吳楠 章晟 葉宸汐 袁振飛 林慧晶 游嘉 徐旭

種植牙技術已逐漸成為牙列缺損的主流修復方式之一。純鈦及鈦合金是種植體最常用的金屬，近年來，3D打印技術越來越多地運用于鈦及鈦合金種植體的加工制造[1-2]。選擇性激光熔化技術（selective laser melting,SLM）是目前發(fā)展最為迅速的金屬3D打印技術。SLM可以適應任意復雜結構的成型，可用于個性化設計種植體，使之與牙槽窩相匹配。已有體內外實驗研究顯示，在SLM打印鈦合金種植體表面附著的成骨細胞表現(xiàn)出良好的黏附、增殖等生物性能，成骨相關基因顯著表達，具有良好的骨結合能力[3-4]，證實SLM打印鈦合金種植體具有良好的應用前景。但是，3D打印種植體表面粗糙度較高，細菌容易黏附并形成細菌生物膜，致使發(fā)生種植體周圍炎[5]。而種植體周圍炎一旦發(fā)生，即便采用現(xiàn)有的各種治療措施，也難以達到令人滿意的效果，最終可能導致種植失敗。近年來，種植體表面改性逐漸受研究者們青睞，即對種植體表面進行功能化的納米二氧化鈦結構改性，引入氟使其具有穩(wěn)定的表面抑菌效果[6]，這是提高種植體表面抗菌活性的同時提高骨結合能力的理想方法。氟已被證明具有良好的抗菌性能，較高的氟含量可以顯著提高材料的抗菌性能、促進成骨，沒有明顯的細胞毒性[7-8]。成骨細胞在種植體表面的黏附和增殖是其表面生物相容性、生物活性優(yōu)劣的重要體現(xiàn)。相較于單純的納米二氧化鈦改性，摻雜氟的納米二氧化鈦結構可以促進成骨細胞在材料表面的黏附和增殖[7,9-12]。以往研究主要以傳統(tǒng)切割純鈦或者鈦合金片為研究對象，SLM打印鈦合金片表面含氟納米二氧化鈦薄膜結構的生物相容性及抗菌性能評價研究少見?；诖?，本實驗對SLM打印鈦合金片表面進行預處理獲得含氟納米二氧化鈦薄膜結構，隨后觀察成骨細胞在其表面的黏附、增殖情況，以及該結構對其表面大腸桿菌、金黃色葡萄球菌生長的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 細胞來源及主要試劑 小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1 Subclone 14細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司），細胞專用培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司，型號：CM0378）；鬼筆環(huán)肽（北京索萊寶科技有限公司，型號：CA1620）；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）溶液（北京索萊寶科技有限公司，型號：C0065）；抗熒光衰減封片劑（北京索萊寶科技有限公司，型號：S2100）；CCK-8試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，型號：CA1210）；4%多聚甲醛（上海源葉生物科技有限公司，型號：R20497）；Triton X-100（上海源葉生物科技有限公司，型號：S15022）；2.5%戊二醛（上海源葉生物科技有限公司，型號：R20510）；0.25%胰蛋白酶（上海源葉生物公科技有限公司，型號：R20107）；PBS（美國Gibco公司）；大腸桿菌（衢州市人民醫(yī)院檢驗科，型號：ATCC25922）；金黃色葡萄球菌（衢州市人民醫(yī)院檢驗科，型號：ATCC25923）；活/死細菌染色試劑盒（美國ThermoFisher公司，型號：L13152）；30%過氧化氫（上海凌峰化學試劑有限公司）；無水乙醇、異丙醇（國藥集團化學試劑有限公司）；六氟鈦酸（阿拉丁生化科技股份有限公司）；鹽酸（永華化學科技有限公司）；超純水（自制）。

1.2 主要儀器 熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；恒溫水浴鍋（美國ThermoFisher公司）；細胞培養(yǎng)箱（美國ThermoFisher公司）；酶標儀（美國BioTek公司）；場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本日立公司，型號：SU8000）；恒溫搖床（美國ThermoFisher公司）。

