于均帥，代娜，聶啟玉，3，蔡珉敏，張吉斌，范明霞

1.農業(yè)微生物學國家重點實驗室/華中農業(yè)大學生命科學技術學院，武漢 430070；2.武漢大學人民醫(yī)院，武漢 430060；3.農業(yè)農村部微生物產品質量監(jiān)督檢驗測試中心，武漢 430070

亮斑扁角水虻（Hermertia illucensL.），是一種雙翅目水虻科扁角水虻屬、幼蟲營腐食性的完全變態(tài)昆蟲[1]。由于其免疫力強、取食范圍廣、生長迅速、繁殖能力強，已成為食源性昆蟲研究的熱點。利用亮斑扁角水虻轉化禽畜糞便、餐廚垃圾等作為動物飼料不僅有極高的環(huán)境保護價值而且能產生較為可觀的經濟效益[2]。

目前針對亮斑扁角水虻蟲粉已有諸多研究。Singh等[3]進行了亮斑扁角水虻處理多種類型餐廚垃圾的研究，發(fā)現(xiàn)亮斑扁角水虻對混合餐廚垃圾的處理率高達72%，生物量轉化率也達到25%。李俊波等[4]采用豬糞和雞糞喂養(yǎng)亮斑扁角水虻，發(fā)現(xiàn)其蛋白質含量達到52%，粗脂肪含量達到15%。Xiao等[5]研究發(fā)現(xiàn)以亮斑扁角水虻蟲粉替代25%魚粉的飼料所喂養(yǎng)的黃顙魚的生長性能（增重率提高29.1%）和免疫指標（血清溶菌酶活性提高31.9%）最高。雖然亮斑扁角水虻蟲粉具有部分替代魚粉的潛力，但完全以亮斑扁角水虻替代傳統(tǒng)飼料喂養(yǎng)動物的研究鮮有報道，有關亮斑扁角水虻蟲粉的安全性研究較為薄弱。王國霞等[6]利用餐廚垃圾飼養(yǎng)獲得脫脂亮斑扁角水虻替代魚粉飼養(yǎng)黃顙魚，結果發(fā)現(xiàn)，替代60%（蟲粉添加比例17.85%）及以下的魚粉飼養(yǎng)對其幼魚無顯著不良影響；未脫脂亮斑扁角水虻替代25%（蟲粉添加比例16.9%）及以下的魚粉飼養(yǎng)黃顙魚幼魚對其也無顯著不良影響。Dumas等[7]使用脫脂亮斑扁角水虻蟲粉完全替代虹鱒飼料中的魚粉（蟲粉添加比例20%），結果顯示除虹鱒體內脂肪含量顯著增加外，灰分和蛋白質等含量與對照組并無顯著差異。黃文慶等[8]使用亮斑扁角水虻替代40%以下魚粉飼養(yǎng)草魚對其終末體質量、特定生長率、飼料系數(shù)和增重率沒有顯著影響，替代20%魚粉飼養(yǎng)草魚可提高草魚血清T-AOC和T-SOD活性，而替代不同比例（20%、40%、60%）的魚粉對于草魚胃腸淀粉酶、肝胰臟蛋白酶和脂肪酶等消化酶活性均無顯著影響。

本研究以亮斑扁角水虻轉化不同物料得到的蟲粉作為飼料喂養(yǎng)實驗動物（斑馬魚和大鼠），探究其對實驗動物生長發(fā)育指標的影響并對其安全性進行評估，為水虻轉化不同有機廢棄物獲得的蟲粉作為水產和畜禽飼料奠定安全基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

80只SPF級SD大鼠，雌雄各半，4周齡，雌性體質量約90 g，雄性體質量約100 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司（SCXK（湘）2019-0004）。飼養(yǎng)于武漢大學人民醫(yī)院動物實驗中心（SYXK（鄂）2015-0027）。飼養(yǎng)期間各組大鼠自由飲食，飼喂普通維持飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司（SCXK（京）2019-0003）提供；飼喂特殊飼料由課題組提供原料，北京科澳協(xié)力飼料有限公司加工制作而成。飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半循環(huán)照明，濕度恒定，溫度控制在22～25℃。所有操作均符合實驗動物倫理委員會要求（審批號：WDRM動（福）第20190909號）。

