陳維楊，郝躍東，王守國(guó)，季峰

長(zhǎng)期或持續(xù)使用地塞米松（dexamethasone,Dex）可對(duì)人成骨細(xì)胞產(chǎn)生直接的細(xì)胞毒性，是人類骨質(zhì)疏松甚至骨壞死的主要因素之一，了解Dex誘導(dǎo)成骨細(xì)胞損傷的病理機(jī)制有助于制定新的干預(yù)策略[1-4]。早期研究表明，激活腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase,AMPK）級(jí)聯(lián)反應(yīng)可以使細(xì)胞在應(yīng)激條件下存活[5]。AMPK誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制不同，活化的AMPK能夠通過(guò)抑制消耗并促進(jìn)合成來(lái)增加煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）的含量，從而保護(hù)人體細(xì)胞免受氧化損傷[6]。此外，AMPK 可以激活其下游核因子E2 相關(guān)因子2（NFE2-related factor 2,Nrf2）在不同細(xì)胞中的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并抑制活性氧（reactive oxygen species,ROS）的積累和氧化損傷[4,7-9]。

微小核糖核酸（microRNA,miRNA）是保守的小非編碼RNA（non-coding RNA,ncRNA），長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸。miRNA 能夠通過(guò)與靶向miRNA 的3'非翻譯區(qū)（3′-untranslated region,3'-UTR）結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而導(dǎo)致靶向miRNA翻譯抑制或降解[10,11]。改變miRNA 可以激活A(yù)MPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)，從而保護(hù)成骨細(xì)胞免受Dex 的侵害。miRNA-429 誘導(dǎo)的蛋白磷酸酶2A 催化亞基（AMPK 的磷酸酶）沉默激活了AMPK并保護(hù)成骨細(xì)胞免受Dex的侵害[2]。此外，miR-1256使Ppm1e 沉默，激活A(yù)MPK，從而起到對(duì)Dex 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞保護(hù)作用[12]。

鈣結(jié)合蛋白39（calcium binding protein,CAB39）是三聚體LKB1-STRAD-CAB39蛋白復(fù)合物的關(guān)鍵成分，該復(fù)合物對(duì)于STRAD 穩(wěn)定和LKB1 激活（一個(gè)AMPK 激酶）是必不可少的[13]。LKB1-STRADCAB39結(jié)合能夠促進(jìn)LKB1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，使Thr-172處的AMPKα1磷酸化[13]。沉默靶向CAB39的miRNA（miRNA-451）能夠誘導(dǎo)CAB39 積累并激活下游的AMPK[13-15]。miRNA-1256作為一種新型的CAB39靶向miRNA，相反，抑制miRNA-1256可誘導(dǎo)CAB39 上調(diào)和AMPK 信號(hào)激活，從而為Dex 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞提供顯著的細(xì)胞保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 試劑、化學(xué)藥品和抗體

Dex（Sigma-Aldrich，密蘇里州圣路易斯），F(xiàn)BS、DMEM 和其他細(xì)胞培養(yǎng)試劑（Gibco，馬薩諸塞州沃爾瑟姆），抗體（Cell Signaling Tech，中國(guó)北京），所有序列、病毒構(gòu)建體、引物和質(zhì)粒（上?；蚧瘜W(xué)有限公司，中國(guó)上海）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

hFOB1.19成骨細(xì)胞和原代人成骨細(xì)胞被分化和培養(yǎng)[16,17]。本實(shí)驗(yàn)方案已獲得南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR,qPCR）

提取總細(xì)胞RNA，并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。使用描述的方案進(jìn)行qPCR。

1.4 異位miR-1256過(guò)表達(dá)或抑制

將編碼miR-1256前體（premiR-1256）或miR-1256反義（antagomiR-1256）的序列亞克隆到GV-369慢病毒構(gòu)建體中，然后將構(gòu)建體與慢病毒包膜蛋白（psPAX2 和pMD2.G）一起轉(zhuǎn)染到HEK-293T 細(xì)胞中，濃縮培養(yǎng)上清液中的病毒lv-premiR-1256 和lv-antagomiR-1256。用慢病毒處理hFOB1.19細(xì)胞或人成骨細(xì)胞，對(duì)穩(wěn)定的細(xì)胞進(jìn)行嘌呤霉素篩選10～12 d，通過(guò)qPCR測(cè)試穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中成熟miR-1256的表達(dá)，對(duì)照細(xì)胞用miRNA 對(duì)照慢病毒（“miR-C”）或miRNA反義對(duì)照慢病毒（“antaC”）轉(zhuǎn)染[2,7]。

