李智博，董世滿(mǎn)，李淑霞，彭 明，曾長(zhǎng)英

(1 海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院, 海南 ?？?570228； 2 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所, 海南 ?？?571101；3 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 海南熱帶農(nóng)業(yè)資源研究院, 海南 ?？?571101)

木薯Manihot esculenta是一種熱帶作物，原產(chǎn)自非洲、南美洲熱帶亞熱帶地區(qū)，木薯淀粉儲(chǔ)存根是重要的糧食、動(dòng)物飼料和工業(yè)原料。木薯在全球糧食安全和經(jīng)濟(jì)發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[1]，然而，木薯被歸為一種對(duì)低溫敏感的物種，所以木薯種植區(qū)域大多數(shù)在我國(guó)年平均氣溫較高的海南、廣西等地區(qū)[2]。低溫和凍害是影響植物發(fā)育、限制作物地理分布和產(chǎn)量提高的重要環(huán)境因素之一[3]。研究木薯在低溫逆境中的適應(yīng)機(jī)制，提高其抗逆性，對(duì)于提高木薯產(chǎn)量具有重要意義。

在植物中，可變剪接(Alternative splicing)是一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，通過(guò)選擇不同的剪切位點(diǎn)產(chǎn)生具有改變穩(wěn)定性、定位或翻譯效率功能的不同mRNA轉(zhuǎn)錄物來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)[3]。目前可變剪接已被證明在植物對(duì)非生物脅迫的反應(yīng)中發(fā)揮作用，包括熱、干旱和冷脅迫[4-7]。精氨酸和絲氨酸富集蛋白 (Arginine/serine-rich proteins，SR)基因在冷和熱脅迫下剪接模式的變化表明剪接變異體在應(yīng)激反應(yīng)中的比例改變可能在植物對(duì)這些應(yīng)激的適應(yīng)中發(fā)揮了作用[8]。Li等[9]通過(guò)對(duì)木薯轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的大規(guī)模分析揭示了可變剪接異構(gòu)體的數(shù)量和豐富度受到低溫應(yīng)激的特異性調(diào)控。Leviatan等[3]通過(guò)平鋪陣列揭示低溫下新型冷應(yīng)答基因，基因表達(dá)水平未發(fā)生改變，但是可變剪接模式的相對(duì)豐度卻顯示出變化。

SR蛋白是一種非小核核糖核蛋白(Non-small nuclear ribonucleoprotein，Non-snRNP)剪接體蛋白家族，是前體mRNA組成型剪接和可變剪接中保守且關(guān)鍵的調(diào)控因子[10-14]。SR蛋白形成1個(gè)保守的RNA結(jié)合蛋白家族，具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，是由1個(gè)或2個(gè)RNA識(shí)別基序(RRM)和C端富含精氨酸/絲氨酸(RS)的1個(gè)特征性結(jié)構(gòu)域組成，而SR-like(SR45)蛋白中RS結(jié)構(gòu)域的分布位置與SR基因家族其他成員不同，其RS結(jié)構(gòu)域位于N端[15-16]。植物SR蛋白可分為6個(gè)亞家族：SR、RS、SCL、RSZ、RS2Z和SC35，不包含SR-like亞類(lèi)，但具有類(lèi)似SR蛋白特征且與SR蛋白系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系密切的蛋白質(zhì)被分類(lèi)為SR-like蛋白[15,17]。在本文中，為了方便起見(jiàn)，我們用SR這一名稱(chēng)統(tǒng)稱(chēng)7大亞類(lèi)(包含SR-like亞類(lèi))。在擬南芥中鑒定出18種SR基因家族成員以及SR-like(AtSR45和AtSR45a)。在木薯中，前人報(bào)道SR基因家族有18個(gè)成員，包含SR、RS、SCL、RSZ、RS2Z、SC35共 6大亞類(lèi)[18-19]，缺少 SR-like亞類(lèi)，為此，本研究在前人工作的基礎(chǔ)上對(duì)木薯SR基因家族SR-like亞類(lèi)進(jìn)行補(bǔ)充鑒定。值得注意的是，SR家族在細(xì)胞對(duì)各種非生物脅迫的適應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[13,20-21]。例如，在擬南芥中，SR剪接因子基因的表達(dá)和剪接模式受到低溫的差異調(diào)節(jié)[11]，AtSR45基因的缺失導(dǎo)致鹽脅迫敏感性增加，調(diào)控鹽脅迫的基因表達(dá)模式與剪接模式發(fā)生改變[22]。

