楊馥宇，劉 輝，蘇 杰，王 玲，王林洪

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy， DR)發(fā)病率為24%～70%，普遍認(rèn)為其發(fā)生與氧化應(yīng)激、免疫/炎癥、基因多態(tài)性等理論有關(guān)，隨著研究不斷深入，部分學(xué)者指出免疫/炎癥理論在DR發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[1-2]。白細(xì)胞介素-6(IL-6)為多效性細(xì)胞因子，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)，IL-6在DR大鼠或患者外周血、視網(wǎng)膜組織中呈異常高表達(dá)[3-4]。而高水平IL-6可持續(xù)刺激磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)，激活小膠質(zhì)細(xì)胞，分泌過(guò)量IL-6，加劇視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡[5]。由此可見(jiàn)，調(diào)控IL-6、STAT3表達(dá)有望減輕DR患者炎癥反應(yīng)，延緩病情進(jìn)展。曲克蘆丁具有抗炎、抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡等諸多優(yōu)勢(shì)，但從IL-6、STAT3分子層面分析其在DR大鼠中應(yīng)用效果的研究較少。本研究建立DR大鼠模型，觀察IL-6、STAT3蛋白變化及曲克蘆丁水溶液的治療效果?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1材料 曲克蘆丁水溶液(神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H13023722)；IL-6、STAT3試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；血糖測(cè)定試劑盒購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性大鼠60只，購(gòu)自北京華阜康公司，體質(zhì)量200～220 g，飼養(yǎng)于25 ℃環(huán)境下，空氣流通，12 h光照維持，采用鼠全價(jià)顆粒飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d。

1.3模型建立 將1.5 g鏈脲佐菌素溶于2% 0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液(pH 4.6)，大鼠空腹12 h后，以50 mg/kg劑量進(jìn)行腹腔穿刺，回抽針?biāo)?，無(wú)氣體、血液后注入藥物，造模3 d監(jiān)測(cè)血糖變化，當(dāng)空腹血糖(FPG)>16.5 mmol/L時(shí)，判定為DR模型制備成功[6]。

1.4動(dòng)物分組及治療 取20只大鼠為正常組，每天給予生理鹽水100 mg/kg灌胃。建立DR模型后，隨機(jī)分為模型對(duì)照組和曲克蘆丁水溶液組，各20只。模型對(duì)照組每天給予生理鹽水100 mg/kg灌胃，曲克蘆丁水溶液組每天給予曲克蘆丁水溶液100 mg/kg灌胃。灌胃12周后剔除生理狀態(tài)差、體質(zhì)量差異大及死亡大鼠，后于3組中隨機(jī)選取12只大鼠行實(shí)驗(yàn)研究。

1.5標(biāo)本采集 治療12周后，過(guò)量麻醉處死大鼠，取大鼠完整眼球，分離眼周?chē)浗M織，取出并剪開(kāi)眼球，去除房水及晶狀體，充分暴露視網(wǎng)膜，清洗干凈后放入試管，液氮凍存。

1.6視網(wǎng)膜組織IL-6、STAT3測(cè)定 視網(wǎng)膜組織稱重后，采用冰浴研磨法制作10%組織勻漿，二辛可寧酸法檢測(cè)10%組織勻漿總蛋白濃度，樣本稀釋液稀釋，調(diào)整各樣本總蛋白濃度，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定IL-6蛋白含量。采用蛋白免疫印跡法測(cè)定STAT3水平。TRIzol法提取視網(wǎng)膜組織總蛋白，提取的每只大鼠視網(wǎng)膜組織等量加入100 μl裂解液，反復(fù)過(guò)濾、離心，取30 μg樣本，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，37 ℃環(huán)境封閉2 h，加入稀釋500倍的STAT3抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，磷酸鹽緩沖溶液沖洗后與二抗結(jié)合，孵育1 h后顯色，蛋白相對(duì)表達(dá)水平以目的蛋白條帶灰度與內(nèi)參的比值表示。

