黃楨輝，王 娟,2，高 潔，鄭 正，鄧曉玲，許美容

(1 廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院, 廣東 廣州 510642；2 衡陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所, 湖南 衡陽 421101)

柑橘黃龍病 (Citrus Huanglongbing, HLB)是柑橘生產(chǎn)上最具毀滅性的病害之一。截至2020年9月，該病害分布于亞洲、非洲、美洲和大洋洲的67個國家和地區(qū)[1]。黃龍病是由限制于韌皮部的α-變形菌綱(α-Proteobacterium)的候選韌皮部桿菌屬細(xì)菌 (CandidatusLiberibacter spp.)引起的[2-3]。候選韌皮部桿菌又分為耐熱型亞洲種(‘CandidatusLiberibacter asiaticus’, CLas)、熱敏型非洲種 (‘C.L.africanus’, CLaf) 和美洲種 ( ‘C.L.americanus’, CLam)[4]。其中，CLas的分布最廣，在51個國家/地區(qū)被檢測到[5]，且是中國柑橘上檢測到的唯一小種[6]。黃龍病引起柑橘枝梢黃化，包括成熟老葉呈斑駁、成熟新葉呈花葉或均勻黃化等癥狀，導(dǎo)致柑橘果實無法正常成熟或成色不佳；形成“青果”或“紅鼻子果”，使久病的植株局部或整體衰弱[7-9]。從宏觀上看，黃龍病一方面影響柑橘種植面積，另一方面調(diào)控著柑橘價格，對柑橘產(chǎn)業(yè)造成巨大的影響。從微觀上看，在有柑橘木虱共存的疫區(qū)，黃龍病菌一旦流行就難以根除，是柑橘生產(chǎn)的重大隱患。目前，主要通過種植無病苗木、清理病樹、防治木虱等方法進(jìn)行黃龍病綜合防控[10]。

病原菌的定量分析是病害流行學(xué)研究中分析病原增殖和分布的重要手段[4]。在田間的黃龍病柑橘樹常局部顯癥，且其病原菌CLas在植株中的分布通常不均勻[11-14]。染病柑橘中CLas的含量可隨著季節(jié)或柑橘生長階段的不同而變化[13,15-17]。Li等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，田間同一黃龍病植株的不同組織中的病菌數(shù)量差異明顯；根部和地上部的病菌含量相差很大。Tatineni等[11]發(fā)現(xiàn)黃龍病菌在樹皮、葉中脈、根、花、果實中每μg總DNA中的CLas細(xì)胞數(shù)在14～137 031范圍內(nèi)不等，且在果柄處的CLas含量最高。華南農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘黃龍病研究室對砂糖橘果枝的CLas含量分布進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示不同組織中的CLas含量存在較大差異，其中橘絡(luò)的CLas含量最高[18-19]。

對不同季節(jié)的黃龍病樹中CLas的分布規(guī)律研究通常以葉中脈為材料。李智鵬等[16]以江西尋烏縣吉譚鎮(zhèn)果園的臍橙病樹為材料，發(fā)現(xiàn)葉脈中的CLas含量在4—5月和7—8月呈現(xiàn)2個低谷，在5—7月、8—11月呈現(xiàn)2個高峰；陳傳武等[20]對廣西地區(qū)染病夏橙和沙田柚葉脈中的CLas含量進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示這2個品種9—12月的CLas含量明顯高于其他時期的；而Munir等[17]分析云南的黃龍病樹，發(fā)現(xiàn)病樹葉脈中的CLas含量在7月最低，于12—1月出現(xiàn)高峰。柑橘樹體上CLas的季節(jié)分布規(guī)律也因寄主品種而異[20-21]。感染黃龍病的烏柑Severinia buxifolia和瓦倫西亞甜橙Citrus sinensis‘Valencia’ 葉片中CLas活菌含量均在12月至來年2月期間最高[15]；而對巴西染病的橙類和檸檬3個品種的樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)秋季時葉脈中的CLas含量最高[13]；在中國，夏橙和沙田柚葉脈中的CLas含量在9—12月份明顯高于其他時期[20]。李敏等[21]研究柑橘根系中CLas消長規(guī)律，指出紅心蜜柚根部的菌含量高于砂糖橘根部的CLas含量。

