單亞靜，吳坤坦，高健瑋，楊旭晨，鄭嶸

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070

高溫處理可以減少動物尸體中存在的病原菌[1]，但將高溫處理后的動物尸體直接施用于農(nóng)田，將造成“二次發(fā)酵”，導(dǎo)致燒苗現(xiàn)象[2]，因此需對高溫處理后的尸體進行發(fā)酵腐熟的堆肥處理。但堆肥過程中的高溫、高pH促使NH3逸出、厭氧條件下反硝化作用引起的N2O和N2彌散以及水溶性含氮成分的滲濾均造成了氮素損失[3]。在豬尸體堆肥中加入氨轉(zhuǎn)化細菌、亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化菌和固氮菌可以加速氮的積累，減少氮素的損失[4]。而具有纖維素降解性和固氮性的菌劑可以促進木質(zhì)纖維素的降解，提高堆肥效果[5]。如孫元烽等[6]篩選到的細菌能有效強化菌劑的纖維素降解能力，并一定程度上提高堆肥中的總養(yǎng)分；武肖莎等[7]篩選得到枯草芽孢桿菌應(yīng)用于牛糞-秸稈的堆肥中，發(fā)現(xiàn)菌劑組能有效提高堆肥效率。目前關(guān)于纖維素分解菌的研究大多是應(yīng)用在畜禽糞便、秸稈和生活有機廢棄物上，而用于畜禽尸體的研究相對較少[8]。課題組前期從豬尸體和秸稈堆肥樣品中篩選到1株能在80℃下生存的纖維素降解菌株，鑒定為熱葡糖苷酶地芽孢桿菌（Parageobacillus thermoglucosidasiusBGSC 95A1）[9]。該菌降解纖維素的能力很強，但其應(yīng)用于堆肥中對堆肥效率的影響尚不清楚。檢測堆肥中氮元素相關(guān)的物質(zhì)（銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和總氮）和氮素轉(zhuǎn)化功能基因拷貝數(shù)[10-11]的變化能反映不同堆肥時期氮素轉(zhuǎn)化作用的變化。因此，本試驗將熱葡糖苷酶地芽孢桿菌加入到高溫處理后的動物尸體中與秸稈混合進行堆肥，檢測氮元素相關(guān)物質(zhì)和氮素轉(zhuǎn)化功能基因拷貝數(shù)的變化，探究菌劑影響動物尸體堆肥氮素損失的途徑，以期為未來在堆肥中添加纖維素降解菌等微生物來促進堆肥過程和減少氮素損失提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

1）菌株的來源。試驗菌株為筆者所在實驗室前期獲得的熱葡糖苷酶地芽孢桿菌（P.thermoglucosi-dasiusBGSC 95A1）[9]。該菌株可在 80 ℃下生存且產(chǎn)酶的最適溫度為65℃，其纖維素酶活性高達94.00 U/mL。根據(jù)菌株生長的最適條件，將P.thermoglucosidasius培養(yǎng)約1周，至分光光度計在600 nm波長下測定菌液吸光度值為1.2左右時，作為最終的高溫纖維素菌劑備用。

2）堆肥處理。將雞和鴨的尸體（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)雞場提供）在焚燒爐內(nèi)進行高溫處理后再開展堆肥試驗。堆肥在規(guī)格為138 L的泡沫箱中進行，堆肥方式為好氧靜態(tài)通風(fēng)堆，均采用60 L/（m3·min）的通風(fēng)處理。將高溫處理后的動物尸體分為2組，分別是不添加菌劑的對照組和菌劑組（根據(jù)每個堆體的總質(zhì)量添加1%高溫纖維素菌劑），每組3個重復(fù)。動物尸體在高溫焚燒爐進行高溫處理（160℃處理12 h）后，將動物尸體與秸稈進行混合，利用秸稈和竹粉調(diào)節(jié)碳氮比為30∶1，初始含水率為60%左右，堆肥時間為28 d。采用五點采樣法采集尸體與秸稈的混合物作為分析樣品，混勻后將樣品分為2份，一份保存于4℃冰箱，用于測定堆肥過程中的理化參數(shù)，包括溫度、pH、含水率、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、總碳和總氮。另一份保存于-80℃冰箱，用于測定樣本中氮素轉(zhuǎn)化功能基因的拷貝數(shù)。

1.2 試驗方法

1）溫度、pH和含水率的測定。記錄環(huán)境溫度并用長柄電子溫度計按照時間間隔，測定堆體中心不同區(qū)域的溫度，取其平均值。堆肥樣品的pH用精密pH計（PHS-3C，上海宇隆儀器有限公司）測定。在烘箱中105℃烘干樣品至恒質(zhì)量，通過前后質(zhì)量的變化計算含水率。