木薯是熱帶亞熱帶地區(qū)優(yōu)質(zhì)的糧食作物，低溫與凍害成為限制擴(kuò)大其種植面積的重要因素，因此提高木薯的抗低溫能力和選育耐低溫的木薯品種是減少木薯在低溫逆境中受損的有效方法之一，近年來(lái)對(duì)木薯抗逆基因的研究具有一定的進(jìn)展，但是SR蛋白尤其SR45蛋白抗低溫逆境的研究相對(duì)較少。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析篩選出木薯SR45相關(guān)基因，并運(yùn)用生物信息學(xué)的方法對(duì)其系統(tǒng)進(jìn)化、理化性質(zhì)以及結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行深入分析，以及對(duì)SR-like亞類(lèi)進(jìn)行了補(bǔ)充；同時(shí)結(jié)合熒光定量PCR（RT-qPCR）分析MeSR45在木薯組織中的時(shí)空表達(dá)模式以及在低溫脅迫下的表達(dá)模式，以期進(jìn)一步了解木薯SR-like亞類(lèi)中SR45基因的生物學(xué)功能以及在低溫脅迫中的響應(yīng)，同時(shí)為其他物種SR基因家族的生物信息學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

研究材料為‘木薯60444’組培苗，該品種由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所功能基因組研究實(shí)驗(yàn)室提供。選取高度、長(zhǎng)勢(shì)大致相同的組培苗，平均分成2份，分別用于木薯低溫脅迫試驗(yàn)、基因時(shí)空表達(dá)檢測(cè)試驗(yàn)與干旱脅迫試驗(yàn)。在低溫脅迫試驗(yàn)中，組培苗在4 ℃低溫處理24 h，并以(24±2) ℃室溫處理為對(duì)照，取組培苗莖頂端組織(包含芽尖以及2片完全展開(kāi)的功能葉)；時(shí)空表達(dá)試驗(yàn)材料取組培苗根、莖、葉和芽4部分組織；在干旱脅迫試驗(yàn)中，采用20%(w)PEG6000處理木薯組培苗6 h。以上試驗(yàn)所取組織均用于RNA抽提，本試驗(yàn)中每個(gè)試驗(yàn)樣品均取3次重復(fù)，試驗(yàn)結(jié)果以平均值呈現(xiàn)。

1.2 基因家族成員的序列

從JGI植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)獲得木薯SR基因ID、編碼區(qū)(CDS)長(zhǎng)度和氨基酸長(zhǎng)度，使用序列處理在線工具包(http://www.bio-soft.net/sms/prot_mw.html)計(jì)算蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量，使用Expasy網(wǎng)站(https://web.expasy.org/compute_pi/)計(jì)算木薯SR45相關(guān)蛋白成員理論等電點(diǎn)，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)網(wǎng)址為http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/。

1.3 基因家族分析、氨基酸序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)特征分析

從JGI植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)下載擬南芥、木薯的SR蛋白序列。利用DNAMAN6.0軟件對(duì)木薯SR45蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)。利用MEGA11對(duì)2個(gè)物種46條氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(Neighborjoining法和1 000次迭代bootstrap測(cè)試)。利用TB-tools軟件對(duì)木薯SR-like蛋白結(jié)構(gòu)以及Motif基序進(jìn)行繪制。

1.4 木薯總RNA提取

稱(chēng)取木薯組織樣品1.0 g，用液氮冰凍后充分研磨，按照RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)的說(shuō)明書(shū)，提取木薯總RNA，使用超微量分光光度計(jì)NanoDrop 2000檢測(cè)總RNA的濃度和純度。參照FastKing Gdna Dispelling RT SuperMix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (TaKaRa公司)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，RNA抽提后存放于-80 ℃冰箱。

