陳銘澤,王艷珍,馮晨,蔡奧,曹蕓蕓,周文兵,肖乃東
1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,武漢 430070;2.生豬健康養(yǎng)殖省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,武漢 430070
病死動(dòng)物是一種含有大量蛋白質(zhì)的生物質(zhì)資源[1],以豬為例,豬的病死率約8%~12%[2],據(jù)國家統(tǒng)計(jì)局發(fā)布的2020年生豬出欄量52 704.1萬頭[3],這意味著每年產(chǎn)生數(shù)千萬頭病死豬,而烈性傳染病非洲豬瘟的肆虐,帶來的經(jīng)濟(jì)損失更為嚴(yán)重[4],對(duì)病死動(dòng)物進(jìn)行無害化處理和資源化利用,對(duì)保證人類健康、促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。
針對(duì)病死動(dòng)物尸體的處置方法眾多,2017年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部(原農(nóng)業(yè)部)發(fā)布了《病死及病害動(dòng)物無害化處理技術(shù)規(guī)范》(http://www.moa.gov.cn/nybgb/2017/dqq/201801/t20180103_6133924.htm),介紹了焚燒法、化制法、高溫法、深埋法、化學(xué)處理法的無害化處理方式,其中化學(xué)法中的酸水解是制備氨基酸肥料、實(shí)現(xiàn)高值化利用的可靠手段。微波輔助水解法具有快速、高效和無污染的特點(diǎn),近年來利用此法處理動(dòng)物材料制備氨基酸產(chǎn)品越來越普遍,已受到相關(guān)領(lǐng)域研究人員的青睞。王玉珍[5]使用微波輔助HCl水解羽毛,反應(yīng)時(shí)間需30 min,復(fù)合氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率可達(dá)82.10%。Lopez等[6]優(yōu)化微波輔助酸水解的方法,克服硒氨基酸氧化和蛋白質(zhì)不完全水解的問題,用于測定奶粉中與蛋白質(zhì)結(jié)合的硒氨基酸,該法經(jīng)濟(jì)且有效。Hall等[7]利用微波與酶水解相結(jié)合方法從蟋蟀蛋白中生產(chǎn)生物活性肽,微波在加速水解反應(yīng)、生產(chǎn)高二肽基肽酶-IV(DPP-IV)和高血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制能力的肽方面顯示出優(yōu)越性。Li等[8]在酸性離子液體[PSmim]HSO4環(huán)境中輔以微波水解羊毛,高效膨脹和水解羊毛角蛋白,可將其降解為短肽和游離氨基酸,水解率達(dá)98%以上,與傳統(tǒng)的HCl水解法相比,該法在較溫和條件下帶來更高的水解率,在工業(yè)上制備角蛋白衍生產(chǎn)品具有更好的應(yīng)用潛力??傊⒉ㄝo助水解法環(huán)保、高效,是提高水解效率的有效途徑。
目前,微波輔助水解蛋白質(zhì)制備氨基酸多用語畜禽毛發(fā)或蛋白質(zhì)產(chǎn)品的測定,對(duì)病死畜禽及其相關(guān)產(chǎn)品方面研究較少,而動(dòng)物尸體無害化產(chǎn)物肉骨粉含有大量蛋白質(zhì),用其制備氨基酸液體肥料是其高值化利用的重要途徑。本研究針對(duì)動(dòng)物尸體和小麥麩皮發(fā)酵所得肉骨粉進(jìn)行硫酸水解,制作高品質(zhì)的氨基酸水解液,分別篩選無微波(常規(guī))和有微波輔助下水解的最優(yōu)條件,并比較2種最優(yōu)工藝下大、中、微量植物營養(yǎng)元素及重金屬元素在水解液和固相殘?jiān)械姆植?,評(píng)價(jià)微波輔助硫酸水解工藝的優(yōu)勢及水解產(chǎn)物的安全性,為氨基酸液體肥料的研制奠定基礎(chǔ)。