2）銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮含量的測定。用2 mol/L氯化鉀對堆肥樣品進行前處理，過濾后用靛酚藍分光光度法檢測銨態(tài)氮含量。用標準曲線法和紫外分光光度計（721，上海第三分析儀器廠）測定吸光度，計算硝態(tài)氮濃度。用鹽酸萘乙二胺分光光度法測定亞硝態(tài)氮濃度。

3）總氮和總碳含量的測定。將堆肥樣品在烘箱中80℃烘干24 h后，過篩孔徑為0.15 mm的標準篩，用分析天平稱取約4.0～4.5 mg的樣品。采用錫盒將樣品包裹成圓球狀，然后用同位素質(zhì)譜分析儀（Isoprime100，德國元素分析系統(tǒng)公司）進行總碳和總氮含量的測定。

4）DNA的提取與熒光定量PCR檢測。為了減少外源DNA和酸性物質(zhì)所造成的污染，首先對堆肥樣品進行適當?shù)那疤幚?。先加入脫腐緩沖液（100 mmol/L Tris，100 mmol/L Na4P2O7，100 mmol/L Na2EDTA，1.0%PVP，100 mmol/L NaCl，0.05%Triton X-100，pH=10.0），渦旋混勻并12 000 r/min離心，后續(xù)加入氯化鈣溶液（0.5 mol/L）和草酸鈉（0.05 mol/L）繼續(xù)前處理。用改進的蛋白酶KCTAB法粗提取堆肥樣品中的總DNA，然后檢測總DNA的濃度和質(zhì)量?；虻囊镌O(shè)計如表1所示，引物合成在武漢奧科鼎盛生物科技有限公司進行。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火15 s（16S rDNA為53℃退火45 s），72℃延伸20 s（16S rDNA為72℃退火90 s），35個循環(huán)；再72℃延伸10 min。純化回收得到的PCR產(chǎn)物按初始濃度的10-1至10-10共11個濃度并根據(jù)不同濃度所對應(yīng)的Ct值繪制標準曲線，然后計算樣品中相應(yīng)基因的拷貝數(shù)。熒光定量PCR所需的引物參考文獻[12]來設(shè)計（表1），反應(yīng)條件同PCR條件。最后根據(jù)定量數(shù)據(jù)中標準品的數(shù)值繪制標準曲線，并計算實際樣品中的基因拷貝數(shù)。每個基因均做5個技術(shù)重復(fù)。將基因的原始拷貝數(shù)進行對數(shù)轉(zhuǎn)換，利用Canoco 4.5軟件和SPSS 21.0軟件對各個理化參數(shù)與氨單加氧酶基因（ammonia monooxygenase，amoA）、硝酸鹽還原酶基因（nitrate reductase subunit alpha，narG）、亞硝酸鹽還原酶基因（copper-containing nitrite reductase，nirS和nirK）和氧化亞氮還原酶基因（nitrous oxide reductase，nosZ）的拷貝數(shù)分別進行相關(guān)性分析，確定理化參數(shù)與基因數(shù)量之間的線性相關(guān)性。

表1 試驗所用引物序列Table 1 Sequence of different primers used in this experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度、總碳和總氮的變化

堆肥過程中環(huán)境溫度在20℃以下，雖然堆肥環(huán)境溫度較低，但堆體溫度最高值均達到60℃以上。菌劑組在第8～10天達到最高值，均值為62.6℃。對照組在第10天溫度達到最高，均值為49.0℃（圖1A）。由此可以看出，菌劑組溫度上升較快，且溫度較高，持續(xù)時間長，堆肥效果較好。在第10天之后2組的溫度都出現(xiàn)了明顯的下降趨勢，且第11天環(huán)境溫度突然降低到10℃以下，堆肥溫度也迅速下降。由于經(jīng)過高溫處理的動物尸體較大部分蛋白質(zhì)等被高溫變性，容易被微生物分解利用，因此堆肥時間較短，堆肥進程較快。

圖1 堆肥過程中溫度（A）、總氮（B）和總碳（C）的變化Fig.1 Changes in temperature（A），total nitrogen（B）and total carbon（C）during composting

菌劑組的總氮的變化趨勢為“升高→降低→升高→降低”，在第5天達到最高值5.8%。堆肥結(jié)束，總氮含量為4.5%。對照組總氮的變化趨勢為先增高后降低，在第8天總氮含量達到最高值6.3%，最終總氮含量為5.5%（圖1B）。而堆肥過程中總碳含量的變化呈現(xiàn)多次波動，最終對照組和菌劑組的總碳含量分別為47.5%和47.2%（圖1C）。菌劑組堆肥溫度高且持續(xù)時間長，總碳利用率為0.6%，但總氮含量比對照組降低了0.8%。說明微生物菌劑的添加可以提高堆肥效果，但氮素損失也會略微增加。