1.3 試樣制備 選用SLM 3D打印鈦合金片（直徑10 mm，厚度1 mm，小圓片形）為基體。SLM 3D打印鈦合金片由雷尼紹AM400打印制造（加工參數：功率200 W，點間距55 μm，曝光時間50 s）。將鈦合金片經噴砂酸蝕等標準化處理去除表面部分熔化的粉末，用無水乙醇、超純水各自超聲清洗5 min，重復清洗3次后晾干。將其放入30 ml 30%過氧化氫的溶液里，置于80℃下1 h，然后將樣品取出，用超純水超聲清洗，晾干備用。以六氟鈦酸（0.885 mmol/L）、異丙醇（33 mmol/L）、鹽酸（13 mmol/L）、過氧化氫（13 mmol/L）混合溶液為前驅液，將備用的鈦合金片浸入盛有18 ml前驅液的25 ml規(guī)格聚四氟乙烯內襯不銹鋼高壓反應釜中，在160℃下水熱反應2 h。反應結束后，取出樣品并用超純水超聲清洗2 min，即實驗組。未進行水熱反應的樣品為對照組。兩組樣品均置于超純水中80℃過夜，晾干后，在120℃高壓蒸汽滅菌30 min后備用。

1.4 試樣的表征 制備的實驗組鈦合金片用掃描電子顯微鏡觀察表面微形貌并使用X線能譜儀（energy dispersive spectrometer,EDS）定量分析表面元素。室溫下，用光學接觸角測量儀測量接觸角，分析兩組鈦合金片的接觸角，液體使用超純水，每組選3個鈦合金片，每個鈦合金片表面測量3個位點。

1.5 成骨細胞活性實驗

1.5.1 細胞培養(yǎng) MC3T3-E1 Subclone 14細胞培養(yǎng)液為MC3T3-E1 Subclone 14細胞專用培養(yǎng)基。細胞置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，常規(guī)換液與傳代。

1.5.2 DAPI和鬼筆環(huán)肽熒光染色 將鈦合金片置于24孔培養(yǎng)板中，消化細胞后，鋪于鈦合金片表面，接種密度為2×104個/ml。分別培養(yǎng)3、6 h后，PBS輕柔漂洗2次，4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS漂洗3次，每次10 min。用0.5%Triton X-100溶液透化處理5 min，PBS漂洗3次，10 min/次。鬼筆環(huán)肽室溫避光孵育30 min，PBS漂洗3次，5 min/次。用DAPI染色液復染細胞核，約3 min。吸除DAPI染色液，PBS漂洗3次，5 min/次。滴加適量抗熒光衰減封片劑，置于熒光倒置顯微鏡下觀察成骨細胞黏附伸展的形態(tài)。實驗均設置3組平行試驗。

1.5.3 細胞形態(tài)學分析 將鈦合金片置于24孔培養(yǎng)板中，消化細胞后，鋪于鈦合金片表面，接種密度為8 000個/ml。培養(yǎng)3 d后，PBS漂洗3次，2.5%戊二醛在4℃過夜。PBS漂洗3次，10 min/次，餓酸固定30 min，乙醇、叔丁醇梯度脫水：50%、70%、80%、90%依次脫水1次，10 min/次，100%脫水2次，10 min/次，臨界點干燥和噴金后，用場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察細胞在含氟納米二氧化鈦薄膜結構上的形態(tài)及突觸分布，評估細胞生長分化情況。實驗均設置3組平行試驗。

1.5.4 細胞黏附實驗 將鈦合金片置于24孔培養(yǎng)板中，消化細胞后鋪于鈦合金片表面，接種密度為2×104個/ml。培養(yǎng)30、60和120 min后，用PBS沖洗3遍后至新的培養(yǎng)板中，每孔加入50 μl的CCK-8溶液，再加入500 μl的新鮮培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，吸取100 μl反應液放入96孔板中，利用酶標儀在450 nm波長條件下檢測其吸光度A值。實驗均設置3組平行試驗。

1.5.5 細胞增殖實驗 將鈦合金片置于24孔培養(yǎng)板中，消化細胞后鋪于鈦合金片表面，接種密度為8 000個/ml。培養(yǎng)1、3和7 d后，用PBS沖洗3遍后至新的培養(yǎng)板中，每孔加入50 μl的CCK-8溶液，再加入500 μl的新鮮培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，吸取100 μl反應液放入96孔板中，利用酶標儀在450 nm波長條件下檢測其吸光度A值。實驗均設置3組平行試驗。

