謝海珊，程麗琴,王慶紅，韋瑞紅，周 瑾

脆性X智力低下1(FMR1)基因位于X染色體Xq27.3處，其5' 末端非編碼區(qū)含有高度多態(tài)性FMR1基因(CGG)三核苷酸短串聯(lián)重復序列，上游啟動子區(qū)存在一個CpG島[1]。FMR1基因全突變可致脆性X綜合征(FXS)，臨床常有典型的遺傳性智力低下或自閉癥等表現(xiàn)，對患者生活質(zhì)量造成不利影響。研究表明，在同一種族和民族群體中，F(xiàn)MR1等位基因的CGG重復大小在兩性中分布相似，但不同群體中FMR1等位基因的攜帶率存在差異[2]。目前，我國尚缺乏多中心、大范圍FMR1基因篩查研究。故加強不同地區(qū)FMR1基因突變攜帶者篩查，不僅可為我國人群FMR1基因分布情況提供理論依據(jù)，而且對預防FXS患兒的出生具有重要意義。本研究主要通過對深圳市育齡女性進行FMR1基因篩查，獲得本市育齡女性FMR1基因分布情況，以期為本市FXS預警、產(chǎn)前篩查和遺傳咨詢提供理論基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1研究對象 募集2020年12月—2021年9月在我院門診就診或住院的育齡女性中具有不明原因自然流產(chǎn)、稽留流產(chǎn)、復發(fā)性流產(chǎn)(孕20周內(nèi)流產(chǎn)≥2次)、原發(fā)不孕、因胎兒畸形或死胎引產(chǎn)、有不明原因的智力發(fā)育遲緩等不良生育史患者，以及具有抑郁癥、精神分裂癥等精神疾病和不明原因的卵巢功能不全或卵巢早衰或自愿參加FMR1基因檢測的育齡女性。共有100名育齡女性參加本研究，年齡18～47(30.85±4.86)歲。

1.2研究方法

1.2.1標本采集:所有研究對象抽取外周靜脈血2 ml于EDTA-K2抗凝管中，2～4 ℃冰箱保存待測。

1.2.2DNA提取:依次將20 μl蛋白酶K、200 μl全血樣本及200 μl Buffer AL加入1.5 ml離心管中，振蕩混勻、短暫離心后56 ℃孵育15 min,短暫離心，加入200 μl無水乙醇、振蕩混勻并短暫離心，將所得混合液移入QIAamp離心柱中并套進2 ml收集管中，8000 r/min離心1 min，棄去收集管及其中濾液，將離心柱套進新的2 ml收集管中，分別加入500 μl AW1、500 μl AW2并重復8000 r/min離心1 min、棄廢液，后12 000 r/min離心2 min，將離心柱置于新的1.5 ml收集管中，打開蓋子室溫下晾干3 min，使乙醇揮發(fā)干凈，將100 μl Buffer AE加入離心柱，室溫孵育5 min后12 000 r/min離心2 min，對核酸樣本進行洗脫，最后棄離心柱，保存洗脫液備用。

1.2.3PCR擴增:將除Taq DNA聚合酶外的所有試劑于室溫下解凍后渦旋，受檢樣本和對照樣本PCR反應(yīng)體系總體積均為25 μl，包括8.5 μl甜菜堿、1 μl 4%二甲亞砜，2.5 μl PCR Buffer Ⅱ、3 μl dNTPs、0.75 μl FAM標記正向引物、0.75 μl反向引物、0.75 μl CGG引物、0.225 μl DNA聚合酶、2 μl受檢樣本/對照樣本,雙蒸水補足至25 μl。充分混勻、密封，再次渦旋、短暫離心后轉(zhuǎn)到PCR擴增儀中。PCR反應(yīng)條件：98 ℃預變性10 min后進行10個循環(huán)：97 ℃ 35 s，62 ℃ 35 s， 68 ℃ 4 min，接著行25個循環(huán)：97 ℃ 35 s，62 ℃ 35 s，68 ℃ 4 min且每個循環(huán)增加20 s，然后68 ℃延伸10 min后迅速轉(zhuǎn)至4 ℃環(huán)境中。