20條SPF級健康成年野生型AB系斑馬魚，雌雄各半，體長約5 cm，購于國家斑馬魚資源中心（武漢），飼養(yǎng)于華中農業(yè)大學基因樓（SCXK（鄂）2020-0019）。成魚飼養(yǎng)于循環(huán)水系統(tǒng)：水溫為（28±0.5）℃，pH值為7.6±0.1，每天連續(xù)光照14 h，用孵化的豐年蟲投喂3次。斑馬魚卵自然受精后在28℃恒溫過濾水中孵化，孵化后第5天取約350尾健康有活力的幼魚轉移至恒溫培養(yǎng)箱28℃恒溫飼養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1）動物分組及試驗設計。斑馬魚幼魚隨機分為4組：①對照組1（CK1）：投喂綠藻粉（粗脂肪含量約8%，購自武漢古木生物科技有限公司）；②雞糞飼養(yǎng)組（雞糞組，A組）：投喂雞糞（取自湖北省鄂州市某養(yǎng)雞場，粉碎后控制含水量為65%～70%）飼養(yǎng)的亮斑扁角水虻蟲粉；③餐廚垃圾飼養(yǎng)組（餐余組，B組）：投喂餐廚垃圾（取自湖北省武漢市，粉碎后控制含水量為65%～70%）飼養(yǎng)的亮斑扁角水虻蟲粉；④農副產品飼料飼養(yǎng)組（飼料組，C組）：投喂農副產品飼料（麩皮∶次粉=1∶2，含水量65%～70%）飼養(yǎng)的亮斑扁角水虻蟲粉。每組80尾，分為4缸，飼養(yǎng)密度為40條/L，每日連續(xù)光照14 h，恒溫28℃，自由飲食，24 h換水1次，連續(xù)喂養(yǎng)15 d[9]。

大鼠隨機分為4組：①對照組2（CK2）：投喂常規(guī)鼠飼料；②雞糞飼養(yǎng)組（雞糞組，A組）：投喂雞糞飼養(yǎng)的亮斑扁角水虻蟲粉；③餐廚垃圾飼養(yǎng)組（餐余組，B組）：投喂餐廚垃圾飼養(yǎng)的亮斑扁角水虻蟲粉；④農副產品飼料飼養(yǎng)組（飼料組，C組）：投喂農副產品飼料飼養(yǎng)的亮斑扁角水虻蟲粉。每組20只，雌、雄各10只，飼養(yǎng)密度為5只/籠，自由飲食，連續(xù)喂養(yǎng)27 d，第28天禁食不禁水。雞糞、餐廚垃圾和農副產品飼料同斑馬魚試驗。

2）形態(tài)指標測試及取材。喂養(yǎng)15 d后各組隨機取20尾斑馬魚用游標卡尺測量體長；每組隨機取10條斑馬魚，使用100 mg/L的MS-222溶液麻醉[10]后切斷頭后脊椎處死，解剖取肝臟置于-80℃保存，用于超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性測定；每組另取10尾斑馬魚麻醉后解剖取肝臟、腦和腸道投入4%多聚甲醛溶液中固定[11]，用于切片制作進行組織病理學檢查。

記錄各組大鼠的攝食量和體質量。喂養(yǎng)27 d后，采用代謝籠法收集24 h內大鼠的尿液，用于尿液檢查；喂養(yǎng)28 d后麻醉大鼠，大鼠失去知覺后腹主動脈采血[12]，用于血液學和血生化檢查。

3）斑馬魚抗氧化酶活性測定。使用超氧化物歧化酶測定試劑盒采用WST-1法測定斑馬魚肝臟組織超氧化物歧化酶活性[13]。使用過氧化氫酶測定試劑盒采用可見光法測定斑馬魚肝臟組織過氧化氫酶活性[14]。

4）大鼠尿液指標。取大鼠尿液進行尿常規(guī)檢查檢查項目包括相對密度、pH。

5）大鼠血液學檢查。取大鼠血液進行血常規(guī)檢查，檢查項目包括嗜中性粒細胞（NEUT）、淋巴細胞（LYMPH）、單核細胞（MONO）、白細胞（WBC）、紅細胞（RBC）、血紅蛋白濃度（HGB）、紅細胞壓積（HTC）和血小板（PLT）。大鼠血生化檢查：取大鼠血液進行血生化檢查，檢查項目包括谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、谷氨酰轉肽酶（GGT）、堿性磷酸酶（ALP）、總蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、尿素（Urea）、肌酐（Cre）、血糖（Glu）、總膽固醇（TCh）、甘油三酯（TG）、氯（Cl）、鉀（K）和鈉（Na）[15]。