1.5 RNA下拉

首先用生物素化的miR-1256模擬物或?qū)φ漳M物轉(zhuǎn)染hFOB1.19細(xì)胞24 h，然后將細(xì)胞裂解物與抗生蛋白鏈菌素包被的磁珠一起孵育（使用Pierce Magnetic RNA下拉試劑盒[18,19]）以下拉生物素捕獲的RNA復(fù)合物[18]，并通過(guò)qPCR檢測(cè)與miR-1256結(jié)合的CAB39 mRNA，最后將其水平歸一化為“輸入”對(duì)照。

1.6 CAB39 3'-UTR熒光素酶報(bào)告基因活性測(cè)定

早期描述了包含CAB39 3'-UTR 的pGL4.13（luc2/SV40）構(gòu)建[7]。通過(guò)脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺3000 與海腎熒光素酶載體和pRL-SV40 將構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到hFOB1.19細(xì)胞，然后對(duì)hFOB1.19細(xì)胞進(jìn)行所應(yīng)用的遺傳修飾，通過(guò)Promega試劑盒檢查CAB39 3'-UTR熒光素酶報(bào)告基因的活性[20]。

1.7 細(xì)胞功能和蛋白質(zhì)測(cè)定

細(xì)胞功能研究，包括通過(guò)Cell Counting Kit-8（CCK-8）進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行細(xì)胞死亡檢測(cè)及細(xì)胞凋亡檢測(cè)，包括單鏈DNA（ssDNA）ELISA、核TUNEL 染色和caspase-3/-9 活性測(cè)定、NADPH活性測(cè)定[21,22]、Western blot法檢測(cè)、JC-1線粒體去極化測(cè)定[2,7]。

1.8 miR模擬物的轉(zhuǎn)染

將hFOB1.19細(xì)胞以50%融合度接種到六孔板中，然后用Lipofectamine 3000用500 nmol/L的miR-1256模擬物（野生型和突變體）轉(zhuǎn)染48 h。

1.9 AMPKα1短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA,shRNA）

向培養(yǎng)的hFOB1.19細(xì)胞中加入AMPKα1 shRNA慢病毒顆粒[2]，然后加入嘌呤霉素以選擇穩(wěn)定的細(xì)胞，Western blot法檢測(cè)到穩(wěn)定細(xì)胞中AMPKα1的敲除。

1.10 AMPKα1突變

先前的報(bào)道中所描述的顯性負(fù)性AMPKα1（dn-AMPK-α1,T172A）構(gòu)建體[1,2]轉(zhuǎn)染至hFOB1.19細(xì)胞，通過(guò)嘌呤霉素（1μg/ml）篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞。

1.11 ROS測(cè)定

將細(xì)胞接種到六孔板，細(xì)胞用5μmol/L CellROX染色30 min，使用全自動(dòng)熒光化學(xué)發(fā)光分析儀測(cè)試CellROX紅色熒光強(qiáng)度。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析[2,7]。

2 結(jié)果

2.1 miR-1256使人成骨細(xì)胞中的CAB39沉默并抑制AMPK級(jí)聯(lián)激活

TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，miR-1256 可能在位置2265-2272（圖1A）上靶向CAB39 3'-UTR，來(lái)自數(shù)據(jù)庫(kù)的上下文分?jǐn)?shù)百分比為98%，context++分?jǐn)?shù)為-0.43，表明兩者之間直接結(jié)合的百分比很高（圖1A）。對(duì)miR-1256亞細(xì)胞分布的qPCR分析表明，約90%的內(nèi)源性miR-1256位于hFOB1.19人成骨細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中（圖1B），細(xì)胞核中只有約10%（圖1B）。RNA下拉測(cè)定結(jié)果（圖1C）證實(shí)，生物素化的miR-1256可以直接與hFOB1.19細(xì)胞中的CAB39 mRNA結(jié)合（圖1C）。

