陳健鑫，魏玉倩，劉 麗，張東華，馬煥成，伍建榕,

(1 云南省高校森林災害預警控制重點實驗室/西南林業(yè)大學 生物多樣性保護學院, 云南 昆明 650224； 2 西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點實驗室/西南林業(yè)大學 林學院, 云南 昆明 650224)

油茶Camellia oleifera是一種重要的油料作物，在我國有長遠的種植和栽培歷史，被廣泛地栽植于我國14個省(區(qū))，具有重要的經(jīng)濟價值。其種子含油率高，富含不飽和脂肪酸以及多酚、黃酮、原花青素等活性物質，是一種高質量、耐儲存的健康食用油[1-2]；其活性化合物能調節(jié)血脂水平，降低腦血管疾病的發(fā)生。此外，油茶及其副產(chǎn)品是多種工業(yè)制品的原材料，其發(fā)酵物可制備綠色無公害農(nóng)藥[3-4]。

單一品種油茶的集約化栽植、良種選育滯后及栽培管護技術落后均導致油茶病蟲害發(fā)生嚴重，其中炭疽病的發(fā)生嚴重制約著云南省油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[5]。炭疽病菌Colletotrichumspp.能侵染油茶幼嫩的器官，侵染初期組織表面出現(xiàn)較小的褐色斑點，隨后出現(xiàn)輪紋狀枯斑，后期病斑上著生輪狀排列的黑色點狀物(分生孢子盤)，空氣濕度大時病斑處可見分生孢子堆，嚴重時出現(xiàn)葉片早落、枝梢枯死及果皮開裂早落的癥狀[6-7]。前期研究認為油茶炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌C.gloeosporioides，隨著病原學與分子生物學的深入研究，研究者們認為引起油茶炭疽病的病原存在多個種類[8-9]。

幾乎所有高等植物的多種組織中都普遍存在內生菌，內生菌在促進植物生長與提高植物抗逆性等方面具有重要的意義[10]。芽孢桿菌Bacillus和鏈霉菌Streptomyces是報道最多的2類有益內生菌，均能顯著抑制植物病原菌，同時能夠減少因化學農(nóng)藥過度使用帶來的負面生態(tài)影響[11-12]。植物內生菌及其次生代謝產(chǎn)物在農(nóng)林業(yè)有害生物控制和植物病害管理中具有較好的應用潛力。

本研究對云南省德宏州、文山州及保山市油茶種植區(qū)炭疽病的發(fā)生情況進行調查，聯(lián)合形態(tài)學特征和多位點序列分析明確病原菌的種類，通過柯赫氏法則測定菌株對油茶的致病性，并通過分離健康油茶葉片內生菌篩選出具有拮抗效果的菌株，以期為油茶炭疽病的綠色防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2019和2020年7 —9月，在云南省德宏州、文山州及保山市油茶種植基地收集表現(xiàn)出典型炭疽病癥狀的病葉和健康油茶葉片，用自封袋保存帶回實驗室。

馬鈴薯瓊脂固體培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂粉 20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH=7.0；水酵母固體培養(yǎng)基(TWYE)：酵母提取物0.25 g，K2HPO4·7H2O 0.5 g，瓊脂粉 20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH=7.2；牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(LB)：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉 20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH=7.0。

1.2 油茶炭疽病病害調查

2019和2020 年的7—9月份對云南省德宏州、文山州和保山市的栽培油茶各進行3次炭疽病病害調查，每個地區(qū)調查3個主要種植區(qū)，各樣區(qū)按五點采樣法隨機抽取30株油茶，每株油茶在4個方向各抽查30片葉片計算發(fā)病率，同時參考楊光道[13]制定的分級標準(表1)計算病情指數(shù)。

表1 油茶炭疽病的分級標準Table 1 Rated scale for disease severity of Camellia oleifera anthrax

1.3 油茶炭疽病菌的分離及形態(tài)學鑒定

參照秦紹釗等[6]的方法，采用常規(guī)組織分離法分離病原菌。剪取染病葉片病健交界處組織，經(jīng)表面消毒后接種于PDA培養(yǎng)基平板，待菌絲生長后重復純化3～5次，得到的純菌株用PDA試管斜面于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

