周景和 徐慧芳 祝飛 賈明 李金晟

脂肪干細胞（adipose-derived stem cells,ADSC）有較強的增殖能力，且可以分化為多種不同的細胞系，如脂肪細胞、內皮細胞、成骨細胞及軟骨細胞等。利用ADSC分化的不確定性，臨床可在美容、整形及不同的軟組織缺損疾病中應用顆粒脂肪移植方法[1]。然而單純顆粒脂肪移植成活率并不理想。已有研究通過嘗試不同移植物注射方式，或應用不同添加成分來提高脂肪移植成活率[2-3]。川芎是一種藥用植物，其主要活性物質為生物堿類化合物川芎嗪，具有保護心腦血管系統(tǒng)、溶栓抗凝、抗氧化、改善微循環(huán)等多種藥理作用。臨床上川芎嗪主要被用于治療心腦血管、腎臟、消化系統(tǒng)等的有關疾病[4]?；诖?，本研究探討川芎嗪對ADSC體外增殖的影響，及川芎嗪不同添加方式對顆粒脂肪移植成活的影響，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要材料 6～8周齡，體重約20 g的BALB/c裸鼠12只（上海斯萊克實驗動物有限公司），ADSC（中科院上海細胞庫）。主要試劑：過氧化物酶體增殖物激活受 體 γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPAR-γ）和CCAAT增強結合蛋白α（CCAAT enhancer binding protein-α,C/EBP-α）引物由上海生工生物工程有限公司合成；MEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）、川芎嗪（無錫市第七制藥有限公司，批號：310701）、CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）、HE染液（珠海貝索生物技術有限公司）、油紅O染色液（武漢谷歌生物科技有限公司）、OCT包埋劑（美國Tissue-Tek公司）、水性封片劑（美國Vector Laboratories公司）、5x primeScript RT Master MIX（日本TAKARA公司）、Power SYBR Green PCR Master（美國Thermo公司）。主要儀器：酶標儀（瑞士TECAN公司，Infinite M100 PRO型）、熒光定量PCR儀（美國ABI公司，ViiA7型）、透射電子顯微鏡（日本Joel公司，JEM-1230型）、普通光學顯微鏡（日本Olympus公司，CKX 31型）、倒置熒光顯微鏡（意大利Optika公司，XDS-3FL4型）。脂肪組織為行腹部或大腿脂肪抽脂術的患者術后組織標本（經患者知情同意）。

1.2 方法

1.2.1 ADSC培養(yǎng) ADSC培養(yǎng)于含有10%FBS、1%雙抗體的MEM培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

1.2.2 ADSC分組及增殖能力檢測 因透明質酸（hyaluronic acid，HA）具有良好的生物相容性和幾乎無免疫原性，故使用HA作為移植ADSC的支架材料。將ADSC分組干預，分別為ADSC組、ADSC-HA組（0.2 ml ADSC+0.2 ml HA）、ADSC-HA+川芎嗪組（0.2 ml ADSC+0.2 ml HA+0.1 mg/ml川芎嗪）。將100 μl細胞懸液以5×103細胞/孔的密度接種于96孔板中，37℃、5% CO2條件下預培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育，分別于第1、3、5、7天，添加CCK-8溶液（10 μl/孔，加入時防止產生氣泡），孵育1.5 h后，于酶標儀上測定450 nm處的光密度（OD值），繪制細胞增殖曲線。