1.5 RT-qPCR分析

以木薯內(nèi)參基因MeActin為參照，使用RT-qPCR分析基因的相對(duì)表達(dá)量，引物序列見(jiàn)表1。RT-qPCR所用試劑為T(mén)aKaRa公司TB Green?Premix Ex Taq? II(Tli RNaseH Plus)，使用的儀器為 Applied Biosystems StepOneTMand StepOnePlusTMReal-Time PCR Systems，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算分析基因相對(duì)表達(dá)量。本試驗(yàn)RT-qPCR基因特異性引物均利用NCBI網(wǎng)站設(shè)計(jì)，引物合成由北京擎科生物科技有限公司海口合成部(hk-synth@tsingke.net)合成。

表1 MeSR45基因RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences of MeSR45 genes for RT-qPCR

1.6 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

RNA-seq數(shù)據(jù)提交至NCBI的Sequence Read Archive (SRA)，登錄號(hào)為 SRP101302。

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯SR45蛋白理化性質(zhì)與基因序列分析

本研究對(duì)木薯轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出與木薯可變剪接事件相關(guān)的SR45蛋白，分別獲得5個(gè)木薯SR45同源基因，參考擬南芥同源基因命名方式依次命名為MeSR45-1～MeSR45-5，基因號(hào)依次為 Manes.14G016200、Manes.06G171800、Manes.15G168400、Manes.07G135700、Manes.S056000。MeSR45-1～MeSR45-4基因分別分布在木薯14、6、15、7號(hào)染色體上，MeSR45-5的染色體定位未知；蛋白長(zhǎng)度為135～423 aa。推測(cè)MeSR45蛋白相對(duì)分子質(zhì)量介于 14 970～47 210；MeSR45-1～MeSR45-4 等電點(diǎn)（PI）介于 10.97～12.34，為堿性蛋白，而MeSR45-5蛋白的等電點(diǎn)為5.19，為酸性蛋白。利用亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)網(wǎng)站對(duì)MeSR45基因家族蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，MeSR45-1～MeSR45-4蛋白定位于細(xì)胞核和葉綠體，而MeSR45-5蛋白則定位于細(xì)胞核。

2.2 木薯SR基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析篩選出與木薯可變剪接事件相關(guān)的SR45蛋白，從屬于SR基因家族SR-like亞類(lèi)。前人研究中木薯SR基因家族僅有6個(gè)亞類(lèi)[18-19]，因此通過(guò)Blast軟件對(duì)已知的擬南芥SR蛋白序列在木薯蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，篩選鑒定出木薯26種SR蛋白。對(duì)獲得的木薯(26種)和擬南芥(20種)SR蛋白，利用MEGA 11重新構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，如圖1所示。整個(gè)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分為 SR、SC、SCL、RSZ、RS2Z、RS和SR-like 7個(gè)大類(lèi)，其中SR45和SR45a聚為SR-like亞類(lèi)。SR45分支由擬南芥SR45與木薯SR45-1～SR45-5組成，MeSR45-4和MeSR45-5親緣關(guān)系更近；SR45a分支由AtSR45a和MeSR45a-1～MeSR45a-3組成，MeSR45a-1和 MeSR45a-2親緣關(guān)系更近。

圖1 SR蛋白系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic evolution tree of SR protein

2.3 MeSR45蛋白保守Motif結(jié)構(gòu)分析和基因結(jié)構(gòu)分析

為了比較木薯MeSR45蛋白的相似性，通過(guò)MEME網(wǎng)站構(gòu)建MeSR45蛋白Motif并利用TB-tools工具進(jìn)行繪圖。Motif分析表明Motif 3和Motif 6基序共同組成SR45 N端RS結(jié)構(gòu)域，Motif 2和Motif 1基序共同組成RRM結(jié)構(gòu)域。在木薯SR45 亞類(lèi)的 5 個(gè)成員中均有 Motif 6、Motif 2 和Motif 1基序，表明這3個(gè)Motif是MeSR45蛋白序列的重要組成部分；從基序結(jié)構(gòu)上來(lái)看，MeSR45-3與MeSR45-4蛋白具有相同基序，證明其蛋白結(jié)構(gòu)與功能可能相似；MeSR45-1與MeSR45-2蛋白基序差異較小，與MeSR45-2相比，MeSR45-1缺失Motif 3基序且在中間位置多出 Motif 8基序；MeSR45-5蛋白基序較少且相對(duì)保守，在木薯中可能具有重要功能(圖2A、2C、2D)。

