吳名草，郁 星，沈旭丹，蔣文浩，錢 和

（1. 江陰天江藥業(yè)有限公司，江蘇 無錫 214429；2. 江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

酒精性肝損傷是一種常見的肝臟疾病，表現(xiàn)為脂肪肝、酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化等，嚴(yán)重時甚至惡化為肝功能衰竭、肝癌[1]。隨著人們生活水平的提升，酒產(chǎn)業(yè)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展以及嗜酒人群的增加，由酒精引起的肝臟疾病的發(fā)病率日益增加，嚴(yán)重危害人體健康。研究發(fā)現(xiàn)，酒精性肝損傷主要是由于酒精在代謝過程中會通過多種途徑產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），使抗氧化酶活性降低，脂質(zhì)過氧化作用增加，從而破壞機(jī)體氧化還原平衡和線粒體功能，誘發(fā)氧化應(yīng)激及脂質(zhì)代謝紊亂，最后導(dǎo)致肝損傷[2]。早期臨床上治療酒精性肝損傷的措施主要有戒酒、營養(yǎng)支持、藥物輔助治療等，但長期服用藥物會產(chǎn)生一些不良反應(yīng)，因此研制效果好、低毒副作用的解酒護(hù)肝產(chǎn)品具備廣闊的市場前景。

研究表明葛根[3-5]、枳椇子[6-7]等藥食同源物質(zhì)對酒精性肝損傷有一定的保護(hù)作用。葛根是豆科植物野葛的干燥根，主要有效成分為黃酮類化合物和皂苷，有發(fā)表解肌退熱、升陽止泄、生津止渴的作用，能使肝臟乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的活性提高，從而清除酒精及其代謝物，具有解酒護(hù)肝的功能[3-6]。枳椇子的主要有效成分為黃酮類化合物，有抗脂質(zhì)過氧化的功效，可減輕肝臟內(nèi)炎性細(xì)胞的浸潤程度[7-8]。較多研究表明，葛根和枳椇子具有協(xié)同解酒作用[9-10]。其機(jī)制可能是通過穩(wěn)定乙醇代謝途徑，加快機(jī)體乙醇的清除，從而達(dá)到解酒效果[9]。本研究通過一次大劑量酒精灌胃建立小鼠急性酒精性肝損傷模型，初步探討以葛根提取物、枳椇子提取物為主要成分的葛根枳椇子植物飲料對酒精誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用，為葛根枳椇子植物飲料在護(hù)肝方面的應(yīng)用提供實驗理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料與試劑

葛根枳椇子植物飲料：江陰天江藥業(yè)有限公司提供；聯(lián)苯雙酯：國立堂大藥房。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、還原型谷胱甘肽（GSH）以及丙二醛（MDA）檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所；其余試劑：國藥試劑，均為分析純。

1.1.2 試驗動物

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級健康KM小鼠，雄性，體質(zhì)量為（20±2）g：浙江維通利華試驗動物技術(shù)有限公司（生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0001）。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4）：上海申順生物科技有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（101C-3B）：上海市實驗儀器總廠；組織勻漿機(jī)：德國IKA公司；雙光束紫外可見分光光度計（TU-1900）：北京普析通用儀器；全自動酶標(biāo)儀（M5）：美國Molecular Devices。

1.3 試驗方法

1.3.1 動物分組及給藥

60只KM小鼠（雄性，6周齡），適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為6組（n=10），分組情況見表1。試驗期間，飼養(yǎng)環(huán)境嚴(yán)格控制在溫度（23.1±0.9） ℃、相對濕度52.8%±3.0%、換氣次數(shù)為10～20次/h、光照12 h和黑夜12 h的清潔干燥環(huán)境中，小鼠自由進(jìn)食、進(jìn)水。試驗方案經(jīng)江南大學(xué)試驗動物中心倫理委員會審查批準(zhǔn)（JN.No20210415k 0600610[067]）。

