任 欣，張付龍，秦夢園，沈 群?

（1. 北京工商大學(xué) 食品與健康學(xué)院，食品營養(yǎng)與人類健康北京高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048；2. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，國家糧食產(chǎn)業(yè)（青稞深加工）技術(shù)創(chuàng)新中心，北京 100083）

Ⅱ型糖尿病是一種復(fù)雜的慢性代謝疾病，已經(jīng)給全球人類健康構(gòu)成了重大威脅。我國更是成為全球糖尿病患者數(shù)量最多的國家[1]。近年來隨著腸道微生物研究的不斷深入，不僅給人們研究疾病提供了一個新視角，而且其潛在的醫(yī)學(xué)價值也在不斷被挖掘。從腸道微生物結(jié)構(gòu)組成和發(fā)揮作用方式兩個角度來看，它可能直接或間接的參與了眾多復(fù)雜代謝疾病的發(fā)展，且關(guān)系十分緊密[2]。已有研究表明，Ⅱ型糖尿病和肥胖均與腸道菌群的紊亂有關(guān)，具體表現(xiàn)在腸道微生物組成和相對豐度上與健康個體的偏離[3]，而個體飲食的差異在很大程度上又會影響其體內(nèi)腸道菌群的變化[4]?，F(xiàn)階段對腸道菌群結(jié)構(gòu)組成的鑒定及發(fā)揮功能的機(jī)制探究已經(jīng)成為人類疾病研究領(lǐng)域內(nèi)的一個重要組成元素[5]，包括Ⅱ型糖尿病[6]。然而由于腸道微生物體量巨大、復(fù)雜多變，有關(guān)不同條件下，包括特定膳食干預(yù)條件下以及膳食干預(yù)前后，腸道微生物的組成變化仍需進(jìn)一步深入細(xì)致的研究。

前期研究已經(jīng)證明，糖尿病大鼠經(jīng)小米膳食干預(yù)后，血糖代謝有所改善，并且對糖耐量減低患者也能發(fā)揮良好的降糖效果[7-8]，并且均與腸道菌群組成與結(jié)構(gòu)變化有關(guān)[9-10]。但是，以往有關(guān)腸道菌群的研究均是單獨(dú)進(jìn)行不同組別間在同一時間點(diǎn)的橫向比較，從未進(jìn)行過同一組別在不同時間點(diǎn)的縱向比較，未能全面清晰的展示小米膳食干預(yù)對腸道菌群的影響。因此，本研究以前期人群實(shí)驗(yàn)為指導(dǎo)，以高脂膳食聯(lián)合鏈尿佐菌素（Streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型為干預(yù)對象，分別從橫、縱兩個維度分析比較正常對照大鼠、模型對照大鼠與小米膳食干預(yù)大鼠腸道微生物的組成和結(jié)構(gòu)差異，闡明小米飼料干預(yù)對糖尿病大鼠腸道菌群的影響，為豐富“食物-菌群-疾病”理論提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動物

本試驗(yàn)所用的30只6周齡雄性SD大鼠均取自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司（動物合格證號：11400700149680）。

1.1.2 動物飼料

試驗(yàn)過程中所用飼料由北京科奧協(xié)力有限公司提供。嚴(yán)格按照Research Diet配方要求制作10%低脂對照飼料和60%高脂飼料。在保持各營養(yǎng)素供能比恒定的前提下，根據(jù)人與大鼠之間的換算關(guān)系[11]，設(shè)計(jì)制作20%小米干預(yù)飼料[7]。各飼料具體配方及營養(yǎng)素供能比如表1所示。

表1 試驗(yàn)用不同飼料的具體配方Table 1 The specific formulas of animal feeds

1.2 儀器與設(shè)備

PowerSoil-htp 96 Well Soil DNA Isolation Kit試劑盒：美國MoBio公司；GoTaq? Hot Start Colorless Master Mix：美國Promega公司；QIAquick?PCR Purification Kit試劑盒：Qiagen公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠飼養(yǎng)

所有大鼠飼養(yǎng)在SPF屏障環(huán)境內(nèi)，且保持在（22±2）℃、55%±5%相對濕度和12 h∶12 h光暗循環(huán)的條件，大鼠可自由攝食和飲水。環(huán)境適應(yīng)1周后，隨機(jī)從所有大鼠中挑選10只作為正常對照組（NC，10%低脂飼料），剩余20只大鼠進(jìn)行為期4周的60%高脂飼料膳食干預(yù)。