柑橘黃龍病的癥狀發(fā)展與CLas含量和運(yùn)轉(zhuǎn)相關(guān)。葉片斑駁是柑橘黃龍病的典型癥狀，然而斑駁癥狀葉片中的CLas含量并非最高[22]；砂糖橘的“紅鼻子果”中CLas檢出率高達(dá)100%[23]。Johnson等[5]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)帶菌柑橘木虱刺吸的柑橘植株在葉片未顯癥之前即可從根部檢測到高含量的CLas，提出“病菌由傳菌木虱取食位點流向根部，在根部增殖為害，于抽梢期再由根部流向樹冠”的黃龍病菌流動模型；并推斷根部的衰弱與病菌的侵染直接相關(guān)，而非樹體內(nèi)韌皮部堵塞造成的碳水化合物饑餓引致。Ibanez等[24]通過追蹤成熟葉片中CLas含量的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)植株的營養(yǎng)生長對CLas在病樹體內(nèi)的流動起重要作用：碳水化合物等隨著植物生長的需要在植株體內(nèi)周年轉(zhuǎn)運(yùn)，而病原菌隨之在韌皮部中被動運(yùn)輸。

探清CLas在染病柑橘帶果枝條上的運(yùn)轉(zhuǎn)規(guī)律具有重要的意義：首先，之前的研究主要聚焦于葉片營養(yǎng)生長階段與CLas的分布和流動的關(guān)系，本研究則解析生殖生長對CLas增殖和流向的影響，是之前理論的驗證和補(bǔ)充。其次，未有研究橫向地比較不同類別柑橘果枝中的CLas分布情況。再次，病害的早期檢測依賴于對病原分布和流向的準(zhǔn)確把握，及時準(zhǔn)確地隔離帶CLas的樹體，阻斷黃龍病在果園中蔓延是該病害防控的關(guān)鍵。為此，本研究利用TaqMan實時熒光定量檢測技術(shù)，追蹤了染病砂糖橘、W-默科特、紅心蜜柚和沙田柚的帶果枝條各個部位的CLas含量，系統(tǒng)分析CLas在寄主體內(nèi)的時間和空間運(yùn)轉(zhuǎn)規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 植物材料

帶黃龍病的植物材料品種分別為廣東博羅的砂糖橘和紅心蜜柚、云南瑞麗的W-默科特及廣東梅州的沙田柚。采集的樣品分別用于開展以下2個試驗：不同品種柑橘的枝條中CLas分布研究和不同季節(jié)的柑橘枝條中CLas分布研究。所有樣品均為田間具有典型黃龍病癥狀的柑橘樹的枝條，所有枝條均來自不同植株且都生長有果實(稱為“果枝”)。樣品信息見表1。

表1 本研究的植物材料基本信息Table 1 Basic information of the plant materials in this study

1.2 田間癥狀觀察

分別在采樣時觀察所采集的柑橘枝條的黃龍病癥狀，并對癥狀進(jìn)行描述和記錄。用數(shù)碼相機(jī)依次拍攝所采集樣品的整體及局部。拍攝枝條整體時用雙面膠將枝條的主干及主要葉片固定在黑色吸光攝影布上；拍攝枝條局部的葉片時則用雙面膠將葉片背面固定在攝影布上。用最小刻度單位為mm的尺子測量所采集的每個枝條上果實的橫徑，并用分析天平測定單果質(zhì)量。