1.2.3 裸鼠皮下顆粒脂肪移植 用0.9%氯化鈉溶液清洗脂肪組織，清除細胞碎片及血細胞后，將其轉置到5 ml空注射器，加入0.9%氯化鈉注射液后靜置，使其分層，分層后上、中、下層分別為油脂、顆粒脂肪及沖洗液。隨后排出下層的沖洗液，沖洗（3～4次）后使用紗布過濾排除沖洗液和油脂，得到純化后的顆粒脂肪。將裸鼠按隨機數字表法分為4組，顆粒脂肪-HA+PBS組（200 μl PBS+顆粒脂肪+200 μl HA）、顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射組（200 μl PBS+顆粒脂肪+200 μl HA+術后川芎嗪注射）、顆粒脂肪-HA+川芎嗪浸泡組（200 μl 100 mg/L的川芎嗪+顆粒脂肪+200 μl HA）、顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射+浸泡組（200 μl 100 mg/L的川芎嗪+顆粒脂肪+200 μl HA+術后川芎嗪注射），各3只。使用1 ml注射器將各組混合物注射到裸鼠左右背部皮下，每點注射0.4 ml。術后川芎嗪注射是在皮下注射顆粒脂肪后，以2 mg/d的劑量注射川芎嗪，持續(xù)注射7 d。術后8周處死裸鼠解剖刮取出移植組織。

1.2.4 各組裸鼠顆粒脂肪移植組織冷凍切片制備 使用4%多聚甲醛固定組織，固定24 h后轉置15%的蔗糖溶液中，1 h后將組織樣本轉移到30%的蔗糖溶液中過夜。濾紙吸除多余的蔗糖溶液后，用OCT包埋，于4℃冰箱平衡30 min，使氣泡逸出，然后置于-80℃冰箱冷凍1h以上。冷凍組織于-18℃連續(xù)切片，厚度8μm。

1.2.5 各組裸鼠顆粒脂肪移植組織HE染色觀察 冷凍切片在37℃復溫30 min，蘇木精液染色30 s，使用流水反復沖洗之后加入1%的鹽酸溶液用于分色，沖洗后于伊紅液染色中染色60 s。將切片分別依次置于95%乙醇（30 s），95%乙醇（1 min），1∶1的二甲苯：無水乙醇混合液（3 min），二甲苯Ⅰ（5 min），二甲苯Ⅱ（5 min）對樣本脫水、透化處理。最后使用中性膠封閉切片，在光學顯微鏡下觀察。

1.2.6 各組裸鼠顆粒脂肪移植組織油紅O染色觀察冷凍切片在37℃復溫30 min，加入75%乙醇孵育10 s后避光情況下于油紅O染液中染色12 min。之后，將樣本置于75%乙醇分化，待背景至無色之后使用蒸餾水清洗漂洗2 min，然后于蘇木精中復染30 s。洗滌后，將其置于1%鹽酸溶液中分化3 s，反復沖洗后使用水性封片劑進行封片處理，在倒置顯微鏡下觀察。

1.2.7 各組裸鼠顆粒脂肪移植組織脂肪形成相關的轉錄因子PPAR-γ、C/EBP-α mRNA表達水平檢測 采用熒光定量PCR法。用Trizol試劑提取組織總RNA后，于酶標儀檢測RNA濃度和質量。使用5x prime-Script RT Master MIX先合成第一鏈cDNA，之后以Power SYBR Green PCR Master進行實時PCR擴增，熱循環(huán)條件為50℃ 3 min，95℃ 3 min，95℃ 10 s，60℃30 s進行40個循環(huán)；溶解曲線分析（60～95℃，每10 s增加0.5℃），引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.8 各組裸鼠顆粒脂肪移植組織HA殘留情況檢測 各組移植組織PBS洗滌后，于4℃下加入1%鋨酸溶液固定樣本，固定2 h后使用PBS清洗，之后依次在50%、70%、80%、90%乙醇梯度中對樣本進行脫水處理（各梯度靜置15 min），之后置于70%的乙醇中過夜。使用100%乙醇對樣本再次進行脫水處理（20 min/次）。使用丙酮進行2次置換（15 min/次），然后依次于2∶1、1∶1和1∶2體積比的丙酮∶包埋劑混合物中分別浸漬1、4及4 h。之后使用純包埋劑再次進行2次浸漬處理（每次18 h以上）。然后對包埋的樣本65℃條件下聚合，持續(xù)48 h。包埋樣本修成表面積＜0.2 mm×0.2 mm的梯形，以70 nm的厚度制備超薄切片。依次于醋酸鈾酰和醋酸鉛中分別染色10 min，沖洗后，于透射電子顯微鏡下觀察組織HA殘留情況。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組ADSC增殖能力檢測 培養(yǎng)至第1、3、5天時，ADSC組、ADSC-HA組、ADSC-HA+川芎嗪組增殖能力比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），第7天時，ADSC-HA+川芎嗪組增殖能力較ADSC組、ADSCHA組增強（均P＜0.05），而ADSC組、ADSC-HA組增殖能力比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明川芎嗪可促進ADSC體外增殖。各組ADSC增殖曲線見圖1。

