張煦堯，秦文杰，江洪，謝勁松，李慶，曹秀芳

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，武漢 430070；2.生豬健康養(yǎng)殖省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070

隨著我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)集約化規(guī)?；M程的推進，養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的大量畜禽糞便造成了嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)面源污染，制約著畜禽養(yǎng)殖業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展。因此，畜禽糞便處理方法需遵循三大原則：減量化、無害化和資源化。如今國內(nèi)常用的畜禽糞便處理方法主要是好氧堆肥，通過微生物的作用，使畜禽糞便最終成為安全穩(wěn)定的土壤改良劑[1]。但在堆肥的過程中，16%～74%的初始氮會以氣態(tài)氮（NH3和N2O）的形式損失，這既導(dǎo)致堆肥產(chǎn)品質(zhì)量的下降，又會造成嚴(yán)重的空氣污染[2]。近年來利用亮斑扁角水虻處理有機廢棄物已成為一種新興的技術(shù)。亮斑扁角水虻（Hermitia illucensL.）又稱黑水虻（black soldier fly，BSF），是雙翅目水虻科（Stratiomyidae）扁角水虻屬（Hermetia latreille）食腐性昆蟲，廣泛分布于熱帶和溫帶地區(qū)[3]，因此其能在中國廣大地區(qū)養(yǎng)殖。亮斑扁角水虻幼蟲能將畜禽糞便中的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為自身生物質(zhì)，同時殘留物可以用作土壤改良劑[4]。相比于傳統(tǒng)堆肥來說，亮斑扁角水虻將畜禽糞便中的一部分氮損失轉(zhuǎn)移到自身，但在其轉(zhuǎn)化畜禽糞便過程中的NH3排放仍然是氮損失的重要途徑。脲酶抑制劑是一種傳統(tǒng)的氮肥增效劑，其主要功效是通過抑制土壤中的脲酶活性，從而抑制土壤中尿素的水解，進一步降低土壤中的NH4+的濃度，從而減少NH3的排放[5]。已有研究顯示，在堆肥過程中添加脲酶抑制劑可以有效減少26.3%的NH3排放，同時對氮轉(zhuǎn)化相關(guān)的酶產(chǎn)生影響[6]，然而脲酶抑制劑對亮斑扁角水虻生物轉(zhuǎn)化糞便的影響還未見文獻報道。因此，本研究在亮斑扁角水虻轉(zhuǎn)化雞糞體系中添加不同脲酶抑制劑，分析其對NH3排放以及底物中的氮分布的影響，旨在為后續(xù)水虻生產(chǎn)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

亮斑扁角水虻幼蟲（black soldier fly larvae，BSFL）來源于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室食用昆蟲與微生物研發(fā)團隊。新鮮雞糞收集于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗雞場，稻谷殼購置于當(dāng)?shù)厥袌?，原始材料的物理化學(xué)性質(zhì)見表1。脲酶抑制劑N-丁基硫代磷酰三胺（NBPT）、乙酰氧肟酸（AHA）、氫醌（HQ）購自武漢欣申試化工科技有限公司。

表1 試驗材料基本理化性質(zhì)Table 1 Basic properties of raw materials

1.2 試驗方法

將雞糞與稻谷殼混合均勻，對照組不添加脲酶抑制劑，試驗組加入不同脲酶抑制劑（以雞糞濕質(zhì)量0.1%計）N-丁基硫代磷酰三胺（NBPT）、乙酰氧肟酸（AHA）、氫醌（HQ），分別編號為 CK、NBPT、AHA和HQ組。調(diào)節(jié)水分含量約為65%，分裝在3 L的玻璃瓶中，所有組別重復(fù)3次。向每瓶中投入800頭在麥麩中喂養(yǎng)的5日齡亮斑扁角水虻幼蟲，在30 ℃下進行培養(yǎng)。分別于第0、2、4、6、8、10天采集底物于密封袋中，保存于-20℃冰箱，用于后續(xù)理化性質(zhì)測定。轉(zhuǎn)化過程中每日用稀H2SO4吸收反應(yīng)中釋放的NH3，然后用NaOH溶液進行滴定，并記錄滴定體積。當(dāng)處理組中出現(xiàn)水虻預(yù)蛹后，將幼蟲與基質(zhì)殘渣分離，統(tǒng)計不同處理的幼蟲總質(zhì)量、存活率，基質(zhì)殘渣在50℃烘干，記錄干質(zhì)量。蟲體氮計算公式如下：