所用材料取自生豬健康養(yǎng)殖省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心。該中心將實(shí)驗(yàn)用染疫或未染疫動(dòng)物尸體或動(dòng)物組織與小麥麩皮按質(zhì)量比10∶3,在專用微生物發(fā)酵菌劑作用下,經(jīng)90℃下發(fā)酵48~72 h,得到發(fā)酵產(chǎn)物,該發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)烘干并去除動(dòng)物骨頭等粗大雜質(zhì)后即為本試驗(yàn)所用肉骨粉。
經(jīng)檢測,該肉骨粉營養(yǎng)成分如下:粗蛋白48.70%、粗脂肪14.10%、氮10.44%、磷2.20%、鉀0.42%、鈣1.44%、鐵197.57 mg/kg、鋅120.26 mg/kg、銅12.89 mg/kg。
肉骨粉經(jīng)萃取劑萃?。êY選萃取劑種類、固液比)后得到去油肉骨粉,經(jīng)烘干后,采用常規(guī)和微波輔助硫酸水解(篩選硫酸濃度、固液比、水解時(shí)間、水解溫度、微波功率),離心,進(jìn)行固液分離,取液相水解液和固相殘?jiān)謩e進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定。
氨基酸態(tài)氮測定采用甲醛滴定法[9];總氮測定采用濃硫酸消煮法和凱氏定氮法[10];總磷測定采用礬鉬黃比色法[10];總鉀測定采用火焰光度法[10];鈣、鎂、鐵、錳、銅、鋅、鉛、鉻、鎘測定采用原子吸收光譜法[10]。
通過課題組前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),影響肉骨粉中油脂萃取效率的主要因素是萃取劑種類、固液比(肉骨粉質(zhì)量與萃取劑體積的比例),因此對(duì)2種條件進(jìn)行篩選。萃取動(dòng)物油脂的萃取劑一般有乙醚、石油醚、正己烷、柴油等,本試驗(yàn)選取乙醚、石油醚、正己烷為備選萃取劑,肉骨粉和萃取劑的固液比選取1∶5和1∶10。肉骨粉和3種萃取劑分別按2種固液比在室溫條件下萃取,稱量并測定動(dòng)物油脂的萃取率和萃取劑回收率。
油脂萃取率=萃取后萃取劑中油脂質(zhì)量/肉骨粉原料中油脂質(zhì)量×100%;
萃取劑回收率=萃取后萃取劑質(zhì)量/萃取前萃取劑質(zhì)量×100%。
在常規(guī)硫酸水解肉骨粉的工藝條件優(yōu)化中,分別選擇硫酸濃度、固液比(去油肉骨粉質(zhì)量與硫酸體積的比例)、水解時(shí)間和水解溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn),具體操作如下:
1)硫酸濃度的確定。稱?。?.000±0.001)g的去油肉骨粉,分別加入4、5、6、7 mol/L的硫酸25 mL,在水浴溫度90℃下水解7 h。
2)固液比的確定。稱?。?.000±0.001)g的去油肉骨粉,分別加入20、25、30、35 mL 5 mol/L的硫酸,在水浴溫度90℃下水解7 h。
3)水解時(shí)間的確定。稱?。?.000±0.001)g的去油肉骨粉,加入20 mL 5 mol/L的硫酸,在水浴溫度90 ℃下,分別水解3、5、7、9 h。
4)水解溫度的確定。稱?。?.000±0.001)g的去油肉骨粉,加入20 mL 5 mol/L的硫酸,分別在水浴溫度70、80、90、100 ℃ 下水解7 h。
分別以水解液中總氮轉(zhuǎn)化率和氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率為考察指標(biāo)。計(jì)算公式如下:
水解液中總氮轉(zhuǎn)化率=水解液中總氮質(zhì)量/去油肉骨粉中總氮質(zhì)量×100%;
水解液中氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率=水解液中氨基酸態(tài)氮質(zhì)量/去油肉骨粉中總氮質(zhì)量×100%。
在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,以微波功率、硫酸濃度、水解時(shí)間為影響因素,設(shè)計(jì)三因素三水平L9(34)的正交試驗(yàn)(表1),試驗(yàn)中固液比固定為1∶4,以水解液中總氮的轉(zhuǎn)化率和氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率為考察指標(biāo),優(yōu)化微波輔助硫酸水解肉骨粉最佳條件。