2.2 銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮含量的變化

由圖2A可見，堆肥過程中銨態(tài)氮的變化整體呈現(xiàn)“升高→降低→升高”的趨勢。在堆肥第5天之后銨態(tài)氮含量逐漸上升，第8天達到最高值，菌劑組為7.8 mg/L，對照組為6.0 mg/L。第8～10天為高溫期，較高的溫度造成NH3大量排放，氮素損失較多，銨態(tài)氮含量逐漸降低。直至第15天降到最低值，菌劑組為3.0 mg/L，對照組為2.0 mg/L，2組差異顯著（P＜0.05）。堆肥后期堆肥溫度逐漸降低，NH3的排放減少，銨態(tài)氮含量逐漸升高。堆肥結(jié)束時菌劑組銨態(tài)氮為5.4 mg/L，對照組為3.6 mg/L。表明高溫纖維素菌促進了堆肥過程的氨化作用，有利于銨態(tài)氮的積累。

圖2 堆肥過程中銨態(tài)氮（A）、亞硝態(tài)氮（B）和硝態(tài)氮（C）的變化Fig.2 Changes in ammonium（A），nitrite（B），nitrate（C）nitrogen during composting

由圖2B可見，亞硝態(tài)氮的整體變化趨勢是先升高后降低，菌劑組在第10天之前一直處于增加狀態(tài)，在第10天達到最高值1.9 mg/L，顯著高于對照組（P＜0.05），之后隨著NO和NO2的排放，亞硝態(tài)氮含量逐漸降低。對照組亞硝態(tài)氮含量在第5天達到最高值1.1 mg/L，在第8天之后開始逐漸下降。至堆肥結(jié)束，菌劑組的亞硝態(tài)氮含量為0.8 mg/L，對照組為0.4 mg/L，菌劑組亞硝態(tài)氮含量顯著高于對照組（P＜0.05）。這可能是因為菌劑組中的高溫纖維素菌在繁殖過程中造成氧氣減少，使得菌劑組的反硝化作用強于對照組。

由圖2C可見，硝態(tài)氮含量初期較高，菌劑組和對照組硝態(tài)氮含量分別為140.6 mg/L和156.3 mg/L。堆肥第5天硝態(tài)氮含量小幅度上升可能的原因是堆肥初期溫度適合硝化細菌的生長繁殖，部分銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮，造成硝態(tài)氮含量的升高。第5天之后由于溫度升高不利于硝化細菌的生長繁殖，硝化作用減弱，且高溫造成氮素的大量損失，硝態(tài)氮含量持續(xù)降低直至堆肥結(jié)束。最終菌劑組和對照組的硝態(tài)氮含量分別為64.9、81.5 mg/L，菌劑組與對照組無顯著差異（P＞0.05），硝態(tài)氮降低幅度分別為53.8%和47.9%。

2.3 氮素轉(zhuǎn)化關(guān)鍵基因拷貝數(shù)的變化

與氮素相關(guān)功能基因拷貝數(shù)的變化可以反映堆肥過程中氮素轉(zhuǎn)化作用的強弱，與硝化/反硝化作用相關(guān)的同一基因中拷貝數(shù)越高，表明硝化/反硝化作用越強。如圖3所示，氨氧化反應(yīng)相關(guān)的amoA基因在菌劑組和對照組中的基因拷貝數(shù)分別在堆肥第1天和第8天達到最高值，菌劑組的基因拷貝數(shù)是對照組的41.1%。amoA的基因拷貝數(shù)變化說明氨氧化反應(yīng)（硝化作用）主要發(fā)生在堆肥前期和中期，而堆肥后期氨氧化反應(yīng)較弱。對照組的narG基因拷貝數(shù)要高于菌劑組。對照組在第8天達到最高值，極顯著高于菌劑組（P＜0.01）。菌劑組在第15天達到最高值，與對照組差異不顯著（P＞0.05）。nirK基因和nirS基因的拷貝數(shù)整體變化趨勢為先升高后降低。菌劑組的nirK和nirS的基因拷貝數(shù)分別在在第8天和第1天達到最高值，極顯著高于對照組（P＜0.01）。對照組在第5天nirK的基因拷貝數(shù)達到最高值，豐度顯著高于菌劑組（P＜0.05）。第8天nosZ的基因拷貝數(shù)達到最高值，菌劑組低于對照組。第28天對照組nosZ基因拷貝數(shù)顯著高于菌劑組（P＜0.05）。整個堆肥進程中對照組的nosZ基因拷貝數(shù)要整體要高于菌劑組。與亞硝酸鹽還原反應(yīng)相關(guān)基因（narG、nirK、nirS和nosZ）的拷貝數(shù)變化，說明菌劑組降低和延緩了反硝化過程。

