王小全

（黑龍江省佳木斯市中心醫(yī)院 消化內(nèi)科，黑龍江 佳木斯 154002）

克羅恩病為一種自身免疫性腸道疾病，有著病程長(zhǎng)、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，在我國(guó)發(fā)病率約1.4/10萬［1］。目前的醫(yī)療技術(shù)尚無法徹底治愈克羅恩病［2］，因此仍需對(duì)該病發(fā)病機(jī)理進(jìn)行長(zhǎng)期研究探索，以期對(duì)該病的診治提供幫助。近年來，克羅恩病發(fā)生發(fā)展中腸道菌群結(jié)構(gòu)變化逐漸引起臨床工作者的重視，諸多學(xué)者認(rèn)為腸道菌群失衡參與克羅恩病病情進(jìn)展，可引起腸道細(xì)菌移位，促發(fā)炎癥反應(yīng)［3］。微小RNA（microRNA,miR）是一類與諸多生命活動(dòng)關(guān)系密切的單鏈非編碼RNA 小分子，在炎癥性腸病中發(fā)揮重要作用，隨著學(xué)者對(duì)miRNA 的不斷鑒定和探索，發(fā)現(xiàn)miR-215、miR-335均與克羅恩病的發(fā)病相關(guān)［4-5］。為此，本研究探討了老年克羅恩病患者血清miR-215、miR-335 表達(dá)及與腸道菌群的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

獲佳木斯市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)XYFY2018-KL002-01），并取得患者的知情同意。選擇2019 年4 月至2021 年4 月佳木斯市中心醫(yī)院收治的126 例克羅恩病患者為觀察組，男90 例；漢族99 例；體質(zhì)量指數(shù)（22.72±3.75）kg/m2；年 齡60～85 歲，平 均（67.81±3.80）歲；病 程6～60 個(gè) 月，平 均（38.36±15.17）個(gè)月；吸煙史37 例，飲酒史51 例；病變部位：回腸57 例，結(jié)腸22 例，回結(jié)腸47 例；臨床類型：狹窄型31 例，穿透型19 例，非狹窄非穿透型76 例。同期體檢健康者100 例為對(duì)照組，男72 例；漢族79 例；年齡60～83 歲，平均（68.01±3.64）歲；體質(zhì)量指數(shù)（22.80±3.51）kg/m2；吸煙史31 例，飲酒史42 例。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：克羅恩病據(jù)《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見（2018 年·北京）》中有關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)確診［6］；無其他腸道疾?。徊〕? 個(gè)月以上；肝、腎等重要臟器無功能異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并甲狀腺功能疾??；合并凝血系統(tǒng)疾??；依從性差；病歷資料不全；合并自身免疫性疾?。缓喜盒阅[瘤；合并精神性疾病；合并內(nèi)分泌疾??；近期有卒中史；入院前已接受相關(guān)治療；合并心血管疾病。

1.2 儀器與試劑

臺(tái)式低速血液離心機(jī)（上海信裕生物科技有限公司，型號(hào)XY-2637）；PCR 檢測(cè)儀（上海佑隆生物科技有限公司，型號(hào)DNAble@）；Baypure 通用型磁珠法總RNA 提取試劑盒（廣州灣區(qū)生物科技有限公司，批號(hào)WADM-48-K）；肝素鈉抗凝管（上海圻明生物科技有限公司，批號(hào)OX02832）；TaqMan miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（哈爾濱新?；驒z測(cè)有限公司，批號(hào)D1803）；需氧培養(yǎng)基（北京百奧萊博科技有限公司，批號(hào)SNM542-QZV）；厭氧培養(yǎng)基（上海赫澎生物科技有限公司，批號(hào)BR038）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 入院次日清晨，空腹取5 mL 外周靜脈血，3 000 r/min 離心10 min，取上清液，冰箱保存待測(cè)。取新鮮糞便0.5 g，依據(jù)10 倍稀釋法稀釋至10-8，留取10 μL，冰箱保存待測(cè)。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction,RTPCR）實(shí)驗(yàn)［7］采用總RNA 提取試劑盒對(duì)血清中的總RNA 予以提取，對(duì)總RNA 濃度予以測(cè)定，再經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以此cDNA 為模板在相關(guān)儀器上進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系共10 μL，其中包含cDNA 1 μL、MiScript SYBR Green Mix 5 μL、上下游引物各0.5 μL 及雙蒸水3 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性90 s，95℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸15 s，總共40 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳，采集電泳照片，對(duì)各擴(kuò)增條帶吸光度值進(jìn)行測(cè)定。miR-215 或miR-335 相對(duì)表達(dá)量=miR-215 或miR-335 擴(kuò)增條帶吸光度值/U6 擴(kuò)增條帶吸光度值×100%。