1.6 抗菌性能實驗

1.6.1 菌種活化 將冷凍保存的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌從超低溫冰箱中取出，快速恢復到室溫。在超凈工作臺內使用75%酒精棉球擦拭細菌凍存管表面，隨后將菌液倒入無菌瓊脂固體培養(yǎng)基中，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中復蘇24 h，用無菌的細菌接種環(huán)蘸取上述復蘇所得菌液在無菌瓊脂固體培養(yǎng)皿上按Z字形劃線，繼續(xù)將接種好的培養(yǎng)皿放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，可觀察到單個菌落形成，用封口膜密封后倒置放于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 菌液制備 用滅菌接種環(huán)挑取形態(tài)正常的單菌落置于相應液體培養(yǎng)基中，并放入恒溫搖床中，37℃，200 r/min搖菌過夜；以12 000 r/min離心過夜菌液5 min，小心棄上清液，用PBS緩沖液重懸細菌。利用酶標儀檢測菌液在600 nm處的吸光度A值，根據測得的A值估算菌液濃度，并用培養(yǎng)基稀釋數倍，將最終濃度調整為1×106CFU/ml（A600nm為1時，菌液濃度大概為1×109CFU/ml，以此按倍數稀釋）備用。

1.6.3 平板活菌計數實驗 將鈦合金片在紫外燈下滅菌24 h，分別取1 ml濃度為1×106CFU/ml的兩種菌液于24孔板，將鈦合金片用無菌鑷子加至24孔板，使其低于菌液液面，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)4 h，取出鈦合金片用無菌PBS沖洗掉表面浮菌。然后，將各組鈦合金片加入到含有5 ml無菌PBS的離心管中。渦旋振蕩儀震蕩5 min，使鈦合金片表面的細菌脫落到PBS溶液中，稀釋相同倍數后，各取10 μl菌懸液均勻涂布在瓊脂固體培養(yǎng)基平板上，在37℃條件下培養(yǎng)24 h，拍照記錄菌落數量，計算各組材料表面抑菌率。實驗均設置3組平行試驗。抑菌率由下述公式進行計算。抑菌率（%）=（對照組菌落數-實驗組菌落數）/對照組菌落數×100%。

1.6.4 活/死細菌染色實驗 將鈦合金片在紫外燈下滅菌24 h。分別取1 ml濃度為1×106CFU/ml的兩種菌懸液于24孔板中，將鈦合金片用無菌鑷子加至24孔板，使其低于菌懸液液面，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)4 h，無菌PBS沖洗掉表面浮菌。根據活/死細菌染色試劑盒操作說明書，在材料表面滴加SYTO 9綠色熒光核酸染料和碘化丙啶（propidium iodide,PI），避光孵育15 min，無菌水沖洗2次。然后制樣，在熒光倒置顯微鏡下觀察。實驗均設置3組平行試驗。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組鈦合金片的表征結果比較 掃描電鏡結果顯示，經酸蝕、水熱處理后的實驗組鈦合金片表面有納米二氧化鈦薄膜結構形成，見圖1。實驗組鈦合金片表面EDS能譜元素分析結果顯示，經過水熱處理后該層二氧化鈦薄膜含有氟元素，見表1。對照組鈦合金片表面接觸角為（94.8±7.4）°，實驗組表面接觸角為（30.6±9.1）°，這可能與實驗組鈦合金片表面納米薄膜片狀結構有關，增加了鈦合金片表面的比表面積和浸入空間。實驗組鈦合金片接觸角低于對照組，兩組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。而接觸角的大小與材料表面的親水性成反比，因此含氟納米二氧化鈦薄膜結構的SLM打印鈦合金片親水性顯著高于無表面處理的鈦合金片。

圖1 實驗組鈦合金片表面掃描電鏡觀察所見（×100 000）

表1 實驗組鈦合金表面EDS能譜元素分析

圖2 實驗組與對照組鈦合金片表面接觸角比較

2.2 成骨細胞活性實驗結果

2.2.1 DAPI和FITC phalloidin熒光染色后的兩組細胞黏附伸展形態(tài)比較 細胞熒光染色照片顯示，培養(yǎng)3 h后，在對照組鈦合金表面，細胞數量少，肌動蛋白未見明顯拉長，見圖3a（插頁）；在實驗組鈦合金表面，細胞數量較多，細胞鋪展面增加，肌動蛋白開始拉長，見圖3b（插頁）。培養(yǎng)6 h后，在對照組鈦合金表面，細胞數量增加，肌動蛋白更加清晰，見圖3c（插頁）；在實驗組鈦合金表面，細胞數量較多，細胞鋪展面增加，部分細胞成長梭形，肌動蛋白更加伸展，呈指狀突起，肌動蛋白纖維開始清晰，見圖3d（插頁）。