表1 微波輔助下硫酸水解去油肉骨粉正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Factor and level design for hydrolysis of degreased meat and bone meal by sulfuric acid with microwave aid
經(jīng)過2種水解工藝條件篩選,在最優(yōu)條件下對(duì)去油肉骨粉進(jìn)行水解,收集液相水解液和固相殘?jiān)?,分別進(jìn)行大、中、微量植物營養(yǎng)元素和重金屬元素的含量測定,檢驗(yàn)水解前后各元素的物料平衡,并計(jì)算不同工藝下這些元素在液相中的占比,即液相水解液中某元素的質(zhì)量在水解原料去油肉骨粉質(zhì)量的占比,從而分析其資源化率。
本試驗(yàn)中萃取率、總氮和氨基酸態(tài)氮測定均重復(fù)3次,取平均值,試驗(yàn)所測定的數(shù)據(jù)用Excel 2016軟件進(jìn)行處理,用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用Origin 2018軟件進(jìn)行作圖。
不同萃取劑及固液比下肉骨粉油脂的萃取率及萃取劑回收率見表2。可見不同萃取劑對(duì)肉骨粉的萃取效果不同,在固液比為1∶5時(shí),石油醚對(duì)油脂的萃取效果最佳,達(dá)到了99.42%,但石油醚易揮發(fā),造成石油醚的回收率較低;正己烷雖然萃取效果不及石油醚,在固液比為1∶10時(shí)才能完全萃取肉骨粉中的油脂,但其回收率比石油醚高,不易造成物料損失。實(shí)際應(yīng)用中可考慮用正己烷萃取,既有不錯(cuò)的萃取效果,也能減少有機(jī)萃取劑的損耗。因此,本試驗(yàn)選取正己烷為萃取劑,固液比為1∶10。
表2 不同萃取劑及固液比下肉骨粉油脂的萃取效果Table 2 Extraction effect of grease from meat and bone meal under the conditions of different extractants and ratios of solid to liquid %
常規(guī)(無微波)條件下,不同硫酸濃度、固液比、水解時(shí)間和水解溫度下水解液中不同形態(tài)氮的質(zhì)量濃度見圖1。由圖1 A可知,隨著硫酸濃度的增加,總氮(total nitrogen,TN)質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先增加,然后逐漸下降趨勢,而氨基酸態(tài)氮(amino acid-nitrogen,AAN)質(zhì)量濃度則呈現(xiàn)緩慢增加趨勢。在硫酸濃度為5 mol/L時(shí),水解液中總氮質(zhì)量濃度最高,為21.28 g/L,更高濃度的6和7 mol/L的硫酸并不能使水解液中總氮質(zhì)量濃度進(jìn)一步提高。雖然隨著硫酸濃度的增加,水解液中氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度有所增加,但綜合考慮水解過程的成本投入,以及總氮中非氨基酸如小肽和多肽,也可作為氮素的特殊形態(tài)被作物吸收利用,發(fā)揮其調(diào)節(jié)植物生長、改善作物品質(zhì)、增強(qiáng)作物免疫力、提高肥料利用率的作用[11],選取5 mol/L作為最佳的硫酸濃度。
圖1 不同硫酸濃度(A)、固液比(B)、水解時(shí)間(C)和水解溫度(D)下水解液中不同形態(tài)氮的含量Fig.1 The content of nitrogen in different forms in sulfuric acid hydrolysate under different sulfuric acid concentrations(A),ratios of solid to liquid(B),hydrolysis time(C)and hydrolysis temperature(D)