從基因結(jié)構(gòu)來(lái)看，木薯SR45亞類(lèi)5個(gè)基因中，外顯子與內(nèi)含子分布差異較大，MeSR45-3、-4、-5預(yù)測(cè)基因內(nèi)含子較少，其中MeSR45-4、-5被1個(gè)內(nèi)含子分割成2個(gè)片段，MeSR45-3有3個(gè)外顯子；MeSR45-1和MeSR45-2氨基酸序列中外顯子與內(nèi)含子較多，且編碼區(qū)零散分布在7 kb的基因組上(圖2B)。

圖2 MeSR45蛋白保守Motif結(jié)構(gòu)和基因結(jié)構(gòu)Fig.2 Consevered motif and gene structures of MeSR45 protein

2.4 木薯SR45蛋白結(jié)構(gòu)分析

利用DNAMAN6.0把木薯的5個(gè)氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)(圖3)，結(jié)果表明，多序列相似性比對(duì)結(jié)果為56.27%。MeSR45 N端結(jié)構(gòu)域較為保守，有RRM結(jié)構(gòu)域以及RS結(jié)構(gòu)域，而C端僅有MeSR45-1和MeSR45-2擁有RS結(jié)構(gòu)域，屬于SR45基因。

圖3 MeSR45氨基酸序列比對(duì)Fig.3 Amino acid sequence alignment of MeSR45

2.5 干旱和低溫脅迫誘導(dǎo)的木薯SR基因家族表達(dá)模式

為研究木薯SR基因家族在非生物脅迫(低溫與干旱)條件下的表達(dá)模式，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析(圖4)發(fā)現(xiàn)，低溫處理24 h后，木薯SR基因家族中，SR-like亞類(lèi)SR45基因除MeSR45-3外均上調(diào)表達(dá)，其中MeSR45-2表達(dá)量最高；SR基因家族其他亞類(lèi)基因MeRS2Z32、MeRS2Z33和MeRSZ22低溫處理后表達(dá)量上升，而MeSCL33低溫處理后下調(diào)表達(dá)，且表達(dá)量處于較低水平。木薯干旱處理后，僅有MeSR20和MeSR45-5表達(dá)量較高，MeSR45中僅有MeSR45-5上調(diào)表達(dá)，而SR-like亞類(lèi)中其他SR45基因下調(diào)表達(dá)，MeSR45a-1表達(dá)量處于較低水平。

圖4 木薯低溫與干旱脅迫條件下SR基因家族表達(dá)熱圖Fig.4 Heat map of SR gene family expression in cassava under low temperature and drought stress

2.6 低溫脅迫誘導(dǎo)的MeSR45基因表達(dá)模式

通過(guò)RT-qPCR分析木薯幼苗頂端葉片以及芽尖在 4 ℃ 低溫分別處理 12、24、48 h 后，MeSR45基因家族成員的基因表達(dá)情況(圖5)。木薯葉片低溫處理后MeCOR、MeSR45-1、MeSR45-2、MeSR45-4、MeSR45-5表達(dá)水平顯著提高，表明其均響應(yīng)低溫脅迫。MeCOR為木薯中響應(yīng)低溫的基因，MeCOR在 12、24、48 h 顯著上調(diào)表達(dá)，在 12 h 表達(dá)最為顯著，表明木薯受到低溫脅迫。木薯SR45基因中MeSR45-2上調(diào)倍數(shù)最高，在低溫處理24、48 h 后分別大約為未處理前 (0 h)的 2 100、2 500倍。MeSR45-1、MeSR45-4和MeSR45-5響應(yīng)木薯低溫，在處理12 h時(shí)的表達(dá)量達(dá)到最高。MeSR45-3在4 ℃低溫處理0～48 h期間相對(duì)表達(dá)量表達(dá)較低，整體呈上升趨勢(shì)，在48 h時(shí)基因相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大值，為木薯低溫處理0 hMeSR45-3相對(duì)表達(dá)量的4倍。結(jié)果表明，木薯SR45基因在低溫脅迫中可能具有相當(dāng)重要的作用。