1.7大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡指數(shù) 摘取大鼠眼球后，常規(guī)固定、脫水、浸蠟包埋，切片厚度4 μm，應(yīng)用光鏡及透射電鏡觀察視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)，記錄視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡數(shù)目，應(yīng)用IPP 6.0圖像分析軟件分析染色結(jié)果，計(jì)算視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡指數(shù)。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)量/細(xì)胞總數(shù)量×100%。

1.8血糖測(cè)定 于大鼠尾部穿刺取血，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定FPG、糖化血紅蛋白(HbA1c)水平。

2 結(jié)果

2.1大鼠一般情況 正常組大鼠體形適中，精神狀態(tài)良好，毛發(fā)光澤，反應(yīng)靈敏，晶狀體透明；模型對(duì)照組和曲克蘆丁水溶液組大鼠體形消瘦，精神萎靡，腹部肥大，毛發(fā)欠光澤，易脫毛，動(dòng)作遲緩，晶狀體渾濁，甚至晶狀體皮質(zhì)溶解，角膜邊緣新生血管生長(zhǎng)。

2.2大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài) 光鏡下，正常組視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)正常，各層細(xì)胞排列規(guī)則，外顆粒層感光細(xì)胞分布均勻，內(nèi)顆粒層細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，各層纖維結(jié)構(gòu)無(wú)異常；模型對(duì)照組視網(wǎng)膜水腫，內(nèi)核層、外核層細(xì)胞間水腫，細(xì)胞排列紊亂；曲克蘆丁水溶液組視網(wǎng)膜厚度接近正常，外核層細(xì)胞間稍疏松，排列較整齊。透射電鏡下，正常組大鼠視網(wǎng)膜顯微結(jié)構(gòu)無(wú)異常，模型對(duì)照組可見(jiàn)細(xì)胞外節(jié)內(nèi)膜盤(pán)排列紊亂，含糖原顆粒沉淀，早期色素上皮細(xì)胞微絨毛脫落，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張；曲克蘆丁水溶液組可見(jiàn)外節(jié)內(nèi)膜盤(pán)排列整齊，色素上皮細(xì)胞微絨毛排列稀疏，細(xì)胞膜內(nèi)褶排列緊密。

2.3大鼠血糖測(cè)定結(jié)果 造模3 d后，曲克蘆丁水溶液組、模型對(duì)照組FPG、HbA1c高于正常組(P<0.05)，但曲克蘆丁水溶液組與模型對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療12周后，曲克蘆丁水溶液組、模型對(duì)照組FPG、HbA1c高于正常組，但低于同組造模3 d后(P<0.05)；治療12周后，曲克蘆丁水溶液組FPG、HbA1c低于模型對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠血糖測(cè)定結(jié)果比較

2.4大鼠視網(wǎng)膜組織IL-6、STAT3水平及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡指數(shù) 曲克蘆丁水溶液組、模型對(duì)照組視網(wǎng)膜組織IL-6、STAT3水平及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡指數(shù)高于正常組，且曲克蘆丁水溶液組低于模型對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡指數(shù)及視網(wǎng)膜組織IL-6、STAT3水平比較

3 討論

調(diào)查顯示，糖尿病病程>10年者眼底病變發(fā)病率為69%～90%，以DR尤為常見(jiàn)[7-8]。因此，本研究建立大鼠DR模型，造模3 d后模型對(duì)照組和曲克蘆丁水溶液組FPG水平均>16.5 mmol/L，分別給予生理鹽水、曲克蘆丁水溶液灌胃，治療12周后，曲克蘆丁水溶液組FPG、HbA1c水平均低于模型對(duì)照組，考慮與曲克蘆丁水溶液具有抗炎、抗氧化作用有關(guān)，可顯著減輕炎癥、氧化應(yīng)激所致胰島素抵抗，起到控制血糖的目的，但具體機(jī)制不明。

