牟朋林 麥彩園 王 斌

1 廣州新海醫(yī)院，廣東省廣州市 510080； 2 廣東省婦幼保健院； 3 佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是一種代謝性疾病，臨床特征為骨量及質(zhì)量、骨強度下降為主[1]。我國50歲以上女性患病率超過了20%[2]。成骨細胞(Osteoblast，OB)和破骨細胞(Osteoclast，OC)調(diào)節(jié)代謝失衡，影響鈣質(zhì)吸收利用，導(dǎo)致骨量減少、骨骼破壞，引起疼痛、骨折等問題[3]。miRNA是一種非編碼RNA，在腫瘤、骨與代謝等多個領(lǐng)域被研究[4]。近年來，miRNA在BMSCs和成骨中關(guān)注越來越多。研究表明miR-92b-3p可促進成骨分化[5]。生長分化因子GDF11(Growth differentiation factor 11)是屬于轉(zhuǎn)錄生長因子TGF-β超家族的一名成員。已知的TGF家族成員參與調(diào)控骨改建過程，如TGF-β促進破骨形成、抑制成骨分化[6]。而GDF11是否可以作為miR-92b-3p的靶點對BMSCs作用還不清楚。本文探討miR-92b-3p靶向GDF11對BMSCs調(diào)節(jié)成骨的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本研究方案按照1964年赫爾辛斯基宣言規(guī)定，由新海醫(yī)院的動物試驗倫理委員會審查通過。本研究選擇從廣州賽業(yè)生物科技有限公司購買糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠模型-SPF wistar大鼠10只。大鼠被處死，收集股骨近端1/3處的骨髓腔組織。

1.2 儀器與試劑 實時PCR儀、流式細胞儀：Progmega公司，美國。熒光素酶報告檢測系統(tǒng)：Bio-Rad公司，美國。RNA提取試劑盒：Takara鐸洋生物有限公司，中國。ALP、茜素紅染色試劑盒、載體：Takara公司，中國。DMEM培養(yǎng)基、成骨分化培養(yǎng)液：Bio-Rad公司，美國。胎牛血清、質(zhì)粒、Lipofectamine 2000、293Tcell：Invitrogen公司，美國。質(zhì)粒抽提試劑盒：Sigma公司，美國。模擬物及抑制物、RNAiMAX、Trizol試劑：QIAGEN公司，德國。

1.3 實驗方法

1.3.1 BMSCs細胞培養(yǎng)：從髓腔抽取骨髓4ml，建立BMSCs的體外培養(yǎng)體系，予以成骨分化：將骨髓與DMEM培養(yǎng)液混合。室溫離心，去上清。重懸細胞，將懸液緩慢注入Percoll分離液，離心，吸取中間細胞層，加入培養(yǎng)基，吹打獲得含有BMSCs細胞的懸液。于培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，換液，顯微鏡下觀察。胰酶消化，調(diào)節(jié)細胞濃度至2×105個/ml，繼續(xù)細胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)。待細胞融合達到70%～80%，傳代培養(yǎng)。取第3代BMSCs，加入成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)，提取RNA，進行qPCR。

1.3.2 qPCR：取樣品，移至RNAiso Plus液EP管，混合，加入氯仿，混合離心。上層加異丙醇，然后離心。移去上清，加入乙醇。離心棄去上清，加入無RNA酶水，讀取OD值。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄將RNA合成cDNA。按以下條件擴增：95℃20s，95℃1s，60℃20s，40cycles。計算所有樣品的Ct值，以2-ΔΔCt表示相對表達量。

1.3.3 堿性磷酸酶(ALP)染色：根據(jù)ALP程序說明，測試ALP活性。收集BMSCs并裂解。離心，收集上清液，然后用對硝基苯磷酸酯孵育。酶標儀測OD值。

1.3.4 茜素紅染色：將PMOP細胞用PBS洗滌，多聚甲醛固定，茜素紅溶液染色。蒸餾水洗后行細胞照相。檢測細胞鈣沉積，以此反應(yīng)成骨細胞鈣化。

1.3.5 細胞轉(zhuǎn)染：購買miR-92b-3p模擬物(mimics)和相應(yīng)的陰性對照(NC group)、miR-92b-3p 抑制物(inhibitor)和對照(NC)。細胞鋪于孔板中，融合，吸出培養(yǎng)液，PBS緩沖液沖洗，更換養(yǎng)液，用Opti-MEM培養(yǎng)液將質(zhì)粒分別稀釋，取對應(yīng)組的RNA加入于轉(zhuǎn)染試劑中，孵育加入培養(yǎng)液中，培養(yǎng)后換普通培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)行表達量驗證。miR-92b-3p過表達48h后換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)。在誘導(dǎo)的7、14、21d 分別檢測ALP和茜素紅染色。共分為四組：BMSC組、BMSC+成骨分化液組、BMSC+過表達miR-92b-3p對照組、BMSC+過表達miR-92b-3p組。誘導(dǎo)第7天用qPCR檢測各組BMSCs成骨特異性因子Runx2及靶基因GDF11的表達。

1.3.6 雙重?zé)晒馑孛笀蟾婊驒z測：利用targetscan網(wǎng)站預(yù)測，miR-92b-3p可能結(jié)合的靶位點：GDF11。進行熒光素酶結(jié)合試驗，構(gòu)建含miR-92b-3p結(jié)合位點的質(zhì)粒命名為pMIR-GDF11-WT(野生型)、pMIR-GDF11-MT(突變型)。進行miR-92b-3p轉(zhuǎn)染，將細胞接種于24孔板中，并用Lipofectamine 2000將pMIR-GDF11-WT/pMIR-GDF11-MT載體與miR-92b-3p mimics共轉(zhuǎn)染至293T細胞。48h后用熒光素酶檢測。