圖5 低溫脅迫下不同處理時(shí)間木薯MeSR45基因表達(dá)模式Fig.5 MeSR45 gene expression pattern in cassava under low temperature stress at different treatment time

2.7 MeSR45基因在木薯不同組織部位中的特異性表達(dá)

為研究木薯MeSR45基因空間表達(dá)模式，本研究運(yùn)用RT-qPCR對(duì)木薯不同組織部位進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果(圖6)表明，MeSR45-2在木薯葉組織中表達(dá)量最高，為根組織表達(dá)量的160倍左右，在莖與芽中表達(dá)水平較低。MeSR45-4和MeSR45-5基因在木薯根與葉中表達(dá)量較高，在莖與芽中較低。MeSR45-1在根與芽中表達(dá)量較高，在莖與葉中較低。MeSR45-3在芽中表達(dá)量較高，在其他組織中較低。這5個(gè)基因在木薯不同組織的表達(dá)模式差異較大，可能表明它們?cè)诓煌M織中行使的功能具有差異。

圖6 MeSR45亞家族基因在木薯不同組織部位中的表達(dá)模式Fig.6 Expression patterns of MeSR45 subfamily gene in different cassava tissues

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

SR45在植物細(xì)胞中是一類(lèi)重要的剪接因子，可以參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程并且具有應(yīng)對(duì)非生物脅迫的作用[12,23]。在擬南芥中，SR45蛋白通過(guò)與mRNA前體、U1-70K和U2AF35b相互作用，分別將 U1 snRNP 和 U2AF 招募到 5′和 3′剪接位點(diǎn)，并調(diào)節(jié)可變剪接過(guò)程[24]；擬南芥SR45蛋白缺失突變體SR45-1普遍表現(xiàn)出發(fā)育遲緩、根生長(zhǎng)緩慢以及葉和花形態(tài)改變。2種擬南芥SR45可變剪接亞型具有不同的功能，一種亞型恢復(fù)根系生長(zhǎng)，另一種亞型彌補(bǔ)突變體的花表型，這一過(guò)程表明SR45可變剪接具有重要功能意義[12,25-26]。在水稻中，OsFKBP20-1b在體內(nèi)與OsSR45在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中相互作用，表明這2種蛋白可能共同參與了植物細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的mRNA加工[27]。此外，SR45蛋白在應(yīng)對(duì)鹽脅迫時(shí)具有重要的作用，擬南芥中SR45缺失突變體導(dǎo)致鹽脅迫敏感性增強(qiáng)，調(diào)控鹽脅迫基因的表達(dá)與可變剪接發(fā)生變化，可變剪接長(zhǎng)亞型SR45.1可以挽救鹽脅迫敏感特性[22]。目前，植物SR45蛋白研究具有一定的進(jìn)展，但是有關(guān)木薯SR45基因特性、系統(tǒng)進(jìn)化與非生物脅迫響應(yīng)的報(bào)道較少。