6）大鼠病變及組織病理學檢查[16]。根據檢查結果，按照病變由輕到重的程度進行打分，分別標記為1、2、3、4 分，無明顯病變記為 0分，極輕度病變記為0.5分[17]。

采血后處死大鼠，迅速解剖取胸腺、心臟、肝臟、脾臟、腎上腺、腎臟和睪丸（雄鼠）觀察有無肉眼可見病變，稱取濕質量并計算臟/體比值[18]。

1.3 數(shù)據處理

試驗結果用“平均值±標準差”表示。所有數(shù)據均用Excel和Origin軟件處理，多組間比較使用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 不同水虻蟲粉對斑馬魚體長的影響

試驗B組斑馬魚體長值最高，A組最低。CK1與A組間、B組與C組間均無顯著性差異；B組和C組較CK1和A組均顯著升高（P＜0.05）（圖1）。結果表明3種蟲粉均不會對斑馬魚體長增長造成明顯負面影響，并且餐余組和飼料組蟲粉可顯著促進斑馬魚體長增長。這可能是由于亮斑扁角水虻蟲粉所含氨基酸和微量元素種類較之小球藻干粉更貼合斑馬魚生長所需。經檢測，3組亮斑扁角水虻蟲粉的粗脂肪含量均超過30%，由于斑馬魚對脂肪的高吸收率和利用率，亮斑扁角水虻蟲粉相較于綠藻粉（粗脂肪含量約8%）更能促進斑馬魚體長增長。

圖1 不同試驗組的斑馬魚體長Fig.1 Body length of zebrafish of different test groups

2.2 不同水虻蟲粉對斑馬魚抗氧化酶活性的影響

B組斑馬魚肝臟超氧化物歧化酶（SOD）活性最高，A組最低。CK1和A組、B組和C組間沒有顯著性差異；B組和C組較CK1和A組超氧化物歧化酶活性極顯著升高（P＜0.01）（圖2）。結果表明餐余組和飼料組蟲粉對斑馬魚超氧化物歧化酶活性有明顯增強作用，可作為斑馬魚飼料喂養(yǎng)斑馬魚以提高斑馬魚的抗氧化能力，雞糞組亮斑扁角水虻蟲粉未能顯著提高斑馬魚肝臟SOD活性還可能是由于其中Pb2+含量較高，Pb2+與SOD的巰基結合使SOD無法結合超氧陰離子自由基（·O2-），從而導致SOD活性下降。

B組斑馬魚肝臟過氧化氫酶（CAT）活性最高，A組最低。CK1、B組和C組間兩兩比較，各組間無顯著性差異；相較CK1、B組和C組，A組的CAT活性極顯著降低（P＜0.01）（圖2）。結果表明，雞糞組蟲粉會顯著降低斑馬魚的CAT活性，不適合長期作為斑馬魚飼料，餐余組和飼料組蟲粉對斑馬魚過氧化氫酶活性幾乎沒有影響，可作為飼料喂養(yǎng)斑馬魚。

圖2 不同試驗組的斑馬魚的抗氧化酶活性Fig.2 Antioxidant enzyme activity of zebrafish of different test groups

2.3 斑馬魚的組織病理學檢查

組織病理檢查結果顯示，各組斑馬魚均出現(xiàn)少量極輕度病變和個別輕度變異，主要表現(xiàn)為肝細胞脂肪輕度變性、少數(shù)腸黏膜細胞增生和大腦組織白質輕微水腫（圖3）。CK、A、B、C各組斑馬魚內臟總病變指數(shù)分別為 0.395±0.122、0.407±0.137、0.435±0.125和0.435±0.125，病變程度之間并無顯著性差異。結果表明，試驗期間各組蟲粉未對斑馬魚造成明顯組織病理損傷。

圖3 斑馬魚肝臟、腸道和大腦的組織病理圖Fig.3 Histopathological detection of liver，intesinal tract and brain of zebrafish