1.3.3 腸道菌群數(shù)量檢測(cè)［8］將10 μL 糞便稀釋液，大腸桿菌和腸球菌采用需氧培養(yǎng)基予以培養(yǎng)，乳酸桿菌和雙歧桿菌采用厭氧培養(yǎng)基予以培養(yǎng)，溫度設(shè)置在37℃條件下，連續(xù)培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)菌落數(shù)。通過革蘭染色、生化對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定，然后計(jì)算每克糞便含菌群數(shù)（CFU/g），數(shù)據(jù)結(jié)果用對(duì)數(shù)形式表示。

1.4 觀察指標(biāo)

①比較2 組血清miR-215、miR-335 相對(duì)表達(dá)量；②比較2 組腸道菌群數(shù)量；③比較緩解期和活動(dòng)期患者血清miR-215、miR-335 相對(duì)表達(dá)量；④采用Spearman 檢驗(yàn)分析miR-215、miR-335 與克羅恩病疾病活動(dòng)度的相關(guān)性；⑤采用Pearson 檢驗(yàn)分析miR-215、miR-335 與克羅恩病患者腸道菌群的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析在SPSS 22.0 軟件上進(jìn)行。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman 和Pearson 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-215、miR-335 相對(duì)表達(dá)量比較

血清miR-215、miR-335 在觀察組中的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組血清miR-215、miR-335 相對(duì)表達(dá)量（）

表1 兩組血清miR-215、miR-335 相對(duì)表達(dá)量（）

2.2 兩組腸道菌群數(shù)量比較

觀察組乳酸桿菌數(shù)量和雙歧桿菌數(shù)量顯著少于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），觀察組腸球菌數(shù)量和大腸桿菌數(shù)量顯著多于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組腸道菌群數(shù)量比較（,lgCFU/g）

表2 兩組腸道菌群數(shù)量比較（,lgCFU/g）

2.3 緩解期和活動(dòng)期患者血清miR-215、miR-335相對(duì)表達(dá)量分析

根據(jù)簡(jiǎn)化克羅恩病活動(dòng)指數(shù)（Crohn's disease activity index,CDAI）［9］將126 例克羅恩病患者分為緩解期組（CDAI≤4 分，43 例）與活動(dòng)期組（CDAI＞4 分，83 例）?；顒?dòng)期患者血清miR-215 相對(duì)表達(dá)量（0.28±0.06）顯著低于緩解期患者（0.99±0.40），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-11.572,P＜0.05），活動(dòng)期患者血清miR-335 相對(duì)表達(dá)量（0.31±0.09）顯著低于緩解期患者（0.93±0.46），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-8.752,P＜0.05）。見圖1。

圖1 緩解期和活動(dòng)期患者血清miR-215、miR-335 相對(duì)表達(dá)量

2.4 miR-215、miR-335 與克羅恩病疾病活動(dòng)度的Spearman 相關(guān)性

miR-215、miR-335 與克羅恩病疾病活動(dòng)度均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.640,P＜0.001；r=-0.702,P＜0.001）。見圖2。

圖2 miR-215、miR-335 與克羅恩病疾病活動(dòng)度的相關(guān)性

2.5 miR-215、miR-335 與克羅恩病患者腸道菌群的Pearson 相關(guān)性

miR-215、miR-335 與克羅恩病患者乳酸桿菌數(shù)量和雙歧桿菌數(shù)量均呈正相關(guān)（P＜0.05），miR-215、miR-335 與克羅恩病患者腸球菌數(shù)量和大腸桿菌數(shù)量均呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。見表3。