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，血-視網(wǎng)膜屏障破壞及微血管病變是DR早期典型特征。新近研究指出，典型視網(wǎng)膜微血管改變前，機(jī)體已出現(xiàn)視功能減退及視神經(jīng)損傷，表現(xiàn)為色覺(jué)、對(duì)比敏感度、視網(wǎng)膜電圖等異常[9-10]。研究表明，1型糖尿病大鼠模型建立4周后出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞丟失與凋亡[11]。神經(jīng)節(jié)對(duì)細(xì)胞損傷及神經(jīng)毒性作用高度敏感，可為DR早期病變鑒別診斷提供有利依據(jù)，盡早抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡是控制DR病情進(jìn)展關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

研究表明，免疫炎癥是DR發(fā)病重要機(jī)制，調(diào)控免疫炎癥有望控制疾病進(jìn)展，但關(guān)于免疫炎癥產(chǎn)生的確切分子機(jī)制尚不完全清楚[12]。IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路激活可促使B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，刺激IL-6自分泌，形成正前饋循環(huán)，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，在糖尿病、DR等疾病中扮演重要角色[13]。IL-6主要作用為促進(jìn)血管活性物質(zhì)分泌、介導(dǎo)炎癥纖維蛋白表達(dá)。當(dāng)前研究證實(shí)，高水平IL-6是DR發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[14]。長(zhǎng)期高血糖環(huán)境下，胰島細(xì)胞可合成大量IL-6，激活一系列炎癥和免疫應(yīng)答反應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，加重胰島素抵抗，增加DR發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[15-16]。同時(shí)IL-6可結(jié)合靶細(xì)胞表面IL-6受體(sIL-6R)，形成sIL-6R/IL-6復(fù)合物，活化細(xì)胞膜表面糖蛋白130，刺激JAK2，活化受體酪氨酸激酶，結(jié)合STAT3蛋白，促進(jìn)STAT3磷酸化。磷酸化的STAT3可刺激核因子-κB(NF-κB)，使其轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核后，釋放過(guò)量炎性因子，正反饋?zhàn)饔糜贜F-κB，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加劇視網(wǎng)膜組織損傷[17-18]。另外缺氧條件下，STAT3高表達(dá)會(huì)啟動(dòng)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)基底膜增厚、微動(dòng)脈瘤形成、新生血管形成等一系列病理變化，最終演變?yōu)镈R[19]。因此，調(diào)控IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路有望成為臨床治療DR的靶點(diǎn)之一。

曲克蘆丁是蘆丁衍生物，其治療DR機(jī)制為，抑制血小板聚集，阻斷血栓形成；抑制Fenton反應(yīng)及脂質(zhì)過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，產(chǎn)生明顯抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用；減少活性氧生成，抑制炎癥激活，發(fā)揮抗炎作用[20]。本研究顯示，曲克蘆丁水溶液組視網(wǎng)膜組織IL-6、STAT3水平及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡指數(shù)低于模型對(duì)照組。提示曲克蘆丁水溶液可通過(guò)調(diào)節(jié)IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路減輕炎癥反應(yīng)，阻礙視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡，保護(hù)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管，促進(jìn)DR病情轉(zhuǎn)歸。仍需注意的是，曲克蘆丁水溶液組各指標(biāo)均與正常組存在一定差異。提示曲克蘆丁水溶液治療DR大鼠效果仍存在一定局限性，建議后續(xù)通過(guò)延長(zhǎng)曲克蘆丁水溶液治療時(shí)間、增加曲克蘆丁水溶液劑量等方面進(jìn)行更深入研究。

綜上所述，DR大鼠視網(wǎng)膜組織IL-6、STAT3呈高表達(dá)，經(jīng)曲克蘆丁水溶液治療后其水平降低，但本研究?jī)H采取實(shí)驗(yàn)性DR大鼠展開(kāi)研究，建議將來(lái)通過(guò)體外研究進(jìn)一步探討曲克蘆丁水溶液治療DR的作用靶點(diǎn)及關(guān)鍵機(jī)制。