細菌性腦膜炎病原菌的診斷；邢珍娟等[23]應(yīng)用多重熒光PCR快速篩查玉米中轉(zhuǎn)基因成分。不僅如此，多重PCR檢測技術(shù)也被運用于植物病原檢測，楊怡華等[24]建立的巢式多重PCR可以快速檢測麥冬2種常見的真菌性病原炭疽菌Colletotrichum liriopes和互隔交鏈孢菌Alternaria alternata；李明駿等[25]建立了5種玉米病毒的多重PCR檢測體系，極大地提高了玉米病毒的檢測效率。本研究建立了桑輪紋病與桑褐斑病2種病原菌的多重PCR檢測方法，可以通過一步法對2種常見的桑樹病原菌進行快速檢測，具有良好的可操作性。

本研究分別以膝節(jié)霉與新褐斑殼豐孢的ITS序列為靶基因進行了特異性引物設(shè)計與篩選，最終確定了HBF6/HBR6 和LWF2/LWR2引物組合作為桑褐斑病與輪紋病的最終檢測引物。通過對2種病原真菌及其他從桑葉上分離真菌的多重PCR檢測結(jié)果表明，本研究建立的多重PCR檢測技術(shù)，同時檢測2種病原菌新褐斑殼豐孢和膝節(jié)霉的DNA檢出限分別達0.1和1.0 pg/μL，且非目標菌株以及空白對照都沒有檢測到特異性擴增，表明本研究建立的桑褐斑病與桑輪紋病多重PCR檢測技術(shù)具有良好的靈敏度與特異性。本研究優(yōu)化了其他相關(guān)的反應(yīng)參數(shù)與條件，建立了桑輪紋病與桑褐斑病的多重PCR檢測技術(shù)，可以對2種病原菌進行快速、準確、有效的檢測。

本研究建立的多重PCR檢測方法整個流程可在4 h內(nèi)完成，極大地節(jié)約了時間和經(jīng)費開支，并且具有特異性強和靈敏度高的優(yōu)點，可應(yīng)用于桑輪紋病與桑褐斑病的準確鑒定。本研究建立的多重 PCR體系在田間樣本實際檢測中，檢出率達到91.4%，有較高的準確率與可操作性。其次，本研究在對部分癥狀類似于桑褐斑病與桑輪紋病的病樣進行檢測時，并未檢測到膝節(jié)霉與新褐斑殼豐孢，推測部分葉斑狀病樣的病癥雖與褐斑病相似，但是為不同的病原菌侵染所致，已有部分報道驗證這一推測，如關(guān)于炭疽病的報道[26]。因此，在對桑樹褐斑病與輪紋病的檢測過程中，需結(jié)合其他病原菌的核酸特性，對所檢測病害加以分析?？傊?，本研究建立的膝節(jié)霉與新褐斑殼豐孢的檢測方法，既可用于桑輪紋病與褐斑病的快速確診，也可以用于桑園中2種病害早期的病原篩查，具有較強的實用性，為桑樹真菌性病害的防控建立了基礎(chǔ)。