1.3.2 糖尿病大鼠的造模及分組

4周高脂飲食干預(yù)后，模型組大鼠禁食12 h，然后腹腔注射STZ溶液（注射劑量為35 mg/kg，將原STZ用0.1 mmol/L的檸檬酸鹽緩沖溶液稀釋成1%的溶液，并調(diào)節(jié)pH為4.2～4.5），繼續(xù)高脂喂養(yǎng)。NC組10只注射等量緩沖液。3天后尾靜脈取血，當(dāng)隨機(jī)血糖超過16.7 mmol/L時，即判定為糖尿病[12-13]。隨后將造模成功的糖尿病大鼠隨機(jī)分為模型對照組（DC，60%高脂飼料）和小米飼料干預(yù)組（FM，20%小米干預(yù)飼料）。

1.3.3 樣品采集

采集動物糞便時采用逼迫刺激法，用手指輕輕按壓大鼠腹部及臀部。在無菌條件下快速收取干預(yù)試驗(yàn)前后大鼠的糞便樣品，并立即放置在-80 ℃的冷環(huán)境下保存，用于后續(xù)腸道微生物組檢測。

1.3.4 腸道菌群分析

利用PowerSoil-htp 96 Well Soil DNA Isolation Kit試劑盒從動物糞便樣本中提取總DNA，用適量的無菌水稀釋DNA純度和濃度雙達(dá)標(biāo)的樣品，制成0.5 ng/μL的微量溶液。選定擴(kuò)增區(qū)域后，為保證擴(kuò)增效率和減小出錯率，使用GoTaq? Hot Start Colorless Master Mix和帶有Barcode的特異引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后，將其中等濃度的PCR產(chǎn)物進(jìn)行混合，混勻后用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。QIAquick? PCR Purification Kit試劑盒純化與回收PCR產(chǎn)物。合格樣本基因通過MiSeq上機(jī)測序，經(jīng)質(zhì)控篩選出的序列按照微生物分類等級定級，最后將序列進(jìn)行OTU聚類劃分（97%的相似度標(biāo)準(zhǔn)）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本研究數(shù)據(jù)以Mean ± SD的形式表示。使用IBM SPSS Statistics 20.0軟件中的單因素方差分析（ANOVA）或獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)來確定組間或組內(nèi)差異的顯著性，當(dāng)P＜0.05或P＜0.01時，可以判定差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用GraphPad Prism進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 小米飼料干預(yù)對高脂膳食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠腸道菌群多樣性的影響

本試驗(yàn)以細(xì)菌16S rRNA的V3、V4區(qū)（338F_806R）為測序依據(jù)，經(jīng)擴(kuò)增后共收獲193萬條序列，8.36 G堿基數(shù)據(jù)，平均讀長達(dá)433 bp。所有序列按標(biāo)準(zhǔn)相似度進(jìn)行聚類劃分后共獲得810個OTUs，從分類等級角度分析，可分為13個門、22個綱、33個目、58個科和158個屬。Rank-Abundance曲線和Shannon-Wiener曲線表明本研究所取樣本的物種分布較均勻，測序數(shù)據(jù)量已足夠大。為進(jìn)一步比較分析各分組樣本之間物種多樣性的差異，現(xiàn)選取sobs、ace、chao三個指數(shù)來衡量群落的豐富度，選取shannon、coverage兩個指數(shù)來衡量群落的多樣性（表2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)小米飼料干預(yù)對SD大鼠腸道菌群的物種多樣性無顯著性影響。

表2 糖尿病大鼠腸道微生物群落豐富度指數(shù)與多樣性指數(shù)Table 2 Indexes for community richness and diversity

2.2 小米飼料干預(yù)對高脂膳食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠腸道菌群在門水平的影響

厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidete）是人類腸道中的兩大優(yōu)勢菌群，累積占比高達(dá)90%以上。相比于人類菌群的結(jié)構(gòu)組成，鼠類腸道中擬桿菌門的相對豐度會顯著減少，而厚壁菌門和疣微菌門的相對豐度會顯著增加[6]，本試驗(yàn)結(jié)果與上述結(jié)論一致。如圖1所示，SD大鼠的腸道菌群主要由厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidete）、變形菌門（Proteobacteria）、柔膜菌門（Tenericutes）、放線菌門（Actinobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia）構(gòu)成，其中厚壁菌門的相對豐度高達(dá)83.9%，是優(yōu)勢菌群。Larsen等的研究發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型糖尿病患者與正常人群相比，其體內(nèi)的厚壁菌門比例顯著降低，擬桿菌門比例顯著升高，且厚壁菌門與擬桿菌門比值與血糖濃度顯著負(fù)相關(guān)[14]。目前，長期食用全谷物食品可有效降低血糖的營養(yǎng)觀念已漸漸深入人心，Martínez等發(fā)現(xiàn)攝入全谷物食品可使厚壁菌門與擬桿菌門比值顯著提高[15]。從門水平縱向分析小米飼料對糖尿病大鼠腸道菌群組成的影響，可發(fā)現(xiàn)攝食小米飼料的患病大鼠腸道內(nèi)厚壁菌門所占比例呈上升趨勢，而擬桿菌門所占比例則呈下降趨勢，即擬桿菌門與厚壁菌門的比值在減小，這意味著小米飼料可在一定程度上改善Ⅱ型糖尿病大鼠體內(nèi)腸道菌群紊亂的狀態(tài)，繼而使大鼠腸道微生物組成不斷向正常大鼠靠攏。

圖1 小米飼料干預(yù)對糖尿病大鼠腸道微生物在門水平的影響Fig.1 Effect of foxtail millet intervention on relative abundance of gut microbial in phylum level of high-fat diet and STZ-induced diabetic rats

2.3 小米飼料干預(yù)對高脂膳食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠腸道菌群在綱目科水平的影響

從綱水平進(jìn)行比較（圖2左），梭菌綱顯然是糖尿病大鼠腸道中的優(yōu)勢菌群，占有重要比例，其相對豐度較高，其次是擬桿菌綱和芽孢桿菌綱。糖尿病大鼠連續(xù)4周攝食小米飼料后，腸道內(nèi)梭菌綱和擬桿菌綱所占比列降低，芽孢桿菌綱所占比例上升。此外，α-變形菌綱、β-變形菌綱以及δ-變形菌綱相對豐度減少，這與門水平變形菌門相對豐度減少一致。

從目水平進(jìn)行比較（圖2中），梭菌目是糖尿病大鼠腸道中的優(yōu)勢菌群，同樣占有重要比例，其次是擬桿菌目和乳桿菌目。糖尿病大鼠連續(xù)4周攝食小米飼料后，腸道內(nèi)梭菌目和擬桿菌目所占比列降低，乳桿菌目所占比例上升。此外，脫硫弧菌目、伯克霍爾德氏菌目和脫鐵桿菌目的相對豐度均減少。

從科水平進(jìn)行比較（圖2右），瘤胃球菌科與毛螺菌科均為糖尿病大鼠腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群，兩者所占比例大致相同。糖尿病大鼠連續(xù)4周攝食小米飼料后，腸道內(nèi)瘤胃球菌科所占比例無明顯變化，毛螺菌科所占比例降低，乳桿菌科所占比例上升。此外，擬桿菌科、脫硫弧菌科以及產(chǎn)堿桿菌科的相對豐度均減小。

圖2 小米飼料干預(yù)對糖尿病大鼠腸道微生物在綱、目、科水平的影響Fig.2 Effect of foxtail millet intervention on relative abundance of gut microbial in class level,order level and family level of high-fat diet and STZ-induced diabetic rats

2.4 小米飼料干預(yù)對高脂膳食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠腸道菌群在屬水平的影響

依據(jù)腸道細(xì)菌分類等級，屬不僅是腸道微生物對機(jī)體產(chǎn)生實(shí)際功能作用的單元，同時也是16s RNA高通量測序技術(shù)能夠準(zhǔn)確鑒定的最小單元。從屬水平分析，正常小鼠腸道菌群主要由乳桿菌屬（Lactobacillus）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus_2）、未分類Lachnospiraceae、別樣棒菌（Allobaculum）、布勞特氏菌屬（Blautia）等組成。與NC組大鼠相比，DC組大鼠未分類Lachnospiraceae和未分類Verrucomicrobiaceae顯著增加，擬桿菌科的norank-Bacteroidales-S24-7-group與瘤胃球菌屬（Ruminococcus_2）極顯著減少。此外，NC組大鼠腸道內(nèi)乳桿菌屬（約13.9%）明顯高于DC組大鼠（3.2%），布勞特氏菌屬（NC組約3.6%）明顯低于DC組（6.6%），但由于顯著性水平易受樣本間腸道微生物波動的影響，并未達(dá)到顯著性差異統(tǒng)計(jì)水平。如圖3所示，縱向分析比較高脂膳食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠連續(xù)4周攝食小米飼料前后體內(nèi)腸道菌群在屬水平上物種相對豐度的差異，可發(fā)現(xiàn)干預(yù)4周后糖尿病大鼠腸道內(nèi)布勞特氏菌屬顯著減少，而乳桿菌屬和瘤胃球菌屬（Ruminococcus_2）顯著增加。如圖4所示，為使小米飼料能有助于改善糖尿病大鼠腸道菌群的結(jié)論更具科學(xué)性，進(jìn)一步排除糖尿病大鼠自我修復(fù)調(diào)節(jié)的可能性，所以將小米飼料干預(yù)末期的Ⅱ型糖尿病大鼠（干預(yù)后-FM）與模型組糖尿病大鼠（干預(yù)后-DC）腸道菌群在屬水平上物種相對豐度的差異進(jìn)行橫向分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于干預(yù)后-DC 組，干預(yù)后-FM組大鼠腸道內(nèi)的乳桿菌屬和瘤胃球菌屬（Ruminococcus_2）顯著提高，而別樣棒菌屬和未分類Lachnospiraceae顯著減少。