本研究在Gu等[18]研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步鑒定木薯SR基因家族，補(bǔ)充SR-like亞類(lèi)SR45、SR45a共8個(gè)基因；補(bǔ)充SC亞類(lèi)MeSC35-2蛋白并去除RSZ亞類(lèi)中MeRSZ23蛋白，MeRSZ23蛋白與RSZ亞類(lèi)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，影響SR基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，最終重新鑒定木薯SR基因家族為7大亞類(lèi)26個(gè)成員。木薯基因結(jié)構(gòu)與保守分析表明，MeSR45-1和MeSR45-2擁有相似的基序，并且外顯子在基因中分布相似；而MeSR45-3和MeSR45-4保守基序相同，因此推測(cè)MeSR45-1和MeSR45-2、MeSR45-3和MeSR45-4可能存在基因復(fù)制事件。通過(guò)木薯SR45序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)5個(gè)氨基酸序列均有RRM結(jié)構(gòu)域和N端RS結(jié)構(gòu)域，但在C端MeSR45-3、MeSR45-4和MeSR45-5缺失RS結(jié)構(gòu)域，這可能表明RS結(jié)構(gòu)域在兩端具有不同的功能，且N端RS結(jié)構(gòu)域保守。有趣的是Tanabe等[28]發(fā)現(xiàn)AtSR45a蛋白的C端RS結(jié)構(gòu)域是與 U1-70K、U2AF35b、AtSR45、AtSCL28、PRP38-like蛋白及其自身相互作用所必需的，而N端RS結(jié)構(gòu)域則提高了相互作用的效率。因此，木薯SR45蛋白保守結(jié)構(gòu)域的差異性有待進(jìn)一步研究。

關(guān)于植物SR亞家族(SR45)成員應(yīng)對(duì)非生物脅迫的研究相對(duì)較少，目前僅有部分模式作物在應(yīng)對(duì)干旱脅迫與鹽脅迫上具有相關(guān)研究進(jìn)展[29]。因此，木薯作為一種熱帶低溫敏感和耐貧瘠作物，發(fā)掘木薯SR45基因資源，對(duì)木薯以及其他熱帶作物應(yīng)對(duì)低溫、干旱脅迫以及其他非生物脅迫具有重要的意義。本研究發(fā)現(xiàn)木薯SR45基因與木薯應(yīng)對(duì)低溫脅迫具有密切的關(guān)系，全部成員均響應(yīng)木薯低溫，尤其是MeSR45-2基因，在低溫處理48 h后基因表達(dá)量比未處理木薯上調(diào)約2 600倍，猜測(cè)MeSR45-2為SR45家族基因響應(yīng)木薯低溫脅迫最重要成員。基因組織特異性表達(dá)可以初步預(yù)測(cè)其相應(yīng)的功能[30]，在木薯組織表達(dá)中，MeSR45-2基因在葉片中特異性表達(dá)，而葉片為木薯響應(yīng)低溫脅迫的主要器官之一，因此MeSR45-2基因功能有待深入研究。除此之外，木薯根可能為木薯SR45蛋白響應(yīng)其功能的重要組織。Zhang等[26]發(fā)現(xiàn)擬南芥SR45-1蛋白缺陷突變體相比正常擬南芥表現(xiàn)出根生長(zhǎng)缺陷和花瓣缺陷表型，而擬南芥過(guò)表達(dá)SR45.2(SR45蛋白亞型2)株系可以恢復(fù)根生長(zhǎng)缺陷的表型。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)MeSR45-1、MeSR45-4和MeSR45-5在木薯根中表達(dá)量較高。因此在接下來(lái)的研究中，木薯的葉與根為主要研究器官。

3.2 結(jié)論

本研究通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)木薯SR45基因亞家族成員進(jìn)行分析，確定了木薯SR基因家族的分類(lèi)和進(jìn)化關(guān)系。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析了低溫、干旱脅迫處理下的基因表達(dá)特性，并通過(guò)RT-qPCR研究了低溫脅迫條件下SR45基因的表達(dá)特性以及SR45基因的組織特異性表達(dá)模式。本研究表明SR45亞家族基因參與木薯低溫和干旱脅迫應(yīng)答和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，而木薯SR45亞家族基因中MeSR45-2基因?qū)Φ蜏孛{迫顯著響應(yīng)，并且在木薯的葉片中表達(dá)量較高。該研究把MeSR45-2基因列為調(diào)控低溫逆境變化的候選基因，同時(shí)將木薯的根與葉列為研究SR45基因亞類(lèi)成員的主要植物組織，也為進(jìn)一步研究木薯MeSR45基因應(yīng)對(duì)低溫等非生物脅迫提供了重要參考。