圖3 堆肥過程中amoA（A）、narG（B）、nirK（C）、nirS（D）和nosZ（E）基因拷貝數(shù)的變化Fig.3 Changes in amoA（A），narG（B），nirK（C），nirS（D）and nosZ（E）gene copy numbers during composting

2.4 理化性質(zhì)與氮素相關(guān)功能基因相關(guān)性分析

分別對菌劑組和對照組的高溫處理尸體堆肥的理化性質(zhì)和氮素相關(guān)功能基因之間的相關(guān)性進行RDA分析，結(jié)果見圖4。圖4中射線夾角的余弦值代表相關(guān)性的大小，余弦值越大，相關(guān)性越大。菌劑組的第1排序軸、第2排序軸的特征值分別為0.697、0.086；對照組的第1排序軸、第2排序軸的特征值分別為0.467、0.018。

圖4 理化性質(zhì)與氮素相關(guān)功能基因相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis between physical and chemical properties and nitrogen-related functional genes

對圖4分析發(fā)現(xiàn)，添加菌劑后amoA基因拷貝數(shù)與NO3-含量相關(guān)性增加，說明添加菌劑使堆肥的氨氧化作用增強；narG基因與NO2-含量在菌劑組呈正相關(guān)，在對照組則呈負相關(guān)，表明添加菌劑使堆肥的反硝化作用增強；nirK基因和NH4+在菌劑組和對照組均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），但菌劑組的相關(guān)性大于對照組，表明菌劑組的氨氧化-反硝化作用更強；nirS基因在菌劑組中與NO2-含量呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），在對照組中則呈正相關(guān)，表明菌劑組中NO2-還原為NO和NO2作用更強。

3 討論

在好氧堆肥中加入纖維素降解菌，能夠促進纖維素的轉(zhuǎn)化，縮短堆肥進程，提高堆肥效率[13]。本研究在動物尸體中添加耐高溫纖維素降解菌，堆肥溫度達63.5℃且加速了尸體和秸稈的降解，表明微生物菌劑能夠有效提高堆肥溫度，促進堆肥快速腐熟。黃穎婕等[14]的堆肥最高溫度比本研究中的耐高溫纖維素菌高，高溫期也更維持，但纖維素酶活低于本研究中的菌株。結(jié)果不一致的原因可能是黃穎婕等[14]研究中使用的是牛糞，本研究使用的則是動物尸體，在纖維素含量和微生物的種類與豐度上存在差異。有研究在豬尸體堆肥過程中添加復(fù)合微生物菌劑，菌劑組促進了尸體降解并改變了其中菌落結(jié)構(gòu)和多樣性[13]。

通過參與硝化作用的amoA基因，以及參與反硝化作用的narG、nirK、nirS和nosZ基因拷貝數(shù)的變化可以評價堆肥過程中氮素轉(zhuǎn)化作用的強度[14]。Guo等[15]發(fā)現(xiàn)在好氧堆肥過程中amoA基因表達豐度與NO3-含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。本研究中耐高溫纖維素菌提高了amoA在堆肥高溫期的表達豐度，表明其能通過上調(diào)amoA基因的表達來增強氨氧化作用，進而將更多的NH4+轉(zhuǎn)化為NO3-，最終減少NH3排放。含氮氣體的排放多少與反硝化作用的強弱有關(guān)。nirK基因編碼的酶在NO的排放起主導(dǎo)作用[16]，而narG[17]，nirS和nosZ[18]濃度與N2的排放顯著相關(guān)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)耐高溫纖維素降解菌在堆肥前期主要是降低了nirK拷貝數(shù)，在堆肥中期降低了narG拷貝數(shù)。雖然降低和延緩反硝化過程，但由于在堆肥前期nirS的拷貝數(shù)增加促進了反硝化作用，使氮素損失加強。本研究中菌劑組的總氮含量比對照組降低了0.8%，這些結(jié)果與敖冬玲[8]在豬尸體堆肥和胡春曉[20]在農(nóng)業(yè)廢物好氧堆肥過程中反硝化作用和氮素損失增加的結(jié)果一致。因此，添加耐高溫纖維素降解菌能加快堆肥腐熟，改變氮素循環(huán)，但也會因促進了反硝化作用而造成氮素損失的增加。因此篩選效率高、造成氮素損失低的復(fù)合微生物菌劑是未來畜禽廢棄物堆肥的發(fā)展方向之一。