1.3 DNA提取

所采集果枝分為老梢、新梢和果實3部分；分別剪取老梢上成熟葉片的中脈，選取新梢上完全展開的近成熟新葉并切取中脈，將果實分為果梗、果皮、橘絡(luò)、果軸和種皮5部分。以上樣品依次切碎后用分析天平稱取0.1 g至2 mL離心管中。選用OMEGA公司的植物DNA提取試劑盒(D2485-02,OMEGA bio-tek)，按說明書的步驟提取DNA。所提取的每份DNA溶于200 μL無核酸酶的純凈水中。取3 μL DNA溶液在室溫下進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)對DNA純度和含量進(jìn)行定性分析；用 NanoDrop ONE(Thermo Scientific,上海)進(jìn)一步對DNA的含量和純度進(jìn)行定量分析。經(jīng)檢測合格的DNA樣品置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實時熒光定量PCR

以提取的植物樣品總DNA為模板，以HLBasf-4G/HLBasr和HLBp[25]為引物和探針，用TaqMan實時熒光定量PCR檢測每個樣品中的CLas含量。以滅菌ddH2O為空白對照，非黃龍病柑橘葉中脈提取的DNA為陰性對照。20 μL的熒光定量 PCR 擴(kuò)增體系包含：1 μL DNA(質(zhì)量濃度為50 ng/μL)、10 μL Bestar qPCR Master Mix(Taqman Pro, DBI Bioscience)、8 μL ddH2O、0.4 μL HLBasf-4G(10 μmol/L)、0.4 μL HLBasr(10 μmol/L)及 0.2 μL HLBp (5 μmol/L)。選用 Bio-Rad Real-Time PCR 儀(Bio-Rad Laboratories Inc., 美國)進(jìn)行 PCR。反應(yīng)條件為 40 個循環(huán)的以下程序：95 ℃，2 min；95 ℃，10 s；60 ℃，30 s。

1.5 數(shù)據(jù)處理

以O(shè)I1/OI2C引物[2]的擴(kuò)增產(chǎn)物與載體pEASY-T1(TRANS, 北京)重組質(zhì)粒的10倍梯度稀釋液為模板擴(kuò)增所獲得的Ct值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對每個樣品中CLas拷貝數(shù)進(jìn)行定量。用Thermo NanoDrop One超微量紫外分光光度計測得上述質(zhì)粒的質(zhì)量濃度(ng/μL)。質(zhì)粒中含有的CLas目的基因拷貝數(shù)按Harakava 等[26]的方法計算。通過Realtime PCR 儀自帶軟件 Bio-Rad CFX Manager 3.0 得出標(biāo)準(zhǔn)化方程，計算每個反應(yīng)中的CLas拷貝數(shù)。每個樣品中CLas含量則以每ng樣品總DNA含有的CLas拷貝數(shù)表示。

采用 SPSS 軟件 (Version 20.0, SPSS Inc.,美國)和 Microsoft Excel 2016 對果實橫徑、質(zhì)量和CLas含量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用鄧肯氏新復(fù)極差 (Duncan’s multiple range test, DMRT)法分析果實表觀差異及不同品種的柑橘帶病枝條不同時期或不同部位上的黃龍病菌含量的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實成熟期不同品種柑橘果實的外形和黃龍病癥狀

感染了黃龍病的果實成熟期的砂糖橘(橘類)、紅心蜜柚(柚類)、沙田柚(柚類)和W-默科特(雜柑類)枝條的葉片和果實上均可見異常(圖1A)。砂糖橘、紅心蜜柚和沙田柚的葉片均可見較明顯的斑駁黃化；而W-默科特葉片的斑駁癥狀較輕。砂糖橘的果實為著色異常的“紅鼻子果”和“小果”，其中，病果和健康果的單果質(zhì)量分別為45.35和28.76 g，橫向果徑分別為 47.05 和 32.49 mm，差異均極顯著。W-默科特的果實為“紅鼻子果”，其中，病果和健康果的橫徑均值分別為50.65和55.26 mm，兩者無顯著差異。而柚類的果實則主要為“畸形果”和“小果”，其中，病果和健康果的橫向果徑分別為 167.65 和 114.67 mm，差異極顯著。