表1 小鼠分組及試驗設(shè)計Table 1 Groups of mice and experimental design

如表1所示，小鼠隨機(jī)分成6組，分別為空白組、模型組、陽性對照組、葛根枳椇子植物飲料低、中、高劑量組，灌胃體積為0.2 mL/20g·bw，每日一次，連續(xù)灌胃30 d。聯(lián)苯雙酯是治療病毒性肝炎和藥物性肝損傷引起轉(zhuǎn)氨酶升高的常用藥物，具有保護(hù)肝細(xì)胞，增加肝臟的解毒功能的藥理作用，且毒性低副作用小，因此選擇其作為陽性對照組。葛根枳椇子植物飲料的劑量選擇依據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》[11]，按照人體推薦攝入量每日40 g/60kg設(shè)置低、中、高3個劑量組（根據(jù)動物試驗與人體等效劑量換算方法，小鼠灌胃劑量為人體推薦攝入量5倍、10倍、20倍時，換算為人體等效劑量約為人體推薦攝入量的0.5倍、1倍、2倍）。末次灌胃1 h后，除空白組外，其他組按12 mL/kg·bw一次性灌胃50%的酒精。

1.3.2 樣品的采集和處理

末次灌胃16 h后，稱小鼠質(zhì)量，摘眼球取血后頸椎脫臼處死小鼠，然后立即取出肝臟，稱重后剖取小部分肝臟組織固定于4%多聚甲醛溶液，剩余部分-80 ℃保存。

1.3.3 檢測指標(biāo)與方法

1.3.3.1 小鼠肝臟指數(shù)的測定 小鼠頸椎脫臼處死后解剖，取完整肝臟，4 ℃預(yù)冷生理鹽水洗去肝臟表面浮血，濾紙拭干后稱重。按以下公式計算小鼠肝臟指數(shù)：

肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量(g)/體重(g)×100%

1.3.3.2 肝臟病理學(xué)檢查 在各組小鼠肝臟相同部位剪取部分組織，浸入4%多聚甲醛中固定過夜，脫水，石蠟包埋，蘇木精-伊紅（HE）染色，并于光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肝組織病理形態(tài)改變。

1.3.3.3 血清生化指標(biāo)和肝臟生化指標(biāo)的檢測 眼眶取血后，血漿靜置30 min，3 500 r/min離心15 min，得到分離血清，4 ℃保存。一周內(nèi)按照試劑盒說明書方法檢測血清中TC、TG、AST、ALT、LDL和HDL活力。

剩余肝組織4 ℃預(yù)冷生理鹽水沖洗后，用9倍（w/v）的預(yù)冷生理鹽水勻漿，在4 ℃、3 000 r/min條件下離心15 min，收集上清液，按照試劑盒說明書方法檢測肝組織SOD、MDA、GSH-Px和GSH活力。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 葛根枳椇子植物飲料對小鼠肝臟指數(shù)的影響

小鼠的肝臟指數(shù)與酒精引起的肝損害密切相關(guān)，可以直接反映肝損傷的程度。由圖1可知，與空白組小鼠相比，模型組小鼠肝臟指數(shù)明顯增加（P＜0.01），說明酒精性肝損傷小鼠造模成功。而與模型組相比，灌胃陽性藥物（聯(lián)苯雙酯）及不同劑量的葛根枳椇子植物飲料，均能降低小鼠的肝臟指數(shù)，其中中劑量組小鼠的肝臟指數(shù)降低最顯著4.66%±0.18%（P＜0.01），且其效果優(yōu)于陽性對照組4.66%±0.18%。表明葛根枳椇子植物飲料的攝入，可降低酒精性肝損傷小鼠的肝臟指數(shù)，減輕小鼠肝損傷程度，且中劑量的葛根枳椇子植物飲料效果最好。