采用玻片培養(yǎng)檢視法觀察油茶炭疽菌的形態(tài)特征。蓋玻片滅菌后斜插入培養(yǎng)基平板，供試菌接種于斜插片附近，倒置培養(yǎng)7～10 d后拔出蓋玻片，使用光學顯微鏡(尼康，上海)觀察其形態(tài)特征。

采用徒手切片法觀察染病部位炭疽菌的形態(tài)特征。將病癥明顯的病葉切成較薄的組織片并制成臨時玻片標本，通過光學顯微鏡觀察病原菌的形態(tài)學特征。

1.4 油茶炭疽病菌的致病性測定

參照秦紹釗等[6]的方法，采用活體植物接種法驗證病原真菌致病性。病原菌活化培養(yǎng)后用5 mL無菌水充分洗滌分生孢子，調節(jié)其終濃度為1×106mL-1。健康油茶葉片用φ為75%乙醇輕輕擦拭表面并自然風干，接種針灼燒后在葉片表面輕輕刺出傷口，吸取20 μL孢子懸浮液接種至葉片傷口處，空白對照接種無菌水，5次重復，25 ℃條件下保濕培養(yǎng)10 d，每天觀察并測量葉片的病斑面積，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.5 油茶炭疽病菌的分子鑒定

采用基因組DNA提取試劑盒(生工，上海)提取病原菌總DNA，提取后保存于-20 ℃冰箱備用。以真菌總DNA為模板擴增ITS片段、ACT、TUB2、CHS-1、GAPDH和HIS3基因[9]，所用引物見表2。炭疽菌ITS片段的PCR反應條件：94 ℃預變性5 min后；94 ℃ 變性 30 s，56 ℃ 退火 40 s，72 ℃ 延伸 50 s，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸10 min。其余基因片段的反應條件：94 ℃ 預變性 5 min 后；94 ℃ 變性 30 s，52 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，循環(huán) 35 次；最后 72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物切膠純化后送昆明碩擎生物科技有限公司測序，利用DNAMAN 8將雙向測通的序列拼接并提交到NCBI數(shù)據(jù)庫比對，利用MEGA 6中最大簡約法(Maximum-parsimony，MP)同時通過RAxML-HPC2的最大似然法(Maximum-likelihood，ML)以1 000 進行 Bootstrap校驗，構建真菌系統(tǒng)發(fā)育樹。

表2 本研究采用的引物Table 2 Primers used in this study

1.6 油茶葉片內生拮抗菌的分離及形態(tài)鑒定

將健康油茶的葉片用流水沖洗20 min后，用超聲波(45 kHz)清洗10 min去除表面灰塵及附著物，然后進行常規(guī)表面消毒，吸取100 μL最后一次清洗葉片的無菌水涂布于LB培養(yǎng)基平板，以此檢驗表面消毒是否徹底。取1.0 g表面消毒后的葉片用9 mL無菌水充分研磨至勻漿狀，靜止10 min后吸取上清液進行梯度稀釋，吸取100 μL各濃度梯度的懸浮液分別涂布于TWYE培養(yǎng)基平板(添加制霉菌素 25 mg/L，K2Cr2O725 mg/L 和萘啶酮酸 25 mg/L)放置吸收1 h后，28 ℃條件下倒置培養(yǎng)5～7 d，同時涂布于LB培養(yǎng)基平板，放置吸收后，37 ℃條件下倒置過夜培養(yǎng)，單菌落經(jīng)3～5次純化后接種于對應試管斜面4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用玻片檢視法觀察內生放線菌的形態(tài)特征，通過革蘭染色法鑒定細菌類型并觀察其形態(tài)特征。

1.7 油茶葉片內生拮抗菌的篩選

采用平板對峙法測定內生菌的抑菌效果。將供試病原菌及內生菌菌株活化培養(yǎng)，調節(jié)供試內生菌懸浮液為 1×104cfu/mL，用 6 mm 打孔器制取炭疽病菌菌絲塊并接種于PDA平板的中央，在距中央2.5 cm的兩側沾取內生菌懸浮液輕劃2條細線，靜置 10 min 后于 28 ℃ 條件下倒置培養(yǎng) 5 d，測量菌絲直徑、計算抑菌率。