圖3 小米飼料干預(yù)前后糖尿病大鼠腸道微生物在屬水平的差異比較Fig.3 The difference comparation of gut microbial between Before-FM and After-FM in genus level of high-fat diet and STZ-induced diabetic rats

圖4 小米飼料干預(yù)結(jié)束后糖尿病大鼠腸道微生物在屬水平的差異比較Fig.4 The difference comparation of gut microbial between After -DC and After-FM in genus level of high-fat diet and STZ-induced diabetic rats

應(yīng)用Spearman相關(guān)性分析各菌屬與空腹血糖（FG）、糖耐量后2 h血糖（2h-G）、甘油三酯（TG）、膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）之間的相關(guān)性，結(jié)果如圖5所示。由圖可知，瘤胃球菌屬（Ruminococcus_2）與FG呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.806，P＜0.01），與2h-G（r=-0.644，P＜0.05＝和TG（r=-0.709，P＜0.05=呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。乳酸桿菌與TG（r=-0.758，P＜0.05）呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與TC（r=0.661，P＜0.05）和HDL-C（r=0.685，P＜0.05）呈顯著正相關(guān)關(guān)系。別樣棒菌屬與2h-G（r=-0.65，P＜0.05=和TG（r=-0.661，P＜0.05）均呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。布勞特氏菌屬、未分類毛螺菌科均與TG呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與HDL-C呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。相對豐度較低的Lachnoclostridium、厭氧球菌屬和嗜膽菌屬均與TG呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與TC、HDL-C呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖5 屬水平上豐度排名前30的細(xì)菌與血糖血脂的相關(guān)性分析Fig.5 The Spearman correlation analysis between the 30 most abundant genera of gut microbial in genus level and blood glucose and blood lipid

乳酸桿菌作為腸道有益菌參與人體免疫調(diào)節(jié)和維持機(jī)體健康狀態(tài)的作用早已成為共識[16]。現(xiàn)已證明，許多急慢性疾病與腸道內(nèi)乳酸桿菌的聯(lián)系十分密切，如高血脂、結(jié)腸炎、肥胖、機(jī)體炎癥反應(yīng)、Ⅱ型糖尿病等[17]。例如Lactobacillus plantarumX1、LactobacillusrhamnosusGG和LactobacillusreuteriGMNL-263這三種不同類型的乳酸桿菌，雖都是有益菌，但功能各不相同，Lactobacillus plantarumX1能夠刺激胰島素分泌和抑制α-葡萄糖苷酶的活性[18]，而Lactobacillus rhamnosusGG則通過增加血清中的脂聯(lián)素間接緩解胰島素抵抗[19]，LactobacillusreuteriGMNL-263能夠增加脂肪組織中 PPAR-γ和 GLUT4 的表達(dá)能力、加速肝臟脂肪的消耗，從而達(dá)到改善血糖代謝的目的[20]。由于縱向比較和橫向比較在乳酸桿菌相對豐度上的結(jié)果保持一致，即After-FM組顯著高于After-DC組和Before-FM組，從而推測小米飼料降血糖的功效可能是通過增加腸道內(nèi)乳酸桿菌的相對豐度來實(shí)現(xiàn)的，Zhang等[21]的研究結(jié)果也佐證了這一猜測。另外，在本試驗(yàn)相關(guān)性結(jié)果中顯示乳酸桿菌與血清中的TG、HDL-C兩個指標(biāo)顯著相關(guān)，再結(jié)合高血脂模型大鼠中LactobacillusplantarumNCU116的作用可推測其發(fā)揮降血脂作用的途徑可能是提高血清中HDLC的水平或降低血清中TG的水平[22]。