圖3 熒光倒置顯微鏡觀察兩組細胞熒光染色后的黏附伸展形態(tài)（a：對照組培養(yǎng)3 h后；b：實驗組培養(yǎng)3 h后；c：對照組培養(yǎng)6 h后；d：實驗組培養(yǎng)6 h后；×400）

2.2.2 兩組鈦合金片表面細胞形態(tài)學比較 掃描電鏡下觀察MC3T3-E1 Subclone 14細胞的黏附形態(tài)，培養(yǎng)3 d后，對照組細胞數量較少，伸展較差，細胞呈短梭形，偽足圓鈍且短，觸角較少；實驗組細胞數量較多，伸展較好，細胞呈長梭形，偽足細長，觸角較多，見圖4。

圖4 掃描電鏡觀察兩組鈦合金片表面細胞黏附伸展情況

2.2.3 兩組鈦合金片表面細胞黏附能力比較 細胞在鈦合金片表面培養(yǎng)30、60、120 min后，實驗組細胞黏附能力均高于對照組（均P＜0.05），見圖5。

圖5 兩組鈦合金片表面細胞黏附能力比較

2.2.4 兩組鈦合金片表面細胞增殖能力比較 培養(yǎng)3、7 d后，實驗組細胞增殖能力高于對照組（P＜0.05），培養(yǎng)1 d時兩組細胞增殖能力比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖6。

圖6 兩組鈦合金片表面細胞增殖能力比較

2.3 抗菌性能實驗結果

2.3.1 兩組鈦合金片對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌生長的影響比較 平板活菌計數實驗結果顯示，與對照組鈦合金片共培養(yǎng)4 h后的細菌在瓊脂固體培養(yǎng)基平板上生長旺盛，而與實驗組鈦合金片共培養(yǎng)可明顯抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長。經過細菌計數發(fā)現(xiàn)，實驗組鈦合金片對大腸桿菌抑菌率達61.20%，對金黃色葡萄球菌抑菌率達69.05%。實驗組大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌落數均低于對照組（均P＜0.05），見圖7（插頁）、表2。

圖7 兩組平板活菌計數實驗結果圖

表2 兩組鈦合金片表面細菌培養(yǎng)4 h后平板活菌計數比較（個）

2.3.2 兩組鈦合金片抗菌性能比較 利用活/死菌染色實驗進一步評價兩組鈦合金片表面的抗菌性能，SYTO 9能穿透活細菌和死細菌的細胞膜，顯現(xiàn)出綠色熒光，而PI只能穿透死細菌的細胞膜，顯現(xiàn)出紅色熒光。結果顯示，對照組鈦合金片表面有較多的綠色熒光，而在培養(yǎng)相同時間的實驗組鈦合金片表面有較多的紅色熒光，且金黃色葡萄球菌組差異較大腸桿菌組明顯，見圖8（插頁）。

圖8 熒光倒置顯微鏡觀察兩組鈦合金片活死菌染色后的情況（×100）

3 討論

良好的骨結合形成是種植牙成功的基礎[13]。種植體周圍骨結合的形成是一個多步驟的過程，它包括了成骨細胞在種植體材料表面的黏附、增殖、分化。其中成骨細胞的黏附既是種植體材料表面與成骨細胞反應的第一步，又是骨結合形成的首要環(huán)節(jié)，因此成骨細胞在材料表面的早期黏附是評價其生物相容性和生物活性的一個重要指標[14]。細胞的黏附與材料表面的親水性有密切關系，而親水性可以通過測量材料表面的與液體之間的接觸角來計算，材料與水之間的低接觸角表明水在材料表面的擴散良好，說明材料具有高親水性[15]。目前大部分學者認為成骨細胞更容易黏附在高親水性的材料表面。Toffoli等[16]認為熱處理改善了鈦表面成骨細胞的黏附的原因是熱處理提高了鈦表面的親水性，從而提高了纖維連接蛋白的黏附。