1.8 油茶葉片內生拮抗菌的分子鑒定

采用基因組DNA提取試劑盒(生工，上海)提取內生菌總DNA，提取后保存于-20 ℃條件下備用。以細菌總DNA為模板擴增內生細菌的16S rRNA基因，PCR反應條件：94 ℃預變性5 min后；95 ℃ 變性 30 s，55 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 2 min，循環(huán) 35 次；最后 72 ℃ 延伸 10 min。雙向測通的序列拼接并提交到EzBioCloud數(shù)據(jù)庫進行比對，利用鄰接法 (Neighbor jointing，NJ)以 1 000 進行Bootstrap校驗，構建細菌系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 油茶炭疽病病害調查

對3個地區(qū)油茶栽培地進行病害調查的結果表明，人工栽植油茶炭疽病發(fā)生嚴重，幼嫩的葉片、枝條和果實癥狀明顯，病斑灰白色至褐色，表面輪生黑色點狀物，發(fā)病嚴重時葉片大面積枯死并早落；染病的小枝出現(xiàn)橢圓形病斑，后期病斑開裂，繞枝延伸1周后枝條枯死脫落；染病幼果初期產(chǎn)生圓形病斑，隨后病斑延伸并產(chǎn)生輪狀黑色點狀物，后期果皮開裂，果實早落(圖1)。定點調查結果表明，德宏州的油茶炭疽病發(fā)生較為嚴重，平均發(fā)病率為56.18%，病情指數(shù)為53.11，文山州油茶炭疽病病情較輕，平均發(fā)病率為43.99%，病情指數(shù)為42.01，保山地區(qū)油茶炭疽病平均發(fā)病率為53.65%，病情指數(shù)為47.19(表3)。

圖1 油茶炭疽病癥狀表現(xiàn)Fig.1 Symptoms of Camellia oleifera anthrax

表3 云南省3個地區(qū)油茶炭疽病病害調查結果1)Table 3 Investigation results of Camellia oleifera anthrax in three areas of Yunnan Province

2.2 油茶炭疽病菌的分離及形態(tài)鑒定

從油茶染病葉片上共分離得到82株真菌，通過菌落形態(tài)及玻片檢視初步鑒定出11株炭疽菌。菌株 CA01、CA02、CA07、CA11、CA13和 CA14的形態(tài)學特征如圖2所示，在PDA培養(yǎng)基上，菌絲初期為白色，后逐漸加深為墨綠色，絨毛狀，邊緣整齊，氣生菌絲較發(fā)達，絨毛狀。分生孢子單孢，無色，長橢圓形，具 1～2個油球，13.5～15.5 μm×4.5～5.9 μm。光鏡下可見少量附著胞，淺棕色，球形、棒形至不規(guī)則形，8.2～9.5 μm×5.5～6.3 μm，結合王玉春[5]的描述，初步確定上述6株菌屬于膠孢炭疽菌復合種 (C.gloeosporioidescomplex)。

圖2 膠孢炭疽菌復合種各菌株在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)學特征Fig.2 Morphological characteristics of Colletotrichum gloeosporioides complex strains on the PDA medium

由圖3A可見，在PDA培養(yǎng)基上，菌株CA17菌落初期為白色，后期變?yōu)闇\墨綠色，背面乳白色至淺黃色，有氣生菌絲，絨毛狀，邊緣整齊。分生孢子單胞，無色，紡錘形質長橢圓狀，兩端鈍圓，中心?？梢娒黠@的油滴，14.2～16.5 μm×4.9～5.1 μm。光鏡下可見附著胞，卵圓形至不規(guī)則狀，褐色至黑褐色，結合王玉春[5]的描述，菌株CA17可鑒定為暹羅炭疽菌C.siamense，屬于C.gloeosporioidescomplex。

由圖3B可見，在PDA培養(yǎng)基上，菌株CA21菌落初期白色，后期氣生菌絲發(fā)達，毯狀，出現(xiàn)鮮艷的橘紅色至粉紅色，菌落背面橘紅色至粉色，菌落表面可見橘色分生孢子堆，分生孢子單孢，無色，紡錘形至卵圓形，光滑，11.2～15.5 μm×3.1～5.2 μm。光鏡下可見有隔菌絲，未見附著胞形成，結合王玉春[5]的描述，菌株CA21可鑒定為C.fioriniae，屬于尖胞炭疽菌復合種 (C.acutatumcomplex)。