1.3 理化指標(biāo)測定

殘渣樣品基本理化指標(biāo)參照《土壤農(nóng)化分析》的方法測定；底物pH值和電導(dǎo)率值采用pH計和電導(dǎo)率儀法測定（浸提比1∶10）；底物中NH4+-N、NO3--N用2 mol/L的KCl溶液浸提，過濾后，用比色法測定NH4+、NO3-含量。殘渣樣品風(fēng)干后，用H2SO4-H2O2消解殘渣及蟲體，用全自動凱氏定氮儀測定樣品中凱氏氮含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)通過Excel 2010軟件進行統(tǒng)計分析，并用Origin 9.1進行繪圖。使用SPSS（SPSS Statistics IBM）26.0，進行單因素方差分析（ANOVA）。P＜0.05則認(rèn)為比較值之間具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同脲酶抑制劑對轉(zhuǎn)化過程中NH3排放的影響

NH3的排放是亮斑扁角水虻轉(zhuǎn)化畜禽糞便的重要指標(biāo)之一。本研究僅測定水虻轉(zhuǎn)化雞糞過程中NH3的排放量。如圖1所示，在試驗進行的前8 d基本沒有NH3排放，從第9天開始，NH3排放量逐漸增加，在第10天達到峰值。相比于對照組，所有添加脲酶抑制劑的處理組均降低了NH3排放量，其中到第10天時，對照組排放量最高，達（189.31±17.71）mg，HQ組最低，為（63.65±8.60）mg。如圖2所示，亮斑扁角水虻轉(zhuǎn)化雞糞過程中累計NH3排放量CK組＞AHA組＞NBPT組＞HQ組，累計NH3排放量分別為（269.28±24.52）、（221.95±59.18）、（195.84±14.13）、（93.84±14.89）mg。其中添加脲酶抑制劑HQ對于NH3減排的效果最好，相比于對照組減少了65.15%的NH3排放量。

圖1 亮斑扁角水虻轉(zhuǎn)化過程中NH3日均排放量Fig.1 Daily NH3emission during BSFL bioconversion

圖2 亮斑扁角水虻轉(zhuǎn)化過程中NH3累計排放量Fig.2 Cumulative NH3emission during BSFL bioconversion

2.2 不同脲酶抑制劑對水虻轉(zhuǎn)化效率的影響

從表2可以看出，所有添加脲酶抑制劑處理組的亮斑扁角水虻存活率及蟲體增加質(zhì)量情況均高于對照組，其中HQ組效果最好，相比于對照組，蟲體質(zhì)量增加上升34.01%。如表2所示，HQ組獲得的蟲體氮占初始氮的（16.24±0.45）%，相比于對照組，HQ組蟲體氮提高21.74%。說明水虻在轉(zhuǎn)化雞糞的過程中，添加脲酶抑制劑可以增加獲取水虻蟲體的生物質(zhì)。

表2 不同脲酶抑制劑處理下亮斑扁角水虻生長情況Table 2 Growth of BSFL under different urease inhibitors

2.3 不同脲酶抑制劑對轉(zhuǎn)化過程中pH值和EC值的影響

pH值隨時間的變化如圖3所示。在整個轉(zhuǎn)化周期內(nèi)，所有處理組的pH值的變化趨勢保持基本一致，試驗的前8 d保持在弱酸性，在試驗第8～10天pH值快速上升到8以上。所有處理組的電導(dǎo)率值動態(tài)變化如圖4所示，對照組與加入脲酶抑制劑的3個處理組表現(xiàn)出相近的變化趨勢，都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中對照組與AHA組在試驗的第6天出現(xiàn)峰值，NBPT組和HQ組的峰值則出現(xiàn)在第8天，轉(zhuǎn)化結(jié)束時所有處理組的電導(dǎo)率值出現(xiàn)下降說明底物性質(zhì)趨近于穩(wěn)定。