1.2.4毛細管電泳:室溫解凍甲酰胺(HiDi)、LIZ1200，振蕩渦旋、短暫離心，取5 μl HiDi與0.2 μl LIZ1200混勻備用，后取5 μl混合物與0.5 μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物有序加入96孔板，封膜、短暫離心后轉(zhuǎn)至PCR擴增儀中，95 ℃ 2 min變性后于4 ℃環(huán)境避光保存。使用美國ABI 3730xl基因測序儀對PCR產(chǎn)物行毛細管電泳，最后用Gene Marker V1.91軟件實現(xiàn)CGG重復次數(shù)與長度的轉(zhuǎn)換。

1.2.5判斷標準：CGG重復數(shù)在6～44次為正常型，45～54次為中間型或灰色區(qū)域，55～200次為前突變，>200次為全突變。在同一個體中，將FMR1 2個等位基因中CGG重復次數(shù)少者稱為等位基因1，CGG重復次數(shù)多者稱為等位基因2，CGG重復數(shù)<26定義為低正常范圍等位基因，>34定義為高正常范圍等位基因[3-4]。

1.3統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 25.0軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以率(%)表示，比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.13組等位基因分布 100名育齡女性中78名具有不良生育史，根據(jù)不良生育史分為自然流產(chǎn)組(15名)、復發(fā)性流產(chǎn)組(42名)和其他異常生育史組(21名)。3組2個FMR1等位基因中最常見CGG重復數(shù)為29和30(圖1)，將3組CGG重復序列變異范圍分為連續(xù)的3組，等位基因1自然流產(chǎn)組≤25及≥35 0例，26～34 15例；復發(fā)性流產(chǎn)組≤25及≥35各1例，26～34 40例；其他異常生育史組≤25 1例，26～34 20例，≥35 0例。等位基因2自然流產(chǎn)組≤25 0例，26～34 12例，≥35 3例；復發(fā)性流產(chǎn)組≤25 0例，26～34 25例，≥35 17例；其他異常生育史組≤25 0例，26～34 17例，≥35 4例。3組間FMR1等位基因1及等位基因2 CGG重復序列分布情況比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 3組育齡女性FMR1等位基因1和2 CGG重復序列分布A.FMR1等位基因1，B.FMR1等位基因2；FMR1為脆性X智力低下1

2.2100名育齡女性FMR1等位基因重復序列分布 100名育齡女性共檢出15種不同CGG重復序列等位基因，CGG重復數(shù)范圍為21～44，最常見重復數(shù)為30，其次為29、31、36。其中最常見基因型為30/30、其次為29/29。100名育齡女性FMR1等位基因CGG重復序列分布見圖2。

圖2 100名育齡女性FMR1等位基因CGG重復序列分布FMR1為脆性X智力低下1

3 討論

FXS是一種X連鎖顯性遺傳病，為常見致遺傳性智力障礙的原因，發(fā)病率僅次于唐氏綜合征[5-6]，發(fā)病機制為FMR1基因5' 非翻譯區(qū)CGG重復序列的異常擴增和CGG重復序列及啟動子區(qū)CpG島的高度甲基化導致基因轉(zhuǎn)錄抑制，引起編碼蛋白脆性X智力低下蛋白缺失而致病，另有1%～2%的FXS病例是由FMR1基因點突變、無義突變或缺失引起的。攜帶FMR1全突變基因的男性患者會受到FXS影響，而女性患者因2條X染色體隨機失活，只有30%～50%的全突變等位基因攜帶者受到FXS影響[7]。約20%攜帶FMR1前突變等位基因的女性患有FXPOI，且患病率隨著CGG重復序列長度的擴增而變化，最常見的CGG重復數(shù)為80～100。約40%攜帶FMR1前突變基因的男性有患FXTAS的風險，但約16%的FMR1前突變等位基因的女性攜帶者有患FXTAS的風險。前突變等位基因高度不穩(wěn)定，可能在1代傳遞過程中就擴增到更高的CGG重復大小甚至全突變，而這通常發(fā)生在母系傳遞的過程中[3]。目前對于灰區(qū)的臨床意義尚無統(tǒng)一結(jié)論，雖然灰區(qū)不會引起FXS，但是約有4.7%的灰區(qū)等位基因不穩(wěn)定，在母系傳遞過程中可能擴增到前突變等位基因范圍[8]。正常等位基因很少有減數(shù)分裂或有絲分裂不穩(wěn)定，可穩(wěn)定行代際傳遞[9]。