如圖1B所示,當(dāng)固液比從1∶4至1∶7的變化過程中,總氮和氨基酸態(tài)氮含量均呈下降趨勢。在固液比為1∶4時(shí),水解液中總氮和氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度均為最高,分別為28.70和12.33 g/L。因此,固液比選用1∶4。
如圖1C所示,當(dāng)水解時(shí)間從3 h分別增加為5、7、9 h時(shí),水解液中總氮質(zhì)量濃度呈先增加后下降趨勢,7 h時(shí)達(dá)到最高的28.70 g/L;氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度先增加,在7 h后保持不變,表明在水解7 h時(shí),水溶性蛋白質(zhì)水解成氨基酸和小分子多肽的含量達(dá)到最大值,而水解7 h后,時(shí)間已不是制約蛋白質(zhì)水解的主要因素。因此,最佳水解時(shí)間選擇7 h。
如圖1D所示,當(dāng)溫度升高,水解液中蛋白質(zhì)含量隨之增加,氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度也隨之增加。這說明隨著溫度升高,肉骨粉中越來越多的固體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄缘鞍踪|(zhì),進(jìn)一步水解為氨基酸的程度也同時(shí)增大。當(dāng)溫度升高至90℃,總氮、氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度分別為28.70、12.95 g/L,均達(dá)到最高,繼續(xù)升溫兩者均略微降低。因此,最佳水解溫度為90℃。
綜上,常規(guī)條件下硫酸水解的單因素最佳條件為:固液比1∶4、硫酸濃度5 mol/L、水解溫度90℃、水解時(shí)間7 h,在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),總氮質(zhì)量濃度為28.70 g/L,氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度為12.95 g/L,其轉(zhuǎn)化率分別為93.42%和42.63%,達(dá)到最高。
表3中各因素的極值R的大小順序?yàn)镽1>R2>R3,說明各因素對(duì)氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率影響的主次順序?yàn)槲⒉üβ剩玖蛩釢舛龋舅鈺r(shí)間,在可選因素水平范圍內(nèi),其最優(yōu)組合為A3B2C3,即在微波功率550 W、硫酸濃度5 mol/L、水解時(shí)間60 min條件下氨基酸態(tài)氮的轉(zhuǎn)化率最高,經(jīng)過驗(yàn)證試驗(yàn),在此最佳組合條件下,水解液總氮27.38 g/L,氨基酸態(tài)氮24.95g/L;水解液總氮轉(zhuǎn)化率為90.12%,氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率達(dá)到82.13%。
表3 微波輔助硫酸水解去油肉骨粉的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal test results of degreased meat and bone meal hydrolyzed by sulfuric acid with microwave aid
微波輔助下硫酸水解去油肉骨粉水解液中氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率的方差分析見表4。對(duì)微波功率、水解時(shí)間、硫酸濃度建立單因素主效應(yīng)模型,得到模型R2=0.995(調(diào)整R2=0.982),微波功率對(duì)氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率的影響極顯著;硫酸濃度和水解時(shí)間對(duì)氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率的影響顯著,且不同因素對(duì)氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率影響的主次順序?yàn)椋何⒉üβ剩玖蛩釢舛龋舅鈺r(shí)間,與表3極差分析結(jié)果一致。