為了檢測(cè)miR-1256是否可以影響CAB39表達(dá)，建立了編碼miR-1256前體序列（lv-premiR-1256）的慢病毒構(gòu)建體，并將其轉(zhuǎn)導(dǎo)至hFOB1.19細(xì)胞，然后在含嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，并建立了兩個(gè)穩(wěn)定的細(xì)胞系lv-premiR-1256-L1 和lv-premiR-1256-L2。在表達(dá)lv-premiR-1256的穩(wěn)定hFOB1.19細(xì)胞中，成熟的miR-1256水平增加了15～20倍（圖1D）。值得注意的是，miR-1256 的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致hFOB1.19 細(xì)胞中CAB39 3'-UTR 熒光素酶報(bào)告基因活性急劇降低（圖1E）。此外，CAB39 mRNA 水平大幅降低（圖1F），CAB39蛋白表達(dá)在lv-premiR-1256表達(dá)的hFOB1.19細(xì)胞中也下調(diào)（圖1G）。Western blot 結(jié)果顯示，AMPKα1（Thr-172）及其下游ACC（Ser-79）的磷酸化也降低了；總AMPKα1 和ACC 的表達(dá)未改變（圖1H）。miR-1256過(guò)表達(dá)后，hFOB1.19細(xì)胞中的AMPK活性也降低（圖1I）。因此，miR-1256 過(guò)表達(dá)使hFOB1.19細(xì)胞中的CAB39沉默并抑制AMPK信號(hào)激活。

為了確認(rèn)miR-1256 對(duì)CAB39 mRNA 的直接作用，生成了兩個(gè)突變miR-1256模擬物，序列在圖1J中列出。這兩個(gè)突變體（即“mu1”和“mu2”），在與CAB39 3'-UTR的結(jié)合位點(diǎn)處具有突變（圖1J）。將野生型（WT）和突變體分別轉(zhuǎn)染至hFOB1.19細(xì)胞，結(jié)果顯示只有WT miR-1256模擬物抑制CAB39 3'-UTR熒光素酶報(bào)告基因活性（圖1K）和mRNA 表達(dá)（圖1L）。這兩個(gè)突變體完全無(wú)效（圖1K、1L）。

在人成骨細(xì)胞中，lv-premiR-1256 感染同樣可以誘導(dǎo)成熟的miR-1256 過(guò)表達(dá)（圖1M）。結(jié)果顯示，CAB39 3'-UTR 熒光素酶報(bào)告基因活性（圖1N）和mRNA 表達(dá)（圖1O）顯著下調(diào)。miR-1256 過(guò)表達(dá)下調(diào)了CAB39 蛋白表達(dá)（圖1P）和AMPKα1-ACC 磷酸化（圖1Q）。這些結(jié)果表明，miR-1256直接沉默人成骨細(xì)胞中的CAB39并抑制AMPK活化。

圖1 miR-1256使人成骨細(xì)胞中的CAB39沉默并抑制AMPK級(jí)聯(lián)激活

2.2 抑制miR-1256誘導(dǎo)人成骨細(xì)胞中CAB39升高和AMPK級(jí)聯(lián)激活

根據(jù)圖1的結(jié)果，假設(shè)miR-1256抑制能夠誘導(dǎo)人成骨細(xì)胞中CAB39升高和AMPK信號(hào)激活。為了檢驗(yàn)該假設(shè)建立編碼miR-1256反義序列的慢病毒構(gòu)建體或lv-antagomiR-1256，并將其轉(zhuǎn)導(dǎo)至hFOB1.19成骨細(xì)胞。按照嘌呤霉素選擇程序，建立兩個(gè)穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞系lv-antagomiR-1256-L1 和lv-antagomiR-1256-L2。如圖2 所示，與“antaC”對(duì)照組的細(xì)胞相比，在表達(dá)lv-antagomiR-1256 的穩(wěn)轉(zhuǎn)hFOB1.19 細(xì)胞中成熟miR-1256表達(dá)顯著降低（圖2A）。相反，CAB39 3'-UTR熒光素酶報(bào)告基因活性（圖2B）和mRNA表達(dá)（圖2C）得到增強(qiáng)。此外，CAB39 蛋白在miR-1256 抑制的hFOB1.19細(xì)胞中升高（圖2D）。重要的是，miR-1256抑制后，AMPKα1-ACC磷酸化（圖2E）和AMPK活性（圖2F）顯著增加。

在人成骨細(xì)胞中，用lv-antagomiR-1256轉(zhuǎn)染可顯著抑制miR-1256（圖2G），導(dǎo)致CAB39 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)（圖2H、2I）以及AMPKα1-ACC 磷酸化和AMPK活性增加（圖2J、2K）。結(jié)果表明，miR-1256抑制可誘導(dǎo)人成骨細(xì)胞中CAB39升高和AMPK級(jí)聯(lián)激活。

圖2 miR-1256抑制誘導(dǎo)人成骨細(xì)胞中CAB39升高和AMPK級(jí)聯(lián)激活

2.3 miR-1256 抑制可保護(hù)人成骨細(xì)胞免受Dex 誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡的影響