圖1 各組ADSC增殖曲線

2.2 各組裸鼠皮下顆粒脂肪移植物大體情況比較裸鼠皮下顆粒脂肪移植8周后，各組小鼠的皮膚下都有突起，推測為脂肪塊；解剖后，可觀察到皮下黃色脂肪組織，見圖2（插頁）。刮取黃色脂肪組織稱重，與顆粒脂肪-HA+PBS組相比，顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射組和顆粒脂肪-HA+川芎嗪浸泡組裸鼠皮下顆粒脂肪移植物重量較重（均P＜0.05）。且顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射+浸泡組裸鼠皮下顆粒脂肪移植物重量較顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射組、顆粒脂肪-HA+川芎嗪浸泡組更重（均P＜0.05），而顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射組與顆粒脂肪-HA+川芎嗪浸泡組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

圖2 各組裸鼠皮下顆粒脂肪移植物大體外觀（a：移植8周后各組裸鼠的外觀；b：顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射組裸鼠解剖后皮下顆粒脂肪移植物組織）

表2 各組裸鼠皮下顆粒脂肪移植物重量比較

2.3 各組裸鼠皮下顆粒脂肪移植物組織學比較 HE和油紅O染色結果顯示，顆粒脂肪-HA+PBS組移植物結締組織較多，脂肪組織較少；顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射組脂肪細胞增多，大小不一；顆粒脂肪-HA+川芎嗪浸泡組結締組織較多，脂肪細胞零散分布；顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射+浸泡組脂肪細胞明顯增多，排列緊密。結果表明，皮下的黃色組織確實是脂肪組織。即注射顆粒脂肪可以在裸鼠皮下形成脂肪組織，注射或浸泡川芎嗪對顆粒脂肪的生長影響不大，同時進行兩種方式給藥能促進脂肪細胞形成。見圖3（插頁）。

圖3 各組裸鼠皮下顆粒脂肪移植物組織學染色結果比較（a：HE染色，×200；b：油紅O染色，×400）

2.4 各組裸鼠顆粒脂肪移植組織PPAR-γ、C/EBP-α mRNA表達水平比較 與顆粒脂肪-HA+PBS組相比，顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射組、顆粒脂肪-HA+川芎嗪浸泡組、顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射+浸泡組裸鼠顆粒脂肪移植組織PPAR-γ、C/EBP-α mRNA表達水平均升高（均P＜0.05），且顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射+浸泡組高于顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射組、顆粒脂肪-HA+川芎嗪浸泡組（均P＜0.05），見圖4。

圖4 各組裸鼠顆粒脂肪移植組織PPAR-γ、C/EBP-α mRNA表達水平比較

2.5 顆粒脂肪-HA+PBS組和顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射+浸泡組裸鼠顆粒脂肪移植組織HA殘留情況比較 顆粒脂肪-HA+PBS組和顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射+浸泡組裸鼠顆粒脂肪移植組織切片進行透射電子顯微鏡下掃描均未檢測到HA殘留，即HA已經完全降解，見圖5。

圖5 各組裸鼠顆粒脂肪移植組織HA殘留情況透射電子顯微鏡下觀察所見

3 討論

研究發(fā)現，單純顆粒脂肪移植后只有50%～60%的存活率，移植后高脂肪組織吸收率以及可能的囊腫和鈣化等并發(fā)癥限制了臨床上自體脂肪移植的廣泛應用[5]。學者們試圖通過調整脂肪供區(qū)選擇，改進脂肪獲取、純化方法以及脂肪注射方式，在移植物中添加不同成分（如血管生長因子、富血小板血漿、藥物成分等）多種方法來提高移植脂肪的存活率[6-7]。黃偉光等[8]發(fā)現自體顆粒脂肪移植時添加富血小板血漿能夠極大地提高移植脂肪的存活率，增加隆乳患者胸圍及乳房皮下脂肪厚度，并且顯著減少術后并發(fā)癥的發(fā)生。隨著對脂肪移植研究的不斷深入，研究人員就提升脂肪移植物成活率已達成共識，即移植早期建立移植物的血管系統(tǒng)是提升脂肪移植物存活的關鍵。