美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學會建議對有脆性X相關(guān)疾病家族史或可能有FXS相關(guān)智力障礙的計劃妊娠或孕期女性進行FMR1前突變等位基因篩查[10]。據(jù)估計，美國和英國FXS患者終身護理成本分別為615 397美元和380 000英鎊[11-12]。我國臺灣地區(qū)每進行一次FXS基因檢測約需125美元，每鑒定一位女性前突變或全突變基因攜帶者約需118 885美元，每鑒定出一個全突變基因胎兒的總費用約為410 091美元[13]。故對育齡女性行FXS攜帶者篩查可能是可取的。

本研究發(fā)現(xiàn)3組FMR1等位基因1和等位基因2 CGG重復序列分布差異均無統(tǒng)計學意義，且未發(fā)現(xiàn)FMR1突變基因攜帶者。而我國前期研究報道，具有不良生育史女性的前突變基因攜帶率為1/72～1/369[14-15]，表明在具有不良生育史的女性中，可能具有相對較高的攜帶前突變等位基因風險，在此類人群中行FMR1基因篩查，有助于生育指導。本研究發(fā)現(xiàn)FMR1基因CGG重復序列變異范圍呈“雙峰分布”現(xiàn)象，主峰CGG重復次數(shù)為29～30，“次峰”CGG重復次數(shù)為36，與前期國內(nèi)報道結(jié)果基本一致[16]，也與亞洲人群CGG重復數(shù)分布情況基本相似[17]，但與非洲人和白種人相比，亞洲人群FMR1等位基因CGG重復次數(shù)<26的比例顯著偏低，且亞洲人群比白種人具有更高比例(26～32次)CGG重復數(shù)的FMR1等位基因攜帶率，表明FMR1基因CGG重復數(shù)的分布存在地區(qū)、種族差異[18]。

BARTHOLOMAY等[19]匯總了前期研究結(jié)果，指出男性FXS患病率為1︰2500～1︰7000，女性FXS患病率為1︰2500～1︰11 000。但不同地區(qū)、不同種族FXS發(fā)病率存在差異，此外因女性前突變等位基因攜帶者有生育FXS后代的風險，故FMR1前突變基因攜帶者的篩查尤其重要。近年我國一些地區(qū)已開展FMR1基因相關(guān)研究，結(jié)果顯示我國女性前突變等位基因攜帶率為1/410～1/772[20-21]。本研究結(jié)果顯示，深圳市100名育齡女性FMR1基因篩查未發(fā)現(xiàn)前突變或全突變基因攜帶者，低于我國其他地區(qū)女性前突變基因攜帶率。對比國外研究，我國女性前突變基因攜帶率高于日本和韓國，但差異無統(tǒng)計學意義[22-23]，而以色列女性前突變基因攜帶率高達1/157，顯著高于東亞國家[24]，造成此差異的原因可能是以色列主要人口為具有較高前突變基因攜帶率的猶太民族[25]。我國與加拿大、美國亞裔女性的前突變基因攜帶率相近，但低于美國白種女性[25-26]，表明不同地區(qū)、種族中女性FMR1前突變基因攜帶率存在一定差異，但同一種族在不同地區(qū)的攜帶率無差異。

綜上，不同地區(qū)、種族女性FMR1前突變基因攜帶率存在一定差異，但同一種族在不同地區(qū)攜帶率無差異。本研究為進一步大規(guī)模全國性研究及亞洲不同地區(qū)篩查研究提供了理論依據(jù)，有助于育齡女性的篩查及高危人群的生育指導。