2.4 不同水虻蟲粉對大鼠生長和尿液指標的影響

由表1可見，雌性中B組大鼠體質量增加值最高，C組最低，各組之間無顯著性差異；雄性中A組大鼠體質量增加值最高，CK2最低，各組間均無顯著性差異。結果表明，各組蟲粉與常規(guī)商業(yè)飼料效果相同，對大鼠體質量增長均無顯著影響。雌性和雄性大鼠各組的相對尿液密度無顯著差異；雌性和雄性大鼠各組的尿液pH均無顯著差異。各組水虻蟲粉對大鼠尿液相對密度和pH的影響與農副產品飼料組相同，可替代常規(guī)商業(yè)飼料喂養(yǎng)大鼠。

表1 大鼠的體質量和尿液指標Table 1 Body weight and urine index of rats

2.5 不同水虻蟲粉對大鼠血常規(guī)指標的影響

表2為不同水虻蟲粉喂養(yǎng)大鼠后的血常規(guī)檢查結果。血液中的嗜中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞反映大鼠體內的炎癥和感染情況。對于雌性大鼠的各組淋巴細胞數(shù)，B組與C組有顯著差異（P＜0.05）；對于雄性大鼠的各組淋巴細胞數(shù)，A組較CK2顯著降低（P＜0.05）；紅細胞含量和血紅蛋白含量反映大鼠血液運送氧氣和二氧化碳的能力；血小板含量反映大鼠遭遇損傷時的凝血能力，過高易導致血栓。對于雌性大鼠的各組紅細胞，C組與A組有顯著差異（P＜0.05），其他指標各組之間差異不顯著；對于雄性大鼠的各組紅細胞，A組與C組差異極顯著（P＜0.01），其他指標各組間差異不顯著（表3）。結果表明，各組水虻蟲粉喂養(yǎng)的大鼠血常規(guī)各項指標較對照組僅個別項目存在顯著差異，其他項目與對照組之間均無顯著差異。各組水虻蟲粉均滿足動物飼料用的營養(yǎng)需求。

表2 大鼠的血常規(guī)指標情況Table 2 Blood routine indexes of rats

2.6 不同水虻蟲粉對大鼠血生化指標的影響

對于雌性大鼠，各組谷草轉氨酶（AST）活性對比發(fā)現(xiàn)，B組較CK2顯著升高（P＜0.05），A組較CK2極顯著升高（P＜0.01）；各組堿性磷酸酶（ALP）活性對比發(fā)現(xiàn)，B組較CK2極顯著升高（P＜0.01），A組較CK2顯著升高（P＜0.05）；各組肌酐（Cre）含量相比較，B組較CK2極顯著降低（P＜0.01），A組較CK2顯著升高（P＜0.05）。對于雄性大鼠，各組谷草轉氨酶（AST）活性對比發(fā)現(xiàn)，A組、B組較CK2極顯著升高（P＜0.01）；各組堿性磷酸酶（ALP）活性對比發(fā)現(xiàn)，C組較CK2顯著升高（P＜0.05）（表3）。谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、谷氨酰轉肽酶等的檢查結果表明各組水虻蟲粉喂養(yǎng)的大鼠的肝臟功能較對照組未受到負面影響，驗證了水虻蟲粉的安全性；血糖、總蛋白、甘油三酯等的檢查結果顯示各組水虻蟲粉具有與常規(guī)商業(yè)飼料接近的營養(yǎng)價值，可滿足大鼠的營養(yǎng)需求；尿素和肌酐的檢查結果顯示試驗組大鼠對蛋白質的代謝能力與對照組不存在明顯差異；血液中氯、鈉和鉀含量的測定結果表明各組大鼠的電解質代謝不存在明顯問題。

表3 大鼠的血生化指標結果Table 3 Blood biochemical indices of rats

2.7 大鼠的大體病理學檢查

對大鼠進行大體病理學檢查發(fā)現(xiàn)，所有臟器均未出現(xiàn)肉眼可見病變，大鼠臟/體比值結果見表4。對于雌性大鼠，B組的心/體比值相較CK2和C組顯著增加（P＜0.05），其他各指標組間差異不顯著；對于雄性大鼠，各項指標組間差異不顯著。各組水虻蟲粉均未對大鼠各臟器造成顯著負面影響，說明食用水虻蟲粉的大鼠未發(fā)生明顯的內臟充血和水腫，也未發(fā)生萎縮等退行性改變。這在一定程度上證明3種水虻蟲粉具備飼養(yǎng)大鼠的安全性條件。