脂肪組織的血液供應豐富，因為各細胞均具備其單獨的血供系統(tǒng)且與主干相連，保證了每個細胞的營養(yǎng)供應。顆粒脂肪移植初期，移植物還沒有與受區(qū)建立良好的血液供應關系，因缺乏有效血供而導致移植物處于缺氧缺血狀態(tài)，只能從移植體周圍組織液中獲取營養(yǎng)及氧，直至后期形成內部血管化并建立自己的血管系統(tǒng)[9]。這提示脂肪組織新生與血運重建對脂肪移植體存活的重要性。

川芎嗪是川芎的主要活性成分，具有抗血小板聚集、擴張小動脈，活血通脈，改善微循環(huán)的功效[10]。研究證實，川芎嗪可降低兔心肌梗死再灌注后心肌無復流面積和心肌梗死面積[11]，且可通過促進血運重建減輕心肌缺血再灌注損傷[12]。何莉等[13]研究發(fā)現，川芎嗪能夠促進骨髓移植小鼠骨髓造血細胞的恢復，改善骨髓微環(huán)境，促進骨髓造血重建。陳方等[14]基于兔股骨頭壞死模型的研究證實，注射川芎嗪能夠促進股骨頭血管的增生和重建。這些發(fā)現提示川芎嗪對血運重建有積極的促進作用。在本研究中，川芎嗪處理顯著促進了ADSC的體外增殖。體內實驗表明添加川芎嗪可促進注射的顆粒脂肪存活，并在裸鼠皮下形成脂肪組織。組織學染色結果中，顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射組，脂肪細胞增多，大小不一；顆粒脂肪-HA+川芎嗪浸泡組結締組織較多，脂肪細胞零散分布；顆粒脂肪-HA+川芎嗪注射+浸泡組，脂肪細胞明顯增多，排列緊密。這些結果提示單純注射或浸泡川芎嗪對移植脂肪的生長影響差異不大，同時進行兩種方式給藥更能促進脂肪細胞形成。

作為脂肪形成關鍵的轉錄因子，PPAR-γ和C/EBP-α參與了脂肪形成的級聯調控，并在成脂分化中發(fā)揮關鍵作用，PPAR-γ作為核受體被脂類激活，誘導脂類相關基因的表達[15]。PPAR的α、δ和γ 3種同型在控制脂質儲存和動員、糖代謝、形態(tài)發(fā)生和炎癥反應中起關鍵作用的基因表達中起綜合作用。對PPAR-γ的研究發(fā)現，其作為脂肪細胞主導轉錄因子促進脂肪酸在脂肪沉積中存儲，并調節(jié)脂肪細胞分泌激素的表達[16]。研究發(fā)現，PPAR-γ在間充質干細胞成脂分化中發(fā)揮重要的調控作用[17]。C/EBP-α作為關鍵的脂肪形成轉錄因子，在脂肪源性干細胞的成脂分化中發(fā)揮重要作用[18]。本研究發(fā)現川芎嗪促進脂肪形成相關的轉錄因子PPAR-γ和C/EBP-α的表達，提示川芎嗪促進脂肪形成相關基因的表達進而促進脂肪細胞形成。

綜上所述，川芎嗪可促進注射的顆粒脂肪存活，并通過促進脂肪形成相關轉錄因子PPAR-γ和C/EBP-α的表達進而促進脂肪細胞形成。單純注射或浸泡川芎嗪兩種方式對移植脂肪的生長影響差異不大，同時進行兩種方式給藥干預更能促進脂肪細胞形成。