圖1 不同品種柑橘的果實成熟期果枝的黃龍病癥狀(A)及砂糖橘枝條的黃龍病四季癥狀(B)Fig.1 Typical symptoms of Huanglongbing-affected citrus fruit branches at fruit maturity stage of different cultivars (A)and typical symptoms of Huanglongbing-affected fruit branches of Citrus reticulata cv.Shatangju in different seasons(B)

進(jìn)一步跟蹤果期較長的砂糖橘的黃龍病癥狀(圖1B)可見，夏季時，染病的砂糖橘枝條主要表現(xiàn)為新梢葉片不轉(zhuǎn)綠，葉片黃化或稍斑駁，果實癥狀不明顯，田間偶見畸形的果實。秋季時，砂糖橘病梢基部的老葉開始出現(xiàn)斑駁，新葉稍黃化，果實的癥狀不明顯。冬季時病葉黃化加重，病梢基部的老葉斑駁黃化、卷曲；部分新梢葉片癥狀與老葉類似，或新梢可見短小細(xì)弱、呈“缺素狀”花葉的葉片；成年病樹出現(xiàn)小的“畸形果”“青果”“紅鼻子果”。而春季的帶果病梢上葉片的癥狀消失， “紅鼻子果”的橘紅色部分變淡，但“畸形果”的特征更加明顯。

2.2 果實成熟期不同品種柑橘果枝的CLas分布

對感染黃龍病的4種柑橘果實枝條中的

CLas含量進(jìn)行定量分析，結(jié)果(圖2)顯示CLas在不同品種柑橘枝條上不同部位的含量差異明顯。砂糖橘枝條不同部位每ng樣品DNA中所含的CLas拷貝數(shù)范圍為 53.27～113 381.01，在 W-默科特、紅心蜜柚和沙田柚枝條中拷貝數(shù)范圍依次為39.42～1 847 528.92、129.29～259 160.56 和 208.42～5 897 051.07。

圖2 果實成熟期的不同品種柑橘果枝中的‘Candidatus Liberibacter asiaticus’含量分布Fig.2 Distribution of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ in Huanglongbing-affected fruit branches of different cultivars at fruit maturity stage

對4個品種的枝條7個部位(老葉葉脈、新葉葉脈、果柄、果皮、橘絡(luò)、果中軸和種皮)的CLas含量進(jìn)行分析表明，砂糖橘和W-默科特枝條中的CLas含量分布規(guī)律類似：砂糖橘橘絡(luò)中的CLas含量顯著高于其余6個部位；種皮中的CLas含量又顯著高于橘絡(luò)和果中軸外的其余4個部位；果中軸和種皮中的CLas含量無顯著差異。對于W-默科特，橘絡(luò)中的CLas含量顯著高于其余部位；除橘絡(luò)外的6個部位中的CLas含量無顯著差異。柚類的紅心蜜柚和沙田柚枝條中的CLas含量分布規(guī)律也類似：沙田柚的果中軸海綿狀組織中的CLas含量顯著高于種皮以外的其余5個部位，而這5個部位之間及與種皮的CLas含量差異不顯著；紅心蜜柚的果中軸中的CLas含量顯著高于果柄、果皮和老葉葉脈中的，種皮、橘絡(luò)和新葉葉脈中的CLas含量較果中軸的低，但是差異不顯著；果柄、果皮和老葉葉脈的CLas含量差異也不顯著。

2.3 不同季節(jié)的砂糖橘帶果枝條中的CLas分布

砂糖橘的果期長，每年4—5月時果實形成，可部分留樹掛果至來年2—3月。CLas在不同季節(jié)的染病砂糖橘果枝上的分布都不均勻，在果實處富集(圖3)。在果實的橘絡(luò)部位，CLas的含量在夏季外的其余3個季節(jié)都顯著高于其他部位。夏季時橘絡(luò)和果皮處的病菌含量最高，每ng DNA中CLas平均拷貝數(shù)分別為 5 226.58和 5 207.66，與果柄和老葉葉脈處相比有顯著性差異(P＜0.05)；由于此時果實發(fā)育不完全，種子的分化不明顯，該季節(jié)未取種皮作檢測。