本實驗通過接觸角測量來評價具有含氟納米二氧化鈦薄膜結構的SLM打印鈦合金片與無表面處理的鈦合金片的親水性，再通過熒光染色、掃描電鏡觀察、細胞黏附實驗和細胞增殖實驗來評價成骨細胞在材料表面的黏附、增殖水平。

掃描電鏡觀察證實，前驅液浸泡和水熱法表面處理在鈦合金片表面成功制備了納米二氧化鈦薄膜結構。EDS能譜元素分析結構顯示，經過水熱處理后該層二氧化鈦薄膜含有氟元素。接觸角測量結果進一步提示，含氟納米二氧化鈦薄膜結構可以提高鈦合金片表面的親水性，與以往研究結果一致[17]，這可能與納米薄膜片狀結構增加了鈦合金片表面的比表面積和浸入空間有關。細胞黏附實驗結果顯示，在體外培養(yǎng)30、60、120 min后，成骨細胞在含氟納米二氧化鈦薄膜結構的鈦合金片表面的黏附均顯著高于無表面處理的鈦合金片表面。一方面，可能是因為含氟納米二氧化鈦薄膜結構的SLM打印鈦合金片具有較高的親水性。親水性的提高可以促進成骨細胞在鈦合金片表面的早期黏附[18]，與無表面處理的鈦合金片相比，含氟納米二氧化鈦薄膜結構的SLM打印鈦合金片具有更小的接觸角，即更好的親水性。另一方面，含氟納米二氧化鈦薄膜結構可能使得實驗組鈦合金片比無表面處理的鈦合金片具有更適合成骨細胞黏附的表面粗糙度，骨組織表面的粗糙度大約是32 nm，當種植體表面的粗糙度與骨組織表面相似，即達到納米級后，可以極大的提升成骨細胞在其表面的黏附能力，因為適宜的表面粗糙度有利于更多黏附相關蛋白的吸收，如纖維連接蛋白等[19-20]。

MC3T3-E1 Subclone 14細胞體外培養(yǎng)3、6 h的熒光染色結果顯示：與無表面處理的鈦合金片表面相比，含氟納米二氧化鈦薄膜結構的SLM打印鈦合金片表面成骨細胞黏附數量較多，細胞形態(tài)鋪展較好，肌動蛋白更加伸展，呈指狀突起，肌動蛋白纖維更加清晰。細胞體外培養(yǎng)3 d后的掃描電鏡觀察結果進一步證實：與無表面處理的鈦合金片表面相比，含氟納米二氧化鈦薄膜結構的SLM打印鈦合金片表面成骨細胞黏附形態(tài)鋪展較好，呈長梭形，偽足細長，觸角較多。細胞形態(tài)是細胞受不同材料表面影響的最直觀的表現(xiàn)形式，細胞骨架對細胞黏附、增殖、分化等生物學行為非常重要，清晰的細胞骨架網絡可能會使細胞黏附增強[21-22]。研究表明，成骨細胞在納米結構的鈦表面會伸出豐富的絲狀偽足，錨定在納米結構上，有利于細胞的黏附和增殖[23-24]。細胞黏附形態(tài)觀察的實驗結果與CCK-8法測得的細胞黏附實驗結果相一致，即含氟納米二氧化鈦薄膜結構可以促進MC3T3-E1 Subclone 14細胞的伸展，從而促進其在材料表面的黏附。

細胞增殖實驗結果顯示：從體外培養(yǎng)第3天開始，細胞在含氟納米二氧化鈦薄膜結構的鈦合金片表面的增殖能力顯著高于無表面處理的鈦合金片表面，而在第1天兩組鈦合金片表面成骨細胞的增殖能力無明顯差異。有研究結果表明，親水性以及粗糙的表面更適合成骨細胞的增殖[8,25]。培養(yǎng)1 d時兩組鈦合金片之間無明顯差異可能是由于細胞密度較低、作用時間較短，使得兩組鈦合金片表面成骨細胞的增殖無明顯差異。

