劉 帆，邸亞麗，馬 威，李 霞，楊立明，亢小麗，郭 月，紀(jì) 征

急性心肌梗死(AMI)指急性發(fā)作的冠狀動(dòng)脈缺血缺氧導(dǎo)致心肌壞死，臨床表現(xiàn)以胸骨后或心前區(qū)劇烈的壓榨性疼痛為主，服用硝酸甘油無法緩解，嚴(yán)重者可發(fā)展為心力衰竭，危及生命[1]。我國AMI發(fā)病率逐年上升，1987—2014年AMI相關(guān)死亡人數(shù)增加了5.6倍[2]。再灌注治療能及時(shí)挽救受損心肌，是AMI首選治療方式[3]，但治療時(shí)間窗極大限制了其臨床應(yīng)用。既往西藥在逆轉(zhuǎn)心肌損傷方面的效果不理想，因此亟須尋找治療AMI的新藥。中醫(yī)藥用于AMI治療歷史悠久，參芍口服液主要成分包括丹參、黃芪、當(dāng)歸、赤芍、川芎等，具有活血化瘀、調(diào)氣養(yǎng)血等功效，臨床已用于治療冠心病、心絞痛。薛忠文等[4]發(fā)現(xiàn)參芍口服液治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化效果顯著；賈春新等[5]發(fā)現(xiàn)參芍口服液可抑制糖尿病大鼠肝臟氧化應(yīng)激，對肝臟具有保護(hù)作用，但其是否對AMI造成的心肌損傷具有積極作用，尚無確切證據(jù)。Wnt/β-catenin信號通路是一種多元復(fù)雜的級聯(lián)放大信號通路，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多個(gè)病理生理過程。本研究通過制備AMI大鼠模型，從分子生物學(xué)角度，基于Wnt/β-catenin信號通路研究參芍口服液對AMI的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 65只雄性SPF級SD大鼠，8周齡，體質(zhì)量(250.3±25.1)g，購于解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號：SCXK-(軍)2009-003。

1.2藥物與試劑 參芍口服液(唐山工人醫(yī)院制藥室，批準(zhǔn)文號Z20050957)，貝那普利片(成都地奧制藥集團(tuán)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20053390)。白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，Wnt10b、β-catenin兔抗鼠多克隆一抗工作液(美國Abcam公司)，DAB顯色液(福州萊博生物技術(shù)有限公司)，SP免疫組織化學(xué)染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物模型制備及藥物干預(yù)：隨機(jī)選取10只大鼠作為假手術(shù)組，其余建立AMI模型。將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組及低、中、高劑量參芍口服液組和陽性對照組。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按文獻(xiàn)[6]方法復(fù)制AMI大鼠模型，術(shù)前12 h禁食，10%水合氯醛麻醉后，固定于手術(shù)臺上，四肢插入心電圖電極，連接Powerlab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)。采用小動(dòng)物呼吸機(jī)以10 ml潮氣量行人工通氣，95/min，常規(guī)備皮、消毒后于左側(cè)第三肋間開胸暴露心臟，在冠狀動(dòng)脈左前降支距左心耳起始處2～3 mm處結(jié)扎，當(dāng)結(jié)扎部位心肌組織由鮮紅色變成暗紅色甚至蒼白，心電圖示ST段弓背向上性抬高，視為造模成功，后逐層縫合傷口。假手術(shù)組開胸后不予結(jié)扎。手術(shù)均在無菌條件下進(jìn)行。術(shù)后大鼠死亡5只，造模成功大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。術(shù)后1 d開始藥物干預(yù)，低、中、高劑量參芍口服液組分別給予3.2、6.4、12.8 ml/kg參芍口服液灌胃，陽性對照組予貝那普利10 mg/(kg·d)灌胃[7]，假手術(shù)組和模型組大鼠予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，持續(xù)4周。末次治療1 h后行超聲心動(dòng)圖評估左心室功能；取腹主動(dòng)脈血離心取血清用于生化指標(biāo)和ELISA試劑盒檢測；處死后取梗死心肌組織，一部分固定于4%多聚甲醛中，其余部分保存于-80 ℃冰箱。

1.3.2心功能評估：末次治療1 h后，所有大鼠予10%水合氯醛麻醉后固定，行超聲心動(dòng)圖測量左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心室短軸縮短率(LVFS)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、左心室舒張末期容積(LVEDV)、左心室收縮末期容積(LVESV)。采用全自動(dòng)生化儀檢測大鼠血清肌酸激酶(CK)、心肌型肌酸激酶同工酶(CK-MB)、腦鈉肽(BNP)水平。