2 結(jié)果

2.1 qPCR驗證miR-92b-3p過表達 將模擬物過表達轉(zhuǎn)染48h的細胞收集并提取RNA，后進行qPCR實驗示模擬物過表達轉(zhuǎn)染后細胞miR-92b-3p表達水平顯著上升：相對值由2.21±0.24上升至6.49±1.21(P<0.05)。

2.2 過表達miR-92b-3p后成骨能力升高 傳代細胞行miR-92b-3p過表達轉(zhuǎn)染，行ALP和茜素紅染色，過表達miR-92b-3p后隨著誘導(dǎo)時間增加，ALP水平逐漸上升，茜素紅染色結(jié)節(jié)沉積逐增加(圖1～2)。qPCR顯示Runx2表達：BMSC+成骨分化液組顯著上升，BMSC+過表達miR-92b-3p組顯著上升；GDF11的表達：BMSC+成骨分化液組顯著下降，BMSC+過表達miR-92b-3p組顯著下降(圖3)。

圖1 過表達miR后成骨 圖2 過表達miR后ALP

圖3 qPCR檢測Runx2和GDF11的表達

2.3 miR-92b-3p與GDF11結(jié)合位點驗證 使用targetscan網(wǎng)站找到miR-92b-3p與GDF11的結(jié)合靶點，如圖4所示。熒光素酶報告基因示miR-92b-3p可顯著抑制pMIR-GDF11-WT的熒光素酶活性，而不影響pMIR-GDF11-MT活性(圖4～5)。

圖4 GDF11的mRNA與miR-92b-3p結(jié)合位點

圖5 熒光素酶報告實驗

3 討論

糖尿病性骨質(zhì)疏松癥(Diabetic osteoporosis,DOP)是一種常見的由糖尿病引發(fā)的慢性代謝性骨病。發(fā)病率和病死率逐年升高的,迫切使臨床研究新的方法治療。本文研究[7]。BMSCs是一種“多能細胞”,可以分化為成骨、軟骨等細胞，研究表明在OP狀態(tài)時，BMSCs分化紊亂,成骨能力減低[8]。miRNA是一種非編碼單鏈RNA，大量存在于BMSCs內(nèi)，影響各類細胞包括骨細胞的增殖[9-10]。miR-92b-3p通過靶向SGK3抑制C2C12細胞增殖并阻止C2C12細胞遷移[11]。白藜蘆醇通過增加miR-92b-3p的表達減弱NADPH氧化酶4 /核因子κB途徑，對雌激素缺乏癥引起的骨質(zhì)疏松起保護作用[12]。近年來，在OP中miRNA調(diào)控BMSCs分化已成為熱點, miR-92b-3p可抑制DKKl進而促進在人臍帶間充質(zhì)干細胞的成骨分化[5]。

GDF11可通過激活PI3K/Ak通路抑制糖尿病小鼠BMSCs凋亡[13]。既往研究表明，GDF11的缺失會引起骨骼相關(guān)的疾病:如GDF11敲除小鼠表現(xiàn)了骨骼相關(guān)疾??；抑制GDF11的功能會導(dǎo)致骨量的增加；GDF參與調(diào)控牙本質(zhì)的分化并修復(fù)牙本質(zhì)[6]。一些研究認為，GDF11能作為抗衰老因子，血清中的GDF11水平隨著年齡的增加而減少，GDF11能修復(fù)老年引起的大腦、骨骼肌及心肌干細胞的功能紊亂；然而，另一些研究得出完全相反的結(jié)論，認為血清中GDF11水平并不隨著年齡增加而增加，提高GDF11水平是老年相關(guān)疾病的危險因素，對小鼠全身用rGDF11處理抑制了骨骼肌的再生肌并不能修復(fù)老年相關(guān)的病理性心肌肥大[6]。這些相悖的研究結(jié)果，加上以往對于GDF11作為骨改建的調(diào)控因子的體內(nèi)機制尚不明確，讓本研究更迫切去研究GDF11是否與骨量丟失有關(guān)。

本研究用qPCR法發(fā)現(xiàn)GDF11的表達在BMSC+成骨分化液組顯著下降，說明GDF11抑制成骨分化。qPCR法分析檢測miR-92b-3p在BMSCs誘導(dǎo)分化為OB的表達：過表達miR-92b-3p后BMSCs成骨能力顯著增強；過表達模擬物轉(zhuǎn)染后miR-92b-3p水平上升，證明miR-92b-3p促進成骨，參與OP的形成。

本研究合成了GDF11野生型和突變型序列。導(dǎo)入miR-92b-3p模擬物可與GDF11野生型結(jié)合，說明GDF11是miR-92b-3p的靶基因。成骨誘導(dǎo)第7天，Runx2表達：BMSC+成骨分化液組顯著上升，BMSC+過表達miR-92b-3p組顯著上升；GDF11的表達：BMSC+成骨分化液組顯著降低，BMSC+過表達miR-92b-3p組顯著降低。故進一步推論GDF11為miR-92b-3p的結(jié)合靶點。

本實驗不足之處如下，沒有進一步行Western blotting檢測miR-92b-3p的分化。本研究證實miR-92b-3p可通過GDF11因子作為靶點調(diào)節(jié)BMSCs分化參與OP的形成過程。為OP患者治療及研究提供了一定的依據(jù)。