表4 大鼠的臟/體比值Table 4 Dirty-body ratio of rats %

3 討論

3.1 水虻蟲粉對斑馬魚和大鼠生理指標的影響

各組水虻蟲粉對斑馬魚和大鼠的生理指標均未產生顯著負面影響，其他研究中也有類似結果。例如，St-Hilaire等[19]采用亮斑扁角水虻蟲粉以不同比例替代虹鱒飼料中的魚粉成分，對虹鱒的各項生理指標進行檢測，結果表明亮斑扁角水虻蟲粉對虹鱒的飼料轉化率和生長發(fā)育均無顯著影響。本研究中，餐余組和飼料組水虻蟲粉與對照組相比，顯著促進了斑馬魚的生長，而雞糞組水虻蟲粉喂養(yǎng)的斑馬魚體長值低于對照組，但差異不顯著，這主要是由于餐余組和飼料組水虻蟲粉蛋白質和脂肪等營養(yǎng)成分含量高于對照組的綠藻粉，雞糞組水虻蟲粉為何沒有顯著促進斑馬魚生長還有待進一步研究。各組水虻蟲粉喂養(yǎng)的大鼠的體質量間無顯著差異，這主要是由于各組水虻蟲粉營養(yǎng)物質含量與大鼠常規(guī)飼料間并無顯著差異。除雞糞組雄性大鼠的淋巴細胞數(shù)較對照組顯著降低，這可能導致大鼠免疫力下降，其他各試驗組的各項指標之間雖存在個別差異，但與對照組相比并無顯著差異。各組大鼠尿液密度和pH與對照組間均無顯著性差異。這主要是由于各組水虻蟲粉的理化性質與大鼠常規(guī)飼料間并無顯著差異。以上結果表明，除雞糞組外，其他試驗組水虻蟲粉對斑馬魚和大鼠生理指標沒有顯著影響。

3.2 水虻蟲粉對斑馬魚和大鼠生化指標的影響

餐余組和飼料組斑馬魚的肝臟超氧化物歧化酶活性較對照組極顯著升高，雞糞組低于對照組斑馬魚肝臟超氧化物歧化酶活性，但沒有顯著差異。餐余組和飼料組斑馬魚肝臟過氧化氫酶活性較對照組沒有顯著差異，雞糞組斑馬魚肝臟過氧化氫酶活性較對照組顯著降低，這可能導致斑馬魚機體抗氧化能力下降，內臟易遭受代謝過程中產生的過氧化氫毒害。大鼠血生化檢查結果顯示，雖然各組各個項目間偶有顯著差異，但幾乎所有檢查項目的指標均在正常范圍內[20]。以上結果表明，除雞糞組外，其他試驗組水虻蟲粉對斑馬魚生化指標沒有顯著影響；各組水虻蟲粉對大鼠均沒有致病影響。

3.3 水虻蟲粉對斑馬魚和大鼠病理的影響

亮斑扁角水虻轉化不同物料獲得的蟲粉對斑馬魚和大鼠內臟組織病理均無顯著影響。這初步證明了利用亮斑扁角水虻轉化有機廢棄物所得的蟲粉生產動物飼料的安全性。

本研究表明，短期內使用餐廚垃圾和谷物飼料喂養(yǎng)的水虻蟲粉作為飼料喂養(yǎng)斑馬魚和大鼠效果均優(yōu)于常規(guī)的商業(yè)飼料，生理、生化以及病理檢測的各項指標檢測結果表明餐余組和飼料組水虻蟲粉作為斑馬魚和大鼠飼料是較為安全的。通過雞糞組水虻蟲粉喂養(yǎng)條件下斑馬魚超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性以及大鼠淋巴細胞數(shù)的變化判斷，雞糞組水虻蟲粉對斑馬魚和大鼠的生長和代謝有明顯的負面影響，因此不適合作為斑馬魚和大鼠的飼料，具體原因有待進一步探究。本研究觀測的動物飼養(yǎng)周期較短且實驗動物種類少，因此，能否使用水虻蟲粉完全替代常規(guī)商業(yè)飼料長期作為動物飼料還需進一步探究。