1.3.3心肌組織HE染色：大鼠梗死心肌組織于4%多聚甲醛中固定72 h后，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋制成蠟塊后切片，經(jīng)梯度乙醇脫蠟至水后，行蘇木素染色、浸入鹽酸乙醇，再用自來水沖洗載玻片，至核變?yōu)樗{(lán)色，再依次放入95%乙醇2 min、伊紅1 min染色，經(jīng)梯度乙醇脫水透明后封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理學(xué)變化。

1.3.4ELISA檢測炎性因子：采用ELISA試劑盒檢測大鼠外周血炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求操作。

1.3.5免疫組織化學(xué)染色檢測Wnt10b、β-catenin蛋白表達(dá)：石蠟切片常規(guī)脫蠟后，1%TritonX-100 4 ℃過夜，3%甲醇+30%過氧化氫室溫孵育15 min，PBS液洗滌3次，應(yīng)用沸騰的枸櫞酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS液洗滌3次，用5%牛血清白蛋白37 ℃封閉30 min，孵育一抗4 ℃過夜，PBS液洗滌3次，37 ℃孵育二抗30 min，PBS液洗滌3次，DAB顯色，清洗后復(fù)染、封片。光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果，染色呈棕黃色即為陽性表達(dá)。200倍光學(xué)顯微鏡下取6個(gè)高倍視野照相，利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析，計(jì)算指定區(qū)域面積及該區(qū)域內(nèi)部特定染色部分的累積光密度，從而得出該區(qū)域內(nèi)特定染色物的平均光密度。

1.3.6Western blot檢測Wnt10b、β-catenin蛋白表達(dá)：將大鼠心肌組織加入裂解液行冰上勻漿，離心取上清，BCA法行蛋白定量，100 ℃水浴變性。提前配置分離膠和濃縮膠，凝固后插入齒梳，加入足夠的電泳緩沖液后上樣電泳，300 mA轉(zhuǎn)膜。條帶在5%脫脂牛奶中搖床封閉1 h，4 ℃孵育一抗過夜，TBST洗3次，室溫孵育二抗2 h，TBST洗3次，ECL顯色，在凝膠成像儀中拍攝條帶圖片并分析灰度值。

正常杵狀棘突在腰椎屈伸時(shí)末端會(huì)有明顯前后位移，被認(rèn)為是疼痛根源［4］，但該患者腰部屈伸時(shí)無杵狀棘突明顯位移。右L4/L5關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)區(qū)疼痛及肌肉緊張的原因行腰椎CT平掃及三維重建進(jìn)一步檢查。CT示L5右側(cè)峽部裂（圖2a），L5右半椎板、下關(guān)節(jié)突及杵狀棘突與L5其他骨結(jié)構(gòu)分離，形成浮動(dòng)半椎板，恰如浮動(dòng)膝［5］或浮動(dòng)肘［6］，可解釋杵狀棘突為何不隨腰椎屈伸發(fā)生同步位移；同時(shí)可見L5/S1椎間盤向右膨出并鈣化，無神經(jīng)根受壓，右骶棘肌粗大（圖2d，e）。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠心功能指標(biāo)比較 與空白對照組比較，模型組LVEF、LVFS降低，LVIDd、LVIDs、LVEDV、LVESV及血清CK、CK-MB、BNP均升高(P<0.05)；與模型組比較，中、高劑量參芍口服液組和陽性對照組LVEF、LVFS升高，LVIDd、LVIDs、LVEDV、LVESV及血清CK、CK-MB、BNP均降低(P<0.05)。見表1。

表1 6組大鼠心功能指標(biāo)比較

2.2各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化 空白對照組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)正常，胞膜、胞核清晰完整，肌絲無斷裂。模型組大鼠心肌細(xì)胞可見大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，心肌細(xì)胞原有形態(tài)完全消失，大多數(shù)呈壞死、變性，可見少量肌纖維母細(xì)胞。中、高劑量參芍口服液組和陽性對照組大鼠心肌組織損傷有不同程度改善，可見新生小血管，肌纖維母細(xì)胞逐漸增多，聯(lián)合呈網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞減少，壞死細(xì)胞逐漸消失，膠原纖維增多形成瘢痕組織。見圖1。

圖1 6組大鼠心肌組織病理學(xué)變化A.空白對照組，B.模型組，C.低劑量組，D.中劑量組，E.高劑量組，F(xiàn).陽性對照組；低、中、高劑量組分別予參芍口服液3.2、6.4、12.8 ml/kg