圖1 小鼠的肝臟指數(shù)Fig.1 Liver index of mice

2.2 葛根枳椇子植物飲料對小鼠肝組織病理學(xué)變化的影響

肝臟作為酒精代謝的主要器官，酒精及其衍生物的代謝反應(yīng)會引起炎癥反應(yīng)，肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重甚至導(dǎo)致細(xì)胞壞死、纖維化。肝組織病理切片能直觀反映肝臟細(xì)胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)的損傷程度。如圖2，通過光學(xué)顯微鏡對肝組織切片觀察可以發(fā)現(xiàn)，空白組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，細(xì)胞核無水腫、脂肪變性或其他病變。模型組小鼠的肝細(xì)胞明顯受損，具有炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞變性，雙核細(xì)胞出現(xiàn)，脂肪空泡形成和其他負(fù)面變化。與模型組比較，低劑量組無明顯改善；陽性對照組及葛根枳椇子植物飲料中、高劑量組的小鼠肝細(xì)胞病理損傷明顯減輕，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整，排列比較整齊，壞死區(qū)域顯著減少。

圖2 小鼠的肝組織HE染色Fig.2 HE staining of mouse l iver

由此可見，中、高劑量的葛根枳椇子植物飲料對小鼠的組織病理學(xué)病變有一定的緩解和改善作用。

2.3 葛根枳椇子植物飲料對小鼠肝功能的影響

酒精代謝物可以通過結(jié)合肝臟細(xì)胞膜增加其通透性，進(jìn)而影響肝功能[12]。乙醛等代謝產(chǎn)物的積累和肝細(xì)胞的炎性損傷、氧化損傷等因素將共同導(dǎo)致肝細(xì)胞膜通透性增加，使細(xì)胞中轉(zhuǎn)氨酶從肝臟滲透到血液[12]，從而導(dǎo)致血液中ALT、AST濃度升高。因此血清中ALT、AST的含量是評估肝細(xì)胞損傷程度的重要指標(biāo)。

如圖3所示，對比空白組小鼠，模型組小鼠的ALT，AST水平較高，達(dá)到（16.41±3.86）U/L和（27.42±7.22）U/L，表明該模型已成功建立。對比模型組小鼠，葛根枳椇子植物飲料低、中、高劑量組小鼠的ALT、AST水平降低，且中、高劑量葛根枳椇子植物飲料對小鼠的AST水平干預(yù)效果顯著，分別下降到（19.17±6.22）U/L和（20.28±4.86）U/L，表明葛根枳椇子植物飲料干預(yù)對小鼠肝功能的恢復(fù)具有積極作用，且中、高劑量的葛根枳椇子植物飲料效果更明顯。這可能是由于植物飲料中葛根提取物、枳椇子提取物等成分加強(qiáng)酒精和乙醛在體內(nèi)的代謝，降低肝細(xì)胞膜通透性，恢復(fù)血清中ALT、AST的水平，起到肝保護(hù)作用。

圖3 葛根枳椇子植物飲料對小鼠肝功能的影響Fig.3 Effects of botanical beverage with pueraria extract and Hovenia dulcis Thunb. extract on liver function in mice

2.4 葛根枳椇子植物飲料對小鼠脂質(zhì)代謝的影響

酒精在機(jī)體內(nèi)代謝時，肝臟細(xì)胞的氧化還原平衡被破壞，肝臟對脂肪酸類物質(zhì)的氧化能力下降，進(jìn)而影響脂類物質(zhì)的代謝，導(dǎo)致TC、TG在肝細(xì)胞中大量蓄積[13]。此外，有研究顯示，它還能誘導(dǎo)皮下脂肪酸遷移至肝臟，引起肝臟內(nèi)TG等含量的增加，嚴(yán)重的將誘發(fā)酒精性脂肪肝的發(fā)生[14]。如圖4所示，對比空白組小鼠，模型組小鼠血清的TC、TG和LDL水平較高，分別為（5.32±0.63）mmol/L、（2.19±0.30）mmol/L和（0.32±0.12） mmol/L，而HDL水平較低，為（3.64±0.76）mmol/L，表明該模型已成功建立。對比模型組，葛根枳椇子植物飲料干預(yù)組的TC、TG和LDL水平有所下降，且中劑量葛根枳椇子植物飲料干預(yù)組效果較好，TC、TG和LDL分別降低至（4.77± 0.33） mmol/L、（1.92±0.24） mmol/L和（0.22±0.09）mmol/L（P＜0.05）。這表明使用中劑量的葛根枳椇子植物飲料干預(yù)對改善脂質(zhì)代謝紊亂具有更好的效果。這可能是由于葛根枳椇子植物飲料能加強(qiáng)肝臟對脂肪酸內(nèi)物質(zhì)的氧化能力，恢復(fù)小鼠血清TC、TG、LDL水平，改善脂質(zhì)代謝紊亂。