表4 氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率的方差分析Table 4 Variance analysis of conversion rate of amino acid
實(shí)際操作中,每40.0 g去油肉骨粉在最佳常規(guī)硫酸水解條件下得到水解液160 mL和14.0 g殘?jiān)辉谧罴盐⒉ㄝo助硫酸水解條件下得到水解液160 mL和13.2 g殘?jiān)?/p>
將液固兩相各元素質(zhì)量之和與去油肉骨粉中各元素質(zhì)量進(jìn)行比較,以評(píng)判其是否符合物料平衡。表5、6結(jié)果表明,所測原料中各元素的質(zhì)量與水解后固液兩相質(zhì)量之和基本相等,符合物料平衡;比較幾種元素在液相中的占比,在2種工藝下各元素占比均無明顯差異。
表5 最佳條件下硫酸水解去油肉骨粉中大、中量元素的物料衡算Table 5 Material balance of macro and medium elements in degreased meat and bone meal hydrolyzed by sulfuric acid under the optimum conditions
表6 最佳條件下硫酸水解去油肉骨粉中微量元素和重金屬元素的物料衡算Table 6 Material balance of micro and heavy metal elements in degreased meat and bone meal hydrolyzed by sulfuric acid under the optimum conditions
表5顯示,在2種工藝的最佳條件下,TN在水解液中比例均達(dá)到90%以上,但前文中常規(guī)條件下水解液中氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度遠(yuǎn)低于微波輔助水解條件下的,說明常規(guī)條件下大量蛋白質(zhì)溶解而未被水解,而微波輔助條件下大量蛋白質(zhì)可水解為氨基酸,表明微波輔助條件顯著提高了蛋白質(zhì)的水解效率。由此可知,微波輔助硫酸水解蛋白質(zhì)可節(jié)約大量水解時(shí)間,并且提高了蛋白質(zhì)的水解程度。表5還顯示,原料中85%的鉀分布在水解液中,65%以上的磷留在液相中。結(jié)果表明,2種工藝條件下大量營養(yǎng)元素(N、P、K)多數(shù)被水解進(jìn)入水解液中,而微波輔助水解作為氨基酸液體肥料的生產(chǎn)工藝優(yōu)勢明顯。
在表5中,一個(gè)特殊的情況是鈣的分布問題,即不論是常規(guī)水解還是微波輔助水解,都有95%以上的鈣分布于殘?jiān)?,這可能是由于使用硫酸水解肉骨粉,鈣離子易與硫酸根離子形成硫酸鈣沉淀,致使鈣離子大量保留于殘?jiān)?;此外,鎂在2種工藝條件下有超過50%分布在水解液中,未水解部分可能以磷酸鎂形式留在殘?jiān)小?種中量植物營養(yǎng)元素(Ca、Mg)在2種硫酸水解工藝下均大量損失在固相殘?jiān)?,在水解液中占比較低,這是2種工藝的共同不足之處。
由表6中微量元素在液相中占比可知,去油肉骨粉中Fe、Cu、Zn的71%~87%分布在水解液中,可作為有效養(yǎng)分為植物生長提供營養(yǎng);Mn只有25.84%(常規(guī)水解)、32.58%(微波輔助水解)分布于水解液中,這可能是由于錳(Mn)以磷酸錳沉淀的形式存在,而這也可能是磷的水解率明顯低于氮和鉀的水解率的重要原因。總體來看,肉骨粉中的大部分微量元素可進(jìn)入液相水解液中,具有利用價(jià)值。
表6中的重金屬元素Pb、Cr、Cd在水解液中占比較高,均超過了58%。按農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY 1110—2010《水溶肥料汞、砷、鎘、鉛、鉻的限量要求》中,鉛、鉻、鎘的限量標(biāo)準(zhǔn)分別為50、50、10 mg/kg,2種水解液中重金屬元素也可認(rèn)為符合該水溶肥料的要求。相比常規(guī)硫酸水解條件,在微波輔助硫酸水解條件下,Pb、Cd在水解液中占比小幅降低,Cr在水解液中占比略有升高,總體差異不大。