圖3 亮斑扁角水虻轉(zhuǎn)化過程中pH動態(tài)變化Fig.3 Changes of pH during BSFL bioconversion

圖4 亮斑扁角水虻轉(zhuǎn)化過程中電導(dǎo)率值動態(tài)變化Fig.4 Changes of EC during BSFL bioconversion

2.4 不同脲酶抑制劑對底物中NH4+-N、NO3--N含量的影響

由圖5所示，在亮斑扁角水虻轉(zhuǎn)化雞糞的過程中，NH4+呈現(xiàn)先升高后降低再短暫升高的趨勢。在0～4 d中NBPT組、AHA組、HQ組的NH4+含量均低于對照組。但在6 d后，添加脲酶抑制劑的處理組中，NH4+含量反超對照組。除NBPT組外，其他處理組都在試驗進行的第6天出現(xiàn)峰值，CK組、AHA組和 HQ 組的峰值分別為（6.80±0.96）、（7.19±0.42）和（8.35±0.67）g/kg，NBPT組的峰值則出現(xiàn)在第10天，為（7.51±0.10）g/kg。由圖6可見，在整個轉(zhuǎn)化過程中，NO3-呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，與轉(zhuǎn)化過程中的NH4+動態(tài)變化呈現(xiàn)相反趨勢。除對照組外，其他試驗組都在試驗進行的第4天出現(xiàn)最低值，NBPT組、AHA組和HQ組的峰值分別為（0.06±0.01）、（0.04±0.01）和（0.02±0.01）g/kg。對照組則在第8天出現(xiàn)最低值，為（0.07±0.01）g/kg。

圖5 轉(zhuǎn)化過程中NH4+-N動態(tài)變化Fig.5 Changes of NH4+-N during BSFL bioconversion

圖6 轉(zhuǎn)化過程中NO3--N動態(tài)變化Fig.6 Changes of NO3--N during BSFL bioconversion

3 討論

在亮斑扁角水虻轉(zhuǎn)化雞糞體系中，NH3的產(chǎn)生是多種因素共同作用的結(jié)果。本研究結(jié)果雖然無法證明亮斑扁角水虻是否與NH3的排放直接相關(guān)，但據(jù)文獻報道NH3的產(chǎn)生可能是亮斑扁角水虻和微生物共同分解利用雞糞中含氮有機物，發(fā)生氨化作用，從而產(chǎn)生NH4+，NH4+在一定條件下以NH3的形式逸出[7]，我們將在后續(xù)試驗設(shè)計中增加對于相關(guān)功能基因的測定，通過功能基因判斷黑水虻與NH3排放之間的具體關(guān)聯(lián)。脲酶抑制劑是通過抑制轉(zhuǎn)化過程中有機氮的分解，從而減少NH4+的產(chǎn)生，進一步減少硝化、反硝化反應(yīng)的發(fā)生[8]。從轉(zhuǎn)化過程中NH3的排放情況可以看出，在轉(zhuǎn)化前期，由于底物的pH值處于弱酸性，不利于NH3從底物中排放，導(dǎo)致試驗進行的前8 d沒有檢測到NH3的排放；但隨著亮斑扁角水虻在底物中不斷的活動，使得轉(zhuǎn)化過的底物pH值上升并呈現(xiàn)疏松的狀態(tài)[9]，pH值達到中性甚至堿性，NH3的排放量逐漸上升；而脲酶抑制劑可以抑制轉(zhuǎn)化過程中有機氮的分解，所以添加脲酶抑制劑的試驗組NH3排放量減少。由于本研究是以出現(xiàn)黑水虻的預(yù)蛹時即結(jié)束整個黑水虻轉(zhuǎn)化過程，而這個過程只有10 d，故此研究取樣時間段設(shè)定為10 d，所以NH3的排放量數(shù)據(jù)檢測也只針對于這個期間，不針對于轉(zhuǎn)化后底物二次腐熟的階段，后續(xù)會對殘渣二次腐熟過程中NH3的排放情況進行深入研究。而試驗前8 d未能測得NH3排放，可能是試驗前期底物中pH值偏低，從而影響了NH3的排放。