圖3 暹羅炭疽菌與松針炭疽菌菌株在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)學特征Fig.3 Morphological characteristics of Colletotrichum siamense and C.fioriniae on the PDA medium

在PDA培養(yǎng)基上，菌株CA05、CA09和CA23菌落初期白色，后加深至墨綠色，略呈同心輪紋狀，氣生菌絲較發(fā)達，致密的毯狀，中央略凸起，菌落背面淺橘色。分生孢子單孢，透明，紡錘形，11.2～18.8 μm×3.3～5.5 μm。光鏡下未見附著胞，可見菌絲常糾結和纏繞形成較復雜的結構(圖4)，結合王玉春[5]的描述，上述3株菌可鑒定為博寧炭疽菌復合種 (C.boninesecomplex)中的C.karstii。

圖4 喀斯特炭疽菌菌株在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)學特征Fig.4 Morphological characteristics of Colletotrichum karstii on the PDA medium

通過徒手切片觀察染病葉片病斑處的顯微結構，可見病斑處的葉片組織褐色，易碎，病原菌分生孢子盤暗褐色，半埋生于葉片組織內，周圍有剛毛或無剛毛，剛毛暗色，分生孢子著生在分生孢子梗上，分生孢子無色，單胞，長橢圓形或短棒形 (圖5)。

圖5 染病部位炭疽菌的形態(tài)特征Fig.5 Morphological characteristics of Colletotrichum on the lesion

2.3 油茶炭疽病菌的致病性測定

活體油茶接種病原菌保濕培養(yǎng)10 d后結果表明，各炭疽菌對油茶葉片均有致病性，但致病力存在差異。接種后的3 d油茶葉片開始表現(xiàn)癥狀，出現(xiàn)水漬狀圓形病斑，5 d后病斑面積擴大且顏色變深。菌株 CA01 (圖6A)，CA09 (圖6E)，CA11 (圖6F)和CA14 (圖6H)病斑較小，擴展較慢，致病力較弱，接種10 d后測量病斑，結果表明菌株CA17 (圖6I)對油茶的致病力較強，葉片病斑最大，且與其他菌株差異顯著(圖7)。

圖6 炭疽菌致病性驗證Fig.6 Pathogenicity assay of Colletotrichum

圖7 接種炭疽菌菌株10 d后的病斑面積Fig.7 Lesion area for 10 days after inoculation with Colletotrichum

2.4 油茶炭疽病菌的分子鑒定

以病原菌總DNA為模板分別擴增ITS序列(700 bp)、ACT(300 bp)、TUB2(500 bp)、CHS-1(300 bp)、GAPDH(300 bp)和HIS3(450 bp)基因片段，基于多基因片段串聯(lián)序列構建的油茶炭疽病菌系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖8)結果表明，CA01、CA02、CA07、CA11、CA13、CA14和CA17并在膠孢炭疽菌復合種的進化支內且支持率較高，結合形態(tài)學特征將菌株 CA01、CA02、CA11、CA13和 CA14鑒定為膠孢炭疽菌C.gloeosporioides，菌株 CA07鑒定為卡哈瓦炭疽菌C.kahawae，菌株CA17鑒定為暹羅刺盤孢C.siamense。菌株 CA05、CA09 和 CA23 處于博寧炭疽復合種的進化支內，且與喀斯特炭疽菌C.karstii聚為一進化支，結合形態(tài)特征將其鑒定為喀斯特炭疽菌C.karstii。菌株CA21位于尖孢炭疽菌復合種進化支，與松針刺盤孢C.fioriniae聚為一支，結合形態(tài)學結果鑒定為松針刺盤孢C.fioriniae。

圖8 基于多位點序列構建炭疽病菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Phylogenetic tree based on multilocus sequence of Colletotrichum spp.