常規(guī)條件下硫酸水解去油肉骨粉,肉骨粉蛋白質(zhì)的肽鍵會(huì)被H+打破,可完全水解為氨基酸,因此硫酸濃度是決定水解效果的關(guān)鍵影響因素,但隨著硫酸濃度的升高,溶液黏稠度增加,固態(tài)蛋白質(zhì)更難溶解,導(dǎo)致液相中氮含量逐步下降。沈其榮等[12]對(duì)病死豬瘦肉硫酸水解獲得的最優(yōu)條件為:固液比1∶1.5、硫酸濃度5 mol/L、溫度80℃、水解時(shí)間6 h,總氮質(zhì)量濃度為10.33 g/L,游離氨基酸、可溶性多肽及可溶性蛋白氮為9.53 g/L。本研究與其所用硫酸濃度一致,但肉骨粉硫酸水解液在氮含量上有明顯優(yōu)勢,主要原因是肉骨粉水解使用的硫酸體積更大(固液比1∶4 vs 1∶1.5),較小的固液比有利于溶解更多氨基酸,水解反應(yīng)更充分,水解效果更好;此外,水解時(shí)間是影響蛋白質(zhì)水解為氨基酸的重要因素,需嚴(yán)格控制水解時(shí)間,避免氨基酸被分解破壞;水解溫度影響蛋白質(zhì)中肽鍵的穩(wěn)定性,根據(jù)肽鍵的斷裂熱力學(xué)分析,溫度越高越有利于肽鍵的斷裂,但溫度過高同樣會(huì)加快氨基酸的分解[13]。因此,需要考慮增強(qiáng)水解反應(yīng)強(qiáng)度帶來的成本與效益問題,依此原則本研究得到常規(guī)水解的最佳水解條件。
在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)篩選微波輔助硫酸水解的最佳條件,水解時(shí)間縮短為常規(guī)水解的1/7(1 h vs 7 h),氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率明顯提高(82.13%vs 42.63%)。這是由于微波輔助蛋白質(zhì)水解存在水分子和蛋白質(zhì)分子吸收微波,迅速升溫的熱效應(yīng)和影響蛋白質(zhì)的折疊、展開的非熱效應(yīng)[14],因此微波輔助促進(jìn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞,使復(fù)雜的蛋白質(zhì)大分子更易水解為氨基酸小分子,既縮短了水解時(shí)間,又提高了氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率。同時(shí),在微波輔助硫酸水解實(shí)驗(yàn)中,微波功率極顯著影響氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率,是提高微波酸水解效率的關(guān)鍵。
在2種工藝條件下,去油肉骨粉含有的大、中、微量植物營養(yǎng)元素和重金屬元素均大量水解進(jìn)入液相,兩者差異不大,說明微波輔助對(duì)水解液中各元素總含量差異影響較小,但微波輔助下硫酸水解由于產(chǎn)生了更多的氨基酸,會(huì)使微量元素及重金屬元素更多以氨基酸-金屬離子絡(luò)合態(tài)存在,從而使2種工藝下這些元素在水解液中化學(xué)狀態(tài)存在一定差異,其作物營養(yǎng)效應(yīng)的差異值得更進(jìn)一步探究。
本研究結(jié)果表明,微波輔助硫酸水解是一種高效的水解蛋白質(zhì)為氨基酸的手段,實(shí)現(xiàn)了高蛋白廢棄物肉骨粉的高值化利用,但同時(shí)也存在能耗較大的問題,在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中需協(xié)調(diào)好成本和效益關(guān)系。另一方面,本研究僅獲得了水解液,可用作制備氨基酸液體肥料的原料,后續(xù)肥料配制及其肥效尚需進(jìn)一步研究。此外,無論有無微波下的硫酸水解,肉骨粉水解后都會(huì)剩余約占原固相質(zhì)量三分之一的殘?jiān)?,這些殘?jiān)鼡p失了原料中部分營養(yǎng)元素且需后續(xù)進(jìn)行專門的處理??傮w來看,微波輔助硫酸水解肉骨粉制備氨基酸水解液工藝優(yōu)勢突出,在蛋白質(zhì)廢棄物資源化應(yīng)用方面有巨大潛力。
華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)2022年4期