種植體周圍炎形成的生物學原理是多種細菌附著在種植體表面形成細菌生物膜，導致種植體周圍感染并產生炎癥。同細胞的黏附一樣，細菌的黏附也是一個復雜的過程，它取決于許多因素，如細菌種類與特征、材料表面的化學成分、表面電荷、潤濕性和粗糙度等。眾多研究表明，納米二氧化鈦表面改性以及表面加載氟離子均可提高材料表面的抗菌性能。Lorenzetti等[26]用水熱處理法在鈦表面合成具有納米結構的二氧化鈦涂層，這種涂層可影響蛋白質吸附和促進骨再生，與無涂層的鈦表面相比，表面黏附的大腸桿菌減少了50%。Bhadra等[27]運用水熱法在鈦表面制備了模仿蜻蜓膜翅的納米線陣列結構，這種表面具有高表面自由能和親水性，與細菌接觸時會引起細菌胞膜的變形、破裂。該表面對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率分別為50%和20%。與無涂層材料相比，二氧化鈦涂層顯著促進了成骨細胞的黏附和增殖，并顯示出針對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌的抗菌效能。Arenas等[28]通過陽極氧化等方法在鈦表面制備了含氟二氧化鈦屏障，并通過與無氟的二氧化鈦樣品進行對照，結果表明氟的存在降低了細菌在其表面的黏附，氟是增強表面抗菌性能的關鍵。Yan等[29]在鈦上構建了多功能含氟鋯金屬有機框架薄膜結構（Zr-MOF），并證實由于氟離子的釋放，該結構對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均表現(xiàn)出良好的抗菌性能，且Zr-MOF的抗菌活性隨著氟化物含量的增加而提高。表面加載的氟離子釋放后可以抑制表面細菌的生長，在一定范圍內，氟的摻入量越高，抗菌能力越強[11]。

本實驗選用種植體周圍炎中最常見也最具代表性的革蘭陰性菌（大腸桿菌）和革蘭陽性菌（金黃色葡萄球菌），用平板活菌計數和活/死菌染色實驗來檢測SLM打印鈦合金片的抗菌性能。平板活菌計數結果顯示，與無表面處理的鈦合金片共培養(yǎng)4 h后的細菌在瓊脂固體培養(yǎng)基平板上生長旺盛，而與含氟納米二氧化鈦薄膜結構的鈦合金片共培養(yǎng)后大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長可被明顯抑制，材料表面表現(xiàn)出較強的抗菌能力。經過菌落計數發(fā)現(xiàn)，與含氟納米二氧化鈦薄膜結構的鈦合金片共培養(yǎng)后大腸桿菌抑菌率達61.20%，金黃色葡萄球菌抑菌率達69.05%?；钏谰旧珜嶒灲Y果顯示，無表面處理的鈦合金片表面有較多的綠色熒光和較少的紅色熒光，而在培養(yǎng)相同時間的含氟二氧化鈦納米薄膜的鈦合金片表面有較多的紅色熒光和較少的綠色熒光，且金黃色葡萄球菌組的差異較大腸桿菌組明顯，這與平板活菌計數實驗結果一致，含氟二氧化鈦納米薄膜結構具有一定的抗菌殺菌的作用。這與其表面二氧化鈦納米結構和加載的氟離子有密切關系。

盡管已有體內外結果顯示，與不含氟的鈦片表面相比，含氟的鈦片表面具有更高的成骨活性和抗菌性能[12,28-29]。但是本實驗沒有提供有關的數據表明氟離子的釋放可以在納米二氧化鈦薄膜提高鈦合金片生物活性和抗菌活性的基礎上進一步提高其生物活性和抗菌活性。后續(xù)會增加對照實驗，進一步明確該實驗中氟的作用，評價氟的釋放量與鈦合金片處理表面生物活性及抗菌活性的關系。

利用SLM 3D打印個性化種植體是目前種植體發(fā)展的重要方向，由于種植體表面結構對其骨結合性能有重要影響，因此利用表面處理技術在打印的鈦合金種植體表面構建一層含氟的納米二氧化鈦薄膜結構，有利于改善表面的親水性和表面的粗糙度，進而促進成骨細胞的黏附、增殖、分化。對照實驗表明，與無表面處理的鈦合金表面相比，含氟納米二氧化鈦薄膜結構可以促進成骨細胞在SLM打印鈦合金表面的黏附和增殖，較SLM 3D打印鈦合金片常規(guī)表面結構具有更好的生物相容性。同時，含氟納米二氧化鈦薄膜結構可以抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長，較SLM打印鈦合金片常規(guī)表面結構具有更好的抗菌性能。