2.5 油茶葉片內生拮抗菌的分離及形態(tài)鑒定

通過TWYE和LB培養(yǎng)基從健康油茶葉片內共分離出19株內生放線菌和27株內生細菌，且涂布最后一次清洗葉片的無菌水未長出菌落，說明表面消毒徹底，上述46株細菌均屬于油茶葉片內生菌。

通過菌落與顯微形態(tài)觀察結果表明，菌株BC07為鏈霉菌，菌落致密，干燥且不透明，后期菌落上產(chǎn)生晶瑩粉狀物，白色至淺綠色，有特殊的氣味，光鏡下可見發(fā)達的菌絲體，淡色，彎曲，分枝較多(圖9A～9C)。菌株BC11為芽孢桿菌，菌落白色至淺黃色，表面光滑，鏡檢為革蘭陽性菌，可見芽孢 (圖9D～9F)。

圖9 內生拮抗菌的形態(tài)特征Fig.9 Morphological characteristics of antagonistic endophytic bacteria

2.6 油茶葉片內生拮抗菌的篩選

以油茶炭疽菌CA17為指示菌(圖10A)，通過平板對峙培養(yǎng)5 d，篩選到2株內生細菌具有較寬的抑菌帶，菌株BC07的平均抑菌率為37%(圖10B)，菌株BC11的抑菌效果較好，平均抑菌率為42%(圖10C)。

圖10 內生拮抗細菌與菌株CA17平板對峙結果Fig.10 Confrontation effect of antagonistic endophytic bacteria against strain CA17

2.7 油茶葉片內生拮抗菌的分子鑒定

內生細菌 16S rRNA PCR 擴增可獲得約 1 500 bp的特異性片段，基于16S rRNA構建的系統(tǒng)發(fā)育樹結果表明，BC07與Streptomyces fulvissimus(LC551891)相似性最高(圖11A)，BC11與Bacillus mojavensis(JH600280)序列相似性最高(圖11B)，結合形態(tài)學特征確定了菌株的親緣關系。

圖11 基于16S rRNA構建內生拮抗菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.11 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence of antagonistic endophytic bacteria

3 討論與結論

隨著分子生物學的快速發(fā)展，從分子水平揭示菌株的差異和親緣關系，使得分類和鑒定變得更加準確。核糖體RNA(rRNA)序列分析、DNA堿基組成 [(G+C) mol%]、限制性片段長度多態(tài)性 (RFLP)、隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)在真菌種級分類研究中有著重要的作用。對某些近緣種來說，ITS片段差異不大，利用ITS單基因序列對炭疽菌構建的系統(tǒng)發(fā)育樹自展支持率不高，仍然不能準確地區(qū)分親緣關系較近的種，對于炭疽菌的復合種就更加無法提供足夠的支持率和區(qū)分度[14-15]。Carbone等[16]設計了蛋白基因的通用引物并用于絲狀真菌的系統(tǒng)發(fā)育研究中，后續(xù)的研究中一些具有足夠分辨率的基因序列被廣泛的關注，如ACT、TUB2、CAL、GHS-1、GS和GAPDH等基因[17-19]。Liu等[9]學者在中國常見炭疽菌分子系統(tǒng)學最新研究報告中指出，基于ITS序列能將炭疽菌鑒定至復合種水平，但相近復合種與復合種內部物種的更準確地區(qū)分仍需要基于多位點的聯(lián)合分析，該研究中多基因片段串聯(lián)構建的系統(tǒng)發(fā)育樹及全基因組特征分析的結果證實，ACT、TUB2、CAL、GHS-1、GS和GAPDH聯(lián)合分析能有效區(qū)分acutatum、destructivum、orchidearum、truncatum和boninense等復合種，但gloeosporioides復合種的準確區(qū)分還需要依據(jù)ApMat和GS2個位點的串聯(lián)分析。