由于miR-1256抑制可誘導(dǎo)CAB39升高和AMPK級(jí)聯(lián)激活，檢測(cè)其潛在的對(duì)成骨細(xì)胞的保護(hù)作用。-在“antaC”對(duì)照組的hFOB1.19細(xì)胞中，通過(guò)CCK-8分析及臺(tái)盼藍(lán)染色法發(fā)現(xiàn)Dex（1 μmol/L，48 h）處理誘導(dǎo)了細(xì)胞活性的顯著降低（圖3A）和細(xì)胞死亡（圖3B），而在lv-antagomiR-1256表達(dá)的hFOB1.19細(xì)胞中細(xì)胞毒性有明顯減輕（圖3A、3B）。結(jié)果表明，miR-1256抑制減弱了hFOB1.19細(xì)胞中Dex誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。

此外，在“antaC”對(duì)照組的OB-6細(xì)胞中，加入Dex干預(yù)可以發(fā)生明顯的細(xì)胞凋亡：caspase-3/caspase-9活性升高（圖3C、3D），TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞核比例升高（圖3E）。值得注意的是，在lv-antagomiR-1256 轉(zhuǎn)染的hFOB1.19 細(xì)胞中Dex 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有所減少（圖3C～3E）。在原代人成骨細(xì)胞中可以獲得相似的結(jié)果，其中l(wèi)v-antagomiR-1256 組改善了Dex 對(duì)于細(xì)胞活性的抑制（圖3F）并降低了細(xì)胞死亡（圖3G）。此外，在lv-antagomiR-1256 組中，caspase-3/-9 活性（圖3H、3I）和TUNEL 陽(yáng)性核比（圖3J）均比“antaC”組降低，表示Dex誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡也受到抑制。miR-1256抑制作用保護(hù)了人成骨細(xì)胞免受Dex 誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡的影響

圖3 miR-1256抑制作用可保護(hù)人類成骨細(xì)胞免受Dex誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡的影響

2.4 miR-1256 抑制可減輕Dex 誘導(dǎo)的人成骨細(xì)胞氧化損傷

通過(guò)激活A(yù)MPK清除ROS可以保護(hù)成骨細(xì)胞免受Dex誘導(dǎo)的氧化損傷的影響。本研究結(jié)果顯示，在表達(dá)lv-antagomiR-1256 的hFOB1.19 成骨細(xì)胞中，NADPH 活性顯著提高（圖4A）。此外，在miR-1256抑制后誘導(dǎo)了Nrf2 級(jí)聯(lián)基因的mRNA 表達(dá)，包括HO1，NQO1和GCLC[4,7,23]（圖4B）。

通過(guò)使用CellROX染料分析，發(fā)現(xiàn)Dex處理增加了“antaC”組hFOB1.19細(xì)胞的細(xì)胞ROS含量（CellROX熒光）（圖4C、4D）。此外，通過(guò)增強(qiáng)的TBAR 活性測(cè)試，在Dex 處理的對(duì)照hFOB1.19 細(xì)胞中檢測(cè)到明顯的脂質(zhì)過(guò)氧化作用（圖4E）。為了進(jìn)一步確認(rèn)氧化損傷，在hFOB1.19細(xì)胞中進(jìn)行了Dex處理后，檢測(cè)到了明顯的線粒體去極化作用（圖4F、4G）。線粒體去極化已通過(guò)JC-1 綠色單體積累進(jìn)行了檢測(cè)（圖4F、4G）。另外，Dex處理在對(duì)照hFOB1.19成骨細(xì)胞中誘導(dǎo)了顯著的DNA 斷裂（ssDNA 積累）（圖4H）。重要的是，lv-antagomiR-1256 對(duì)miR-1256 的抑制作用減弱了hFOB1.19 成骨細(xì)胞中Dex 誘導(dǎo)的氧化損傷（圖4C～4H）。在表達(dá)lv-antagomiR-1256 的hFOB1.19 細(xì)胞中，Dex 誘導(dǎo)的ROS 產(chǎn)生（圖4C、4D），脂質(zhì)過(guò)氧化（圖4E），線粒體去極化（圖4F、4G）和ssDNA 的積累（圖4H）被極大抑制。

在原代人成骨細(xì)胞中，lv-antagomiR-1256誘導(dǎo)的miR-1256抑制作用類似地減弱了Dex誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生（圖4I、4J）和線粒體去極化（圖4K、4L）。這些結(jié)果表明，miR-1256 抑制可減輕Dex 誘導(dǎo)的人成骨細(xì)胞氧化損傷。