2.3各組大鼠炎性因子水平比較 與空白對照組比較，模型組血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)；與模型組比較，中、高劑量參芍口服液組和陽性對照組血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)。見表2。

表2 6組大鼠炎性因子水平比較

2.4各組大鼠心肌組織免疫組織化學(xué)染色及Western blot結(jié)果比較 免疫組織化學(xué)染色和Western blot結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組心肌組織Wnt10b、β-catenin表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型組大鼠比較，中、高劑量參芍口服液組和陽性對照組大鼠心肌組織Wnt10b、β-catenin表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織免疫組織化學(xué)染色及Western blot結(jié)果比較A、B.分別為免疫組織化學(xué)染色檢測Wnt10b、β-catenin表達(dá),C.Western blot檢測Wnt10b、β-catenin蛋白表達(dá);1.空白對照組，2.模型組，3.低劑量組，4.中劑量組，5.高劑量組，6.陽性對照組；低、中、高劑量組分別予參芍口服液3.2、6.4、12.8 ml/kg；與空白對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

3 討論

參芍口服液根據(jù)中醫(yī)辨證理論配伍，具有活血化瘀、調(diào)氣養(yǎng)血等多重功效，對擴(kuò)張外周血管、改善微循環(huán)具有一定效果，亦能抑制心肌纖維化，具有價(jià)格低廉、療效顯著、安全性高等優(yōu)點(diǎn)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，參芍口服液具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、調(diào)脂、抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等多種心肌保護(hù)機(jī)制[12-14]。血管生成是心肌再生的關(guān)鍵，瘢痕組織的形成與血管生成密切相關(guān)，構(gòu)成心肌再生的天然屏障，促進(jìn)血管生成，激活多種可降解膠原的細(xì)胞因子[15]。肌纖維母細(xì)胞在梗死區(qū)內(nèi)規(guī)則排列，與心內(nèi)外膜相連接，具有一定的收縮能力，能防止壞死的心肌膨脹和擴(kuò)張，維持心功能。本研究發(fā)現(xiàn)給予參芍口服液干預(yù)后，鏡下觀察到大鼠心肌組織出現(xiàn)新生小血管及肌纖維母細(xì)胞，膠原纖維大量沉積，瘢痕組織形成，大鼠心室結(jié)構(gòu)和心功能也顯著改善，與HE等[16]研究結(jié)果類似，表明參芍口服液可促進(jìn)AMI大鼠心肌組織再生，改善心室結(jié)構(gòu)和心功能。

AMI后的炎癥反應(yīng)影響梗死范圍和心室重構(gòu)，被認(rèn)為是改善AMI患者預(yù)后的潛在靶點(diǎn)[17]。AMI后的炎癥反應(yīng)可分為3個(gè)階段，第一階段是釋放損傷相關(guān)分子模式蛋白，刺激天然免疫途徑；第二階段是在梗死區(qū)募集中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞；第三階段是炎癥反應(yīng)消退[18]。AMI后過度持續(xù)的炎癥反應(yīng)可能會(huì)加劇心室重構(gòu)。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠外周血IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高，而給予參芍口服液干預(yù)后上述炎性因子水平降低，與WEI等[19]研究結(jié)果一致，表明參芍口服液可降低AMI大鼠外周血炎性因子水平，減輕炎癥反應(yīng)。

我們基于Wnt信號通路探究參芍口服液保護(hù)心肌的作用機(jī)制。Wnt信號通路參與心血管的胚胎細(xì)胞分裂、增殖、分化，在特定條件下能促進(jìn)或抑制內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞的凋亡和死亡[20]。Wnt信號在健康成人器官中大多是沉默的，但在病理?xiàng)l件下通常觀察到Wnt信號被重新激活。在沉默狀態(tài)下，細(xì)胞質(zhì)β-catenin水平較低，防止蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核激活基因轉(zhuǎn)錄，而在激活狀態(tài)下，Wnt結(jié)合到卷曲蛋白，激活信號通路，使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累，并能與相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子作用，參與肌纖維母細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等增殖、遷移至梗死區(qū)的過程[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，AMI大鼠心肌組織Wnt10b、β-catenin表達(dá)上調(diào)，而經(jīng)參芍口服液干預(yù)后，大鼠Wnt10b、β-catenin表達(dá)下調(diào)，與ZOU等[22]研究結(jié)果類似，表明參芍口服液可通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)心肌組織再生。

綜上，參芍口服液可改善AMI大鼠心室重構(gòu)和心功能，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)心肌組織修復(fù)與再生，對心肌具有保護(hù)作用，這可能與調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。