本研究通過形態(tài)學特征及多位點序列聯(lián)合構建系統(tǒng)發(fā)育樹，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，膠孢炭疽菌C.gloeosporioides是云南省油茶炭疽病的主要病原菌，也是被廣泛證實的油茶炭疽病的病原，但之前的研究普遍是基于ITS的單一片段分析，加之NCBI中無效序列的存在，導致很多膠孢炭疽菌的近緣種類未能得到準確區(qū)分[5]。暹羅刺盤孢C.siamense作為gloeosporioides復合種已在包括油茶在內的多種植物上被報道，因其形態(tài)多變，分類單元一直有爭議，劉威[18]和李河等[20]的研究證實了C.siamense在茶屬植物中的存在，菌株CA17與C.siamense聚為一小進化支共同聚在gloeosporioides復合種進化支內，菌株CA07在形態(tài)上與帥小春等[21]描述的菌株形態(tài)特征相似，在系統(tǒng)發(fā)育樹中與C.kahawae聚為一支，也共同聚在gloeosporioides復合種進化支內，因此，在后續(xù)的研究中還需依據(jù)ApMat和GS2個位點對鑒定做進一步地完善[5,9]。松針刺盤孢C.fioriniae之前被認為是尖孢炭疽菌C.acutatum的變種，劉威[18]報道了該種在我國福建和云南等地的山茶屬植物中存在，秦紹釗等[22]等報道了該種在貴州省的油茶中存在，并通過ACT-GAPDH串聯(lián)進行分子鑒定。本研究構建的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹中，C.fioriniae與C.acutatum位于不同的2個分支共聚為acutatum復合種進化支?？λ固靥烤揖鶦.karstii可危害多種植物，劉威[18]和王玉春[5]在我國福建省、江蘇省、湖南省及云南的臨滄地區(qū)報道了茶樹上的C.karstii，本研究在云南油茶上報道了C.karstii，與Sharma等[23]的報道相吻合，該種屬于博寧炭疽菌復合種。

作為一個穩(wěn)定的微生態(tài)環(huán)境，植物能被多種內生菌定殖，其中，厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、α-/β-/γ-變形菌門 (α-/β-/γproteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)被認為是內生菌的優(yōu)勢類群[24]。內生菌與致病菌的區(qū)別在于內生菌在宿主植物的生長過程中發(fā)揮著重要的作用，其中促生和抗逆作用是目前的研究熱點。有報道指出由微生物產(chǎn)生的抗生素近一半由放線菌產(chǎn)生，其中鏈霉素、氯霉素和四環(huán)素等廣泛應用于農(nóng)林業(yè)及臨床等領域。Golinska等[11]對植物內生放線菌的功能進行綜述，結果表明內生放線菌包含了超過20個天然產(chǎn)物合成基因簇，其中pks基因和nrps基因是被報道最多的2類基因家族，大多數(shù)內生鏈霉菌屬菌株能產(chǎn)生抗菌化合物抑制植物病原物的生長。陳東波等[25]在分離西雙版納3種有毒植物內生放線菌的同時檢測了pks、nrps、aph和cyp等7個化合物合成基因，從基因角度驗證內生放線菌產(chǎn)生次生代謝物的能力。芽孢桿菌是被廣泛證實和應用的防控植物病害的生物制劑，通過占據(jù)生態(tài)位、營養(yǎng)競爭、分泌細菌素及水解酶等次生代謝物抑制或殺死病原菌，或激活植物的防御系統(tǒng)抵抗病原菌的侵入[26-27]。Malik等[28]報道了S.fulvissimus分泌的抗菌蛋白對金黃色葡萄球菌等革蘭陽性菌有抑制作用，王穎等[29]報道了馬鈴薯內生細菌Bacillus mojavensis發(fā)揮拮抗作用的同時能穩(wěn)定地定殖于植物體內，且不影響土壤微生態(tài)中微生物群落的穩(wěn)定。宏基因組學技術的快速發(fā)展為研究微生物群落結構及宿主與微生物相互關系提供了新的思路[30]。在后續(xù)試驗中，可通過培養(yǎng)組、基因組與代謝組聯(lián)用的方式闡述健康油茶與染病油茶根系內的差異菌株，篩選出高效拮抗菌，分析拮抗菌的作用靶標及活性成分的代謝途徑。

本研究首次對云南3個地區(qū)的栽培油茶進行炭疽病的調查，其中，德宏州的炭疽病發(fā)生較重，保山市次之，文山州發(fā)病較輕，結合形態(tài)學特征與多位點序列分析結果表明，云南省油茶炭疽病菌有5 種，分別為膠孢炭疽菌C.gloeosporioides、卡哈瓦炭疽菌C.kahawae、喀斯特炭疽菌C.karstii、松針刺盤孢C.fioriniae和暹羅刺盤孢C.siamense。通過柯赫氏法則驗證病原菌致病性結果表明，菌株CA17暹羅刺盤孢C.siamense的致病力較強。同時，以強致病菌CA17為指示菌篩選到2株拮抗效果較好的內生菌，分別為BC07 (S.fulvissimus)和BC11 (B.mojavensis)。本研究可為油茶炭疽病的田間診斷、病原鑒定及其綠色防控提供依據(jù)。