圖4 葛根枳椇子植物飲料對小鼠脂質(zhì)代謝的影響Fig.4 Effects of botanical beverage with pueraria extract and Hovenia dulcis Thunb. extract on lipid metabolism in mice

2.5 葛根枳椇子植物飲料對小鼠肝臟氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是酒精性肝損傷的一個重要原因。人體大量攝入酒精后，酒精在體內(nèi)氧化代謝為乙醛，引起抗氧化相關(guān)物質(zhì)的消耗，大量的自由基生成，機(jī)體的氧化還原平衡被破壞，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，進(jìn)而引發(fā)氧化損傷[15]。SOD、GSH-Px等抗氧化酶系和GSH等非酶類抗氧化物質(zhì)的協(xié)同作用可以保持機(jī)體自身抗氧化防御系統(tǒng)平衡，防止過氧化損傷[16]。MDA是脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志性產(chǎn)物，肝臟MDA含量的高低直接反映了肝臟氧化應(yīng)激的強(qiáng)烈程度[17]，常被看作是反映氧化損傷水平的重要指標(biāo)[17-18]。

如圖5所示，對比空白組小鼠的SOD、GSH-Px和GSH水平，模型組小鼠水平明顯降低，由（109.66±19.98）U/mg pro、（550.78±142.34）U/mg pro和（12.99±4.10） μmol/g pro下降為（76.68±13.07） U/mg pro、（328.64±66.35）U/mg pro和（7.96±2.83）μmol/g pro；而MDA水平顯著升高至（1.13±0.25）nmol/mg pro（P＜0.01），表明酒精性肝損傷模型成功建立。對比模型組，葛根枳椇子植物飲料中、高劑量組的SOD和GSH-Px水平顯著提高（P＜0.05），僅高劑量組的GSH水平明顯升高。此外，中、高劑量組的MDA的水平均顯著降低（P＜0.05）。這些結(jié)果表明，中、高劑量的葛根枳椇子植物飲料具有緩解肝臟氧化應(yīng)激的作用，可抵抗酒精引起的肝損傷。

圖5 葛根枳椇子植物飲料對小鼠肝臟氧化相關(guān)指標(biāo)的影響Fig.5 Effects of botanical beverage with pueraria extract and Hovenia dulcis Thunb. extract on liver oxidation-related indicators in mice

3 結(jié)論

肝臟是酒精代謝的主要器官，也是酒精攻擊的靶器官。相關(guān)研究表明，葛根、枳椇子等物質(zhì)可用于急性、慢性酒精性肝損傷的防護(hù)。因此本研究通過建立小鼠急性酒精性肝損傷的試驗動物模型，觀察了葛根枳椇子植物飲料在一次大劑量酒精（50% V/V，0.016 L/kg）暴露下對急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用，試驗結(jié)果表明，中、高劑量葛根枳椇子植物飲料的攝入，能增強(qiáng)肝臟抗氧化以及脂質(zhì)代謝能力，增強(qiáng)肝細(xì)胞功能，從而緩解小鼠在急性酒精暴露后的肝損傷程度，有效降低小鼠血清ALT、AST、TC、TG以及LDL水平，提高小鼠肝臟SOD、GSH-Px及GSH活性；還可顯著降低小鼠肝臟的脂質(zhì)過氧化水平，改善肝細(xì)胞脂肪變性情況。綜上所述，本研究表明一定劑量的葛根枳椇子植物飲料對急性酒精性肝損傷有明顯的保護(hù)作用，為其在酒精性肝損傷保護(hù)方面的應(yīng)用提供實驗理論依據(jù)。