夏季的砂糖橘枝條(果實形成期)中CLas含量顯著低于其他季節(jié)的(P＜0.05)；而在冬季(果實成熟期)和春季(果實成熟后期)時，枝條中CLas含量最高。自夏季至秋季(果實膨大期)，枝條中除果皮外的其他部位中的CLas含量均增高；而自夏季至春季，橘絡(luò)和果中軸中的CLas含量逐步遞增，橘絡(luò)中的CLas含量上升趨勢尤為明顯：第2年4月留樹病果的每ng橘絡(luò)總DNA所含CLas的平均拷貝數(shù)為237 044.89，是前一年6月幼果相應(yīng)部位的45 倍 (圖3)。

圖3 砂糖橘果枝各部位的‘Candidatus Liberibacter asiaticus’含量隨季節(jié)變化Fig.3 Quantification of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ in different parts of Huanglongbing-affected fruit branches of Citrus reticulata cv.Shatangju in different seasons

2.4 不同季節(jié)的紅心蜜柚帶果枝條中的CLas分布

因紅心蜜柚植株帶果期較短，果實在夏季形成與膨大，秋季采摘，病果可留樹至第2年春季后掉落。紅心蜜柚枝條中，CLas含量最高的部位是果中軸，其次是種皮和橘絡(luò)(圖4)。夏季時，枝條上不同部位每ng樣品總DNA中所含的CLas拷貝數(shù)范圍為77.91～207 849.73。果中軸中的CLas含量顯著高于果皮、葉片葉脈和果柄中的，但與種皮和橘絡(luò)中的CLas含量無顯著差異。秋季時，每ng樣品總DNA中所含的CLas拷貝數(shù)范圍為129.29～259 160.59；類似地，果中軸的CLas含量顯著高于果皮、老葉葉脈和果柄中的CLas含量，而與種皮、橘絡(luò)、新葉葉脈中的CLas含量差異不顯著。隨著果實逐漸成熟，果軸、種皮等果實部位的CLas含量升高，而果柄、葉片等部位的CLas含量降低。

圖4 紅心蜜柚果枝各部位的‘Candidatus Liberibacter asiaticus’含量隨季節(jié)變化Fig.4 Quantification of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ in different parts of Huanglongbingaffected fruit branches of Hongxinmi Yu pumelo in different seasons

3 討論與結(jié)論

黃龍病菌CLas在枝條中的分布因寄主品種而異。本試驗的4種柑橘枝條中，CLas均在果實處呈現(xiàn)富集趨勢，但砂糖橘、W-默科特的CLas含量最高部位是橘絡(luò)，柚類的則是果中軸。柚類常被認(rèn)為是較抗病的品種[7]，但本研究從紅心蜜柚和沙田柚中檢測到的CLas細(xì)菌數(shù)最大值均高于砂糖橘的相應(yīng)值，即柚類的韌皮部適合CLas大量繁殖，說明其不屬于抗病品種；而柚類由于其樹冠較大及受“大肥大水”(肥水施用量較大)和“重修剪”(枝條修整的力度較大)等栽培管理措施的影響，局部感染黃龍病后對整個樹體的產(chǎn)量影響不大，因此在生產(chǎn)上被認(rèn)為是較耐病的品種。本研究還發(fā)現(xiàn)感染黃龍病的W-默科特枝條各部位的CLas含量普遍高于砂糖橘的，但黃龍病對W-默科特果實大小的影響不大，這與之前對砂糖橘的報道不同[23]；由結(jié)果可推測，W-默科特可能是較耐黃龍病的品種，后期應(yīng)輔以果實產(chǎn)量和品質(zhì)測定數(shù)據(jù)來驗證。