表3 miR-215、miR-335 與克羅恩病患者腸道菌群的相關(guān)性

3 討論

miRNA 為一種微小RNA 分子，起始于細(xì)胞核且成熟于細(xì)胞質(zhì)，由約20 個(gè)堿基構(gòu)成，在真核細(xì)胞中廣泛存在，在人體腦脊液、血液、尿液、唾液等體液內(nèi)均能表達(dá)，miRNA 可與蛋白質(zhì)等物質(zhì)構(gòu)成復(fù)合物，抑制RNA 酶降解，因此miRNA 在體液中有著較強(qiáng)的穩(wěn)定性及保守性［10］。該分子能與靶mRNA 互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)而阻止其翻譯，調(diào)控基因表達(dá)，還在細(xì)胞生物學(xué)行為（凋亡、增殖、分化等）及炎癥性疾病、感染性疾病、消化系統(tǒng)疾病等疾病中發(fā)揮十分重要的作用［11］。miRNA 在健康人群中的表達(dá)譜基本一致，但該分子在不同疾病發(fā)病狀態(tài)下的表達(dá)譜會(huì)出現(xiàn)異常變化，此種變化通常早于影像學(xué)和生化改變，因此miRNA 在多種疾病早期診斷中具有潛在應(yīng)用價(jià)值［12-13］。miRNA 能夠?qū)C(jī)體內(nèi)60%基因予以調(diào)節(jié)，miR-215、miR-335 是近年來新發(fā)現(xiàn)的miRNA，已有研究證實(shí)兩個(gè)分子可介導(dǎo)某些代謝通路而影響克羅恩病的發(fā)生及發(fā)展［14-15］。miR-335 定位于人類染色體7q32.2，具有調(diào)節(jié)人干細(xì)胞增殖、分化及遷移的作用。報(bào)道顯示［16］，miR-335 在潰瘍性結(jié)腸炎中表達(dá)水平出現(xiàn)下調(diào)，在潰瘍性結(jié)腸炎病情進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)［17］，miR-335 表達(dá)水平與克羅恩病患者病變嚴(yán)重程度有關(guān)，可作為患者病變嚴(yán)重程度的評(píng)估指標(biāo)之一。miR-215 定位于人類染色體1q41，動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示［18］，miR-215 在克羅恩病小鼠模型中表達(dá)量明顯減少，提示miR-215 分子可能參與了克羅恩病的發(fā)病過程，為了進(jìn)一步探索miR-215 對(duì)克羅恩病的影響，該研究通過灌腸給予模型小鼠miR-215 過表達(dá)的腺病毒載體進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)miR-215 過表達(dá)能夠顯著降低小鼠CDAI 評(píng)分值，改善結(jié)腸組織病理損傷，減少白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）等促炎因子釋放，表明miR-215 與克羅恩病存在密切聯(lián)系。上述報(bào)道與本次研究結(jié)果相吻合，本研究中血清miR-215、miR-335 在觀察組中的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組均顯著減低，提示血清miR-215、miR-335 在老年克羅恩病患者中呈低表達(dá)水平；活動(dòng)期患者血清miR-215、miR-335 相對(duì)表達(dá)量顯著低于緩解期患者，提示miR-215、miR-335 可能與克羅恩病疾病活動(dòng)度均呈負(fù)相關(guān)，Spearman 相關(guān)性分析數(shù)據(jù)結(jié)果亦證實(shí)了這一結(jié)論。

克羅恩病為一種慢性炎癥性腸道疾病，腸道微生態(tài)與腸道黏膜免疫的異常變化可引起腸道慢性炎癥，而腸道慢性炎癥狀況下腸道微生態(tài)失衡現(xiàn)象亦可加重，病情如此反復(fù)，難以治愈［19］。因此，通過調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂異常狀態(tài)，使正常腸道微生態(tài)重新恢復(fù)，是治療克羅恩病的重要手段之一?，F(xiàn)臨床已有糞便移植應(yīng)用于治療頑固性克羅恩病患者的報(bào)道，報(bào)道中相關(guān)數(shù)據(jù)顯示患者獲得良好療效［20］。本研究顯示，觀察組乳酸桿菌數(shù)量和雙歧桿菌數(shù)量顯著少于對(duì)照組，觀察組腸球菌數(shù)量和大腸桿菌數(shù)量顯著多于對(duì)照組，提示克羅恩病患者腸道菌群存在紊亂異常狀態(tài)。本次研究Pearson 檢驗(yàn)分析顯示，miR-215、miR-335 與克羅恩病患者乳酸桿菌數(shù)量和雙歧桿菌數(shù)量均呈正相關(guān)，與腸球菌數(shù)量和大腸桿菌數(shù)量均呈負(fù)相關(guān)，可能是由于血清miR-215、miR-335 表達(dá)水平變化可改變腸道菌群結(jié)構(gòu)，故而動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)2 項(xiàng)指標(biāo)水平變化情況，將有利于及時(shí)調(diào)節(jié)患者腸道菌群結(jié)構(gòu)，有效地改善腸道炎癥狀態(tài)，加強(qiáng)機(jī)體腸上皮屏障作用，進(jìn)而抑制克羅恩病病情進(jìn)展。

綜上所述，老年克羅恩病患者血清miR-215、miR-335 呈低表達(dá)水平，其水平與疾病活動(dòng)度及腸道菌群具有一定相關(guān)性，這兩項(xiàng)指標(biāo)有望成為克羅恩病診治的相關(guān)指標(biāo)之一。但本次研究隨訪時(shí)間較短，有待延長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)一步觀察其預(yù)后。