對于底物中的氮素組分而言，添加脲酶抑制劑的試驗組在前期NH4+含量較低，其原因可能是脲酶抑制劑可以延緩底物中有機氮向NH4+轉(zhuǎn)化[10]，但隨著亮斑扁角水虻蟲體的生長發(fā)育，幼蟲對底物中營養(yǎng)物質(zhì)的利用速率提高，從而加速底物中有機氮的礦化作用，使得底物中的NH4+含量升高[7]，底物中的NH4+累積，使各個處理組中的底物pH值逐漸升高，導(dǎo)致亮斑扁角水虻轉(zhuǎn)化結(jié)束時底物呈堿性。對于轉(zhuǎn)化過程中NO3-而言，轉(zhuǎn)化過程前期添加脲酶抑制劑的試驗組硝化速率低于對照組，但隨著試驗的進行，脲酶抑制劑活性減弱導(dǎo)致處理組底物中NO3-的加速產(chǎn)生，進而出現(xiàn)NO3-含量上升的趨勢。脲酶抑制劑主要的作用對象是底物中的尿素，通過抑制尿素的分解減少NH4+的產(chǎn)生，從而抑制硝化反應(yīng)的發(fā)生，減少NO3-的含量；對于亮斑扁角水虻蟲體而言，脲酶抑制劑的添加實現(xiàn)保氮作用，能夠保留初始底物中營養(yǎng)物質(zhì)，使亮斑扁角水虻蟲體充分利用，可為后續(xù)亮斑扁角水虻相關(guān)產(chǎn)品的高值化利用提供實驗依據(jù)。

本研究中，向亮斑扁角水虻轉(zhuǎn)化畜禽糞便過程中添加不同脲酶抑制劑，通過測定亮斑扁角水虻轉(zhuǎn)化的過程中的氣體排放情況以及殘渣中氮組分等指標(biāo)，可以證實脲酶抑制劑的添加能減少氮元素以NH3的形式損失，同時使更多營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)移到蟲體生物質(zhì)，提高亮斑扁角水虻對于畜禽糞便的轉(zhuǎn)化利用效率。但本研究只是初步探索脲酶抑制劑對亮斑扁角水虻轉(zhuǎn)化雞糞體系中氮素流向的影響，脲酶抑制劑作用的到底是黑水虻蟲體腸道中的微生物菌落還是底物中的微生物菌落，本研究還無法得出結(jié)論，還需要進一步進行研究和驗證，在后續(xù)的研究中將會關(guān)注脲酶抑制劑對氮轉(zhuǎn)化和相關(guān)功能基因的影響。Jiang等[11]的研究表明，在傳統(tǒng)堆肥的初始階段，脲酶抑制劑顯著降低了氨單加氧酶、亞硝酸鹽還原酶和氧化亞氮還原酶的豐度，而在成熟階段觀察到相反的趨勢。但是在脲酶抑制劑影響硝化和反硝化反應(yīng)過程中涉及的基因較多，基因間的聯(lián)系緊密而復(fù)雜。反應(yīng)關(guān)鍵酶的動態(tài)變化和相互影響還鮮有研究，后續(xù)將會對脲酶抑制劑對亮斑扁角水虻轉(zhuǎn)化畜禽糞便過程中氮轉(zhuǎn)化功能基因和細(xì)菌群落演替的作用機制進行深入研究。

總體而言，在亮斑扁角水虻轉(zhuǎn)化雞糞體系中，添加脲酶抑制劑能有效減少亮斑扁角水虻轉(zhuǎn)化雞糞中NH3的排放量，其中HQ組相比于對照組NH3減排量高達65.15%。并且脲酶抑制劑的添加有利于亮斑扁角水虻蟲體的存活和生長，底物中的氮素更多地向蟲體富集，其中HQ組中初始氮的16.24%轉(zhuǎn)移到亮斑扁角水虻蟲體。脲酶抑制劑的添加有助于亮斑扁角水虻轉(zhuǎn)化雞糞過程中NH3的減排及氮素向昆蟲蛋白的定向轉(zhuǎn)化。