瘤胃球菌屬是革蘭氏陽性厭氧細(xì)菌，據(jù)現(xiàn)階段研究表明，其主要功能表現(xiàn)在生物降解方面，如降解抗性淀粉和某些纖維物質(zhì)[23-24]。本研究中糖尿病大鼠腸道內(nèi)瘤胃球菌屬的相對豐度相比于正常對照大鼠而言有所降低，但攝食小米飼料4周后這一變化發(fā)生了巨大反轉(zhuǎn)，即干預(yù)后大鼠腸道內(nèi)瘤胃球菌屬的相對豐度（1.1%）比干預(yù)前大鼠（5.6%）提高了4.5%?，F(xiàn)已有許多研究證明抗性淀粉和膳食纖具有降血糖的功效，長期食用可有助于機(jī)體血糖代謝的穩(wěn)步進(jìn)行，并減小眾多慢性代謝疾病的發(fā)病率，包括Ⅱ型糖尿病[25]。雙歧桿菌和瘤胃球菌屬一樣也是腸道有益菌，攝食抗性淀粉可有效促進(jìn)二者在腸道內(nèi)快速生長繁殖[26-27]。前期研究發(fā)現(xiàn)小米中抗性淀粉含量較高[28]，這可能是經(jīng)小米飼料干預(yù)后大鼠腸道內(nèi)瘤胃球菌屬相對豐度顯著增加和血清中甘油三脂水平降低的主要原因。布勞特氏菌屬是腸道內(nèi)短鏈脂肪酸的來源之一，其中乙酸最為主要[29]。試驗(yàn)表明布勞特氏菌屬在Ⅱ型糖尿病大鼠腸道內(nèi)的相對豐度高于NC大鼠，且其在腸道內(nèi)所占比例與血清中的IL-6和糖化血清蛋白水平均呈正相關(guān)關(guān)系[30]，推測經(jīng)小米飼料干預(yù)后其相對豐度降低將更易于血糖代謝的恢復(fù)。別樣棒菌屬是腸道內(nèi)的一種短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌[31]，在本次試驗(yàn)中，可發(fā)現(xiàn)此菌的數(shù)量會隨著糖尿病病情的延續(xù)進(jìn)一步增多，但相比于After-DC組，After-FM組糖尿病大鼠腸道內(nèi)別樣棒菌屬的數(shù)量顯著減少，這說明小米飼料可通過抑制別樣棒菌屬的生長繁殖，來減輕糖尿病的病情。已有不少文獻(xiàn)表明毛螺菌科（Lachnospiraceae）與Ⅱ型糖尿病的關(guān)聯(lián)十分密切[32]，在本次試驗(yàn)中毛螺菌科與別樣棒菌屬的情況較為相似，經(jīng)4周的小米飼料干預(yù)后，相比于DC大鼠，After-FM組大鼠腸道內(nèi)毛螺菌科相對豐度顯著減少，表明小米飼料干預(yù)也能夠通過減少毛螺菌科的相對豐度來發(fā)揮其降血糖的效果。

3 結(jié)論

綜上所述，SD大鼠的腸道菌群主要由厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、柔膜菌門、放線菌門和疣微菌門等構(gòu)成，其中厚壁菌門的相對豐度高達(dá)83.9%，是絕對優(yōu)勢菌群。連續(xù)4周攝食小米飼料的糖尿病大鼠腸道內(nèi)擬桿菌門與厚壁菌門的比值減小，表明小米飼料可在一定程度上改善糖尿病大鼠體內(nèi)腸道菌群紊亂的狀態(tài)，繼而使大鼠腸道微生物組成向著更為健康的方向發(fā)展。從屬水平分析，正常大鼠腸道內(nèi)菌群主要由乳酸桿菌、瘤胃球菌屬（Ruminococcus_2）、未分類毛螺菌科、別樣棒菌屬、布勞特氏菌屬等組成。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，瘤胃球菌屬與空腹血糖（r=-0.806，P＜0.01）、糖耐量后2h血糖（r=-0.644，P＜0.05）呈顯著負(fù)相關(guān)，乳酸桿菌與高密度脂蛋白膽固醇（r=0.685，P＜0.05）呈顯著正相關(guān)。小米飼料干預(yù)降糖功效的發(fā)揮可能是通過增加糖尿病大鼠腸道內(nèi)乳酸桿菌和瘤胃球菌屬的相對豐度，減少布勞特氏菌屬、別樣棒菌屬和毛螺菌科的相對豐度來實(shí)現(xiàn)的。