隨著季節(jié)變換，CLas在柑橘枝條中的分布及含量發(fā)生顯著變化[16-18,20-21,24,27]。本研究顯示各季節(jié)成熟柑橘葉片中脈中的CLas含量排序為秋季＞冬季＞春季＞夏季，這與之前的諸多研究報道基本相符。本試驗對柑橘果枝上7個部位的黃龍病菌數(shù)量進(jìn)行跟蹤檢測，更全面地展示了CLas在寄主枝條中的動態(tài)分布規(guī)律。黃龍病的傳播媒介柑橘木虱Diaphorina citriKuwayama喜食嫩梢，帶菌木虱中的CLas首先在嫩葉中定殖并積累[28]。吳柳等[29]通過葉圓片嫁接試驗，也提出CLas在柑橘原初侵染部位的早期擴(kuò)散與葉片上表現(xiàn)出的黃龍病癥狀向外擴(kuò)散趨勢一致。這也能夠解釋為什么本試驗的新葉中脈中的CLas含量通常略高于老葉中脈的。

與葉片中CLas含量的變化規(guī)律不同，本研究結(jié)果顯示隨著果實生長，CLas逐漸向果實處富集，這與褚麗萍等[18]的研究結(jié)果相似：CLas含量排序為夏季＜秋季＜冬季＜次年春季。有研究提出CLas的含量與樹體在15 ℃以下的時長以及雨累積量呈正相關(guān)，而與樹體在30 ℃以上的時長呈負(fù)相關(guān)[27]。本試驗材料取自廣東和云南地區(qū)，這兩地屬于亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，夏季高溫，冬季及初春溫暖濕潤，柑橘樹體中的CLas含量與環(huán)境有一定的聯(lián)系。一方面，推測冬季樹體營養(yǎng)生長漸弱、抵抗能力下降，病原菌得以在枝條中大量繁殖并積累。另一方面，CLas的基因組簡單，是營養(yǎng)缺陷型細(xì)菌，需要從寄主韌皮部中獲取糖類等營養(yǎng)物質(zhì)才能生存[30-31]；在果實成熟的過程中，柑橘葉片的光合作用產(chǎn)物是從源(葉)向庫(如果實、莖、根和種子)分配，CLas則隨之流動。CLas對寄主營養(yǎng)的需求和偏好性與寄主本身物質(zhì)流的方向有關(guān)[6]。本研究證實了植物體內(nèi)黃龍病病原菌移動與源-庫營養(yǎng)流動的關(guān)聯(lián)性。

我們已對橘絡(luò)含高含量CLas的情況和原因進(jìn)行了探析和討論[19]。本研究還從病果種子的種皮組織中檢測到較高含量的CLas。在黃龍病樹中，嫩梢和根部等處的篩孔被胼胝質(zhì)或其他物質(zhì)堵塞而縮小；而種皮中卻未發(fā)現(xiàn)篩孔被堵塞現(xiàn)象，開放的篩孔使細(xì)胞間的CLas得以自由移動[8]。由于種皮和發(fā)育中的胚或胚乳之間沒有直接的維管束相連，所以對黃龍病菌來說，種皮內(nèi)的韌皮部是沒有出口的“陷阱”。Tatineni等[11]未在柑橘種子的胚和胚乳中檢測到CLas，也同樣說明CLas從種皮到胚轉(zhuǎn)移被截斷。種皮通常在種子萌發(fā)過程中脫落，其所帶的CLas不會使胚芽萌發(fā)出的砧木實生苗帶病。

掌握黃龍病菌在柑橘體內(nèi)的運(yùn)轉(zhuǎn)規(guī)律對有效地控制黃龍病至關(guān)重要。本研究探索了CLas在不同寄主果枝不同部位的分布規(guī)律和隨季節(jié)的變化動態(tài)，推測該規(guī)律也適用于未顯癥的果枝。因此，研究結(jié)果可為黃龍病的早期檢測和田間管理策略的制定提供參考。