圖4 miR-1256抑制作用減輕了Dex誘導(dǎo)的人類成骨細(xì)胞的氧化損傷

3 討論

Fan 等[12]的研究表明，miRNA-135b 誘導(dǎo)蛋白磷酸酶1E（protein phosphatase,Mg2+/Mn2+dependent 1E,PPM1E）沉默，可激活A(yù)MPK 信號(hào)傳導(dǎo)并發(fā)揮對(duì)Dex 的成骨細(xì)胞保護(hù)作用。較長(zhǎng)的非編碼RNA MALAT1 使PPM1E 沉默并激活A(yù)MPK 級(jí)聯(lián)，從而為成骨細(xì)胞提供細(xì)胞保護(hù)作用[23]。先前的研究已經(jīng)表明，miR-429 使PP2A（PP2A-c）的催化亞基沉默并激活了AMPK信號(hào)傳導(dǎo)，miR-429過(guò)表達(dá)的成骨細(xì)胞免受Dex 誘導(dǎo)的氧化損傷和細(xì)胞死亡的影響[2]。抑制miR-107激活A(yù)MPK依賴性Nrf2信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而抑制Dex誘導(dǎo)的hFOB1.19細(xì)胞和人成骨細(xì)胞的氧化損傷和細(xì)胞凋亡[7]。

研究發(fā)現(xiàn)miR-1256是人成骨細(xì)胞中靶向CAB39的新型miRNA。miR-1256 主要位于hFOB1.19 成骨細(xì)胞的胞漿中，并與CAB39 mRNA 直接相關(guān)。在hFOB1.19 成骨細(xì)胞和人成骨細(xì)胞中，異位miR-1256過(guò)表達(dá)后，CAB39 3'-UTR熒光素酶報(bào)告基因的活性以及CAB39 mRNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)顯著降低，但抑制miR-1256 能夠使上述分子的活性或表達(dá)作用增強(qiáng)。重要的是，兩個(gè)突變體miR-1256 模擬物在與CAB39 3'-UTR 的結(jié)合位點(diǎn)處含有突變，未能抑制hFOB1.19細(xì)胞中CAB39 3'-UTR 熒光素酶報(bào)告基因的活性和mRNA表達(dá)。因此，miR-1256直接與人成骨細(xì)胞中的CAB39結(jié)合并使其沉默。在hFOB1.19細(xì)胞和人成骨細(xì)胞中，lv-antagomiR-1256對(duì)miR-1256的抑制作用很大程度上抑制了Dex誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和細(xì)胞凋亡。

先前研究表明，化合物991（苯并咪唑衍生物的小分子AMPK激活劑）可以抑制Dex誘導(dǎo)的MC3T3-E1成骨細(xì)胞和原代鼠成骨細(xì)胞的氧化損傷[4]?；衔?91 對(duì)AMPK 的激活增強(qiáng)了NADPH 的活性，并激活了Nrf2信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制Dex誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞氧化損傷[4]。同樣，由α1 選擇性激活劑化合物13 進(jìn)行的AMPK 激活在很大程度上抑制了Dex 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡[1]。C13 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的細(xì)胞保護(hù)作用與AMPK依賴的NADPH產(chǎn)生和ROS清除有關(guān)[1]。

lv-antagomiR-1256 誘導(dǎo)的miR-1256 抑制作用增加了NADPH 活性并誘導(dǎo)了Nrf2 級(jí)聯(lián)基因的表達(dá)，從而抑制了Dex 誘導(dǎo)的hFOB1.19 細(xì)胞和人成骨細(xì)胞的氧化損傷。另外，在lv-antagomiR-1256 轉(zhuǎn)染的hFOB1.19 細(xì)胞和人成骨細(xì)胞中，均可看到在miR-1256 被抑制后，CAB39 基因及蛋白表達(dá)上調(diào)及AMPKα1-ACC 磷酸化和AMPK 活性增加。因此，抑制miR-1256 可能是通過(guò)激活CAB39-AMPK 信號(hào)通路，發(fā)生ROS 清除和氧化應(yīng)激抑制，從而起到對(duì)Dex誘導(dǎo)的成骨損傷的保護(hù)作用。對(duì)于Dex 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞保護(hù)的機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

miR-1256抑制可以保護(hù)成骨細(xì)胞免受Dex誘導(dǎo)的氧化損傷，其機(jī)制可能與激活CAB39-AMPK 信號(hào)通路有關(guān)。本研究為治療Dex 所致的成骨損傷相關(guān)疾病提供了治療的新方向，為今后的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

【利益沖突】所有作者均聲明不存在利益沖突