車功恒，張國華，肖軍霞，3，李曉丹，3，郭麗萍，3*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東 青島 266109；2.青島產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，山東 青島 266100；3.青島特種食品研究院，山東 青島 266109）

甘藍（Brassica oleracea var.capitata）屬十字花科蕓薹屬植物，也稱包菜、大頭菜、卷心菜，在我國種植面積非常廣；富含膳食纖維、維生素（A、B1、B2、C）及礦物質(zhì)（鈣、鐵、磷）；此外，還含有多種對人體有益的次生代謝產(chǎn)物，如硫代葡萄糖苷（簡稱硫苷）、酚類物質(zhì)和花色苷等[1]。當植物細胞破碎時，黑芥子酶會釋放出來與硫代葡萄糖苷結合形成水解產(chǎn)物，如異硫氰酸酯、硫氰酸酯、腈類和2-S惡唑烷等[2]，其中異硫氰酸酯是研究較多且具有重要生理活性的物質(zhì)。研究表明，甘藍具有降低血糖、抗癌、抗氧化、調(diào)節(jié)機體免疫力等功能，這主要與酚類物質(zhì)和硫苷代謝產(chǎn)物等生物活性物質(zhì)密切相關[3]。由于芽苗菜含有比成熟蔬菜更高的活性物質(zhì)，其作為功能性蔬菜已被廣泛食用，雖然甘藍芽苗菜在我國還鮮有食用，但也引起了研究者的重視。

光作為一種環(huán)境因子，能夠參與調(diào)控植物葉片光合作用、種子萌發(fā)、植物生長、調(diào)節(jié)氣孔對外界環(huán)境變化的反應[4]。發(fā)光二極管（lighting emitting diode，LED）作為光源也可以調(diào)控芽苗菜的品質(zhì)和次生代謝[5]。Chen等[6]研究發(fā)現(xiàn)藍光處理下羽衣甘藍芽苗菜中脂肪族硫苷含量最高，分別是紅光和白光處理的1.6倍和2倍。Yamada等[7]研究發(fā)現(xiàn)，藍光照射蘿卜下胚軸10 min內(nèi)，黑芥子酶活性顯著增強，在30 min時活性最高，約為黑暗對照下的9.8倍。戚楠楠等[8]比較黑暗、白光、藍光和紫外UV-A不同光質(zhì)及光周期條件下對大豆芽苗花色苷含量的影響，結果發(fā)現(xiàn)藍光照射處理24 h后，大豆芽苗中花色苷含量達到最大值（24 U/g FW），明顯高于白光和黑暗處理。姜宗慶[9]發(fā)現(xiàn)藍光處理香椿芽苗菜能夠富集總酚和總黃酮含量，較白光處理分別提高了128.57%和204.76%；此外，還發(fā)現(xiàn)藍光能夠促進香椿芽苗體內(nèi)抗壞血酸的生成，效果優(yōu)于白光和紅光。LED藍光處理下能促進大白菜抗壞血酸基因生物合成以及轉錄水平，進而提高抗壞血酸含量[10]。藍光在提高西蘭花芽苗菜營養(yǎng)品質(zhì)方面的效果優(yōu)于白光、紅光、綠光、黃光和紫光[11]。但關于藍光光周期調(diào)控甘藍芽苗菜生理生化及次級代謝產(chǎn)物的積累鮮有報道。

因此，本研究以“新夏50”和“紫紅鉆”兩種甘藍種子為試材，研究藍光不同光周期對甘藍芽苗菜的生長狀況、抗壞血酸含量、花色苷含量、硫代葡萄糖苷含量、黑芥子酶活性、異硫氰酸酯形成的影響，旨在為藍光用于甘藍芽苗菜的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘藍種子：壽光萬和種業(yè)有限公司；DEAE Sephadex TMA25樹脂：北京索萊寶有限公司；烯丙基硫苷標準品、蘿卜硫素標準品、硫酸酯酶、葡萄糖試劑盒、抗壞血酸（分析純）：美國Sigma公司；二氯甲烷、1，2-苯二硫醇、牛血清白蛋白、醋酸鈉（分析純）：國藥集團（上海）化學試劑有限公司；乙腈、甲醇（色譜純）：天津科密歐化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

智能光照培養(yǎng)箱（RTOB-500B）：上海高致精密儀器有限公司；高效液相色譜儀（Thermo Ultimate 3000）：美國賽默飛公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-S2）：金壇市醫(yī)療儀器廠；離心機（TDL-40B）：上海安亭科學儀器廠；紫外分光光度計（UV-5100）：上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甘藍種子發(fā)芽條件

將甘藍種子用1.5%的次氯酸鈉浸泡15 min消毒，用蒸餾水沖洗至中性，于30℃蒸餾水浸泡3 h。將浸泡完的甘藍種子均勻平鋪在裝有蛭石的培養(yǎng)盤中，于25℃培養(yǎng)箱中黑暗發(fā)芽1 d后，置于藍光下培養(yǎng)，甘藍種子距離燈源約40 cm，光周期分別為4、8、12、16、20 h/d和24 h/d，以黑暗條件下培養(yǎng)為對照，每天噴灑去離子水2次，于4 d時進行取樣測定。

1.3.2 芽長及株重的測定

隨機取20株甘藍芽苗為一組，使用游標卡尺測量其芽長，使用電子天平測量其株重。

1.3.3 抗壞血酸含量的測定

參照Volden等[12]的方法，稱0.2 g甘藍芽苗，加4 mL2%的草酸溶液進行研磨，于10000×g離心15min，取1 mL上清液過0.45 μm膜，進行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定。HPLC條件：色譜柱為SB-C18；波長為254 nm；流速為0.8 mL/min；柱溫設置 30 ℃；進樣量為 20 μL；流動相為0.1%甲酸-甲醇（體積比為95∶5）?？箟难岷恳怎r重計，用mg/100 g FW表示。

1.3.4 花色苷含量的測定

根據(jù)于海鑫等[13]的方法，稱0.2 g甘藍芽苗菜，加4 mL酸化乙醇快速研磨，10 000×g離心5 min，取上清液在535 nm處測量吸光度。花色苷含量用mg/100 g FW表示。

1.3.5 硫代葡萄糖苷含量的測定

選用Guo等[14]的方法，稱0.5 g甘藍芽苗，加4 mL煮沸的75%的甲醇溶液研磨，于80℃浸提15 min，10 000×g離心10 min，取1 mL上清液流經(jīng)DEAE Sephadex A-25樹脂后加入800 μL硫酸酯酶，于35℃反應16 h，過夜流掉后用3 mL蒸餾水沖洗，取1 mL上清液過0.45 μm膜，進行HPLC測定。HPLC條件：色譜柱為Agilent C18柱；波長226 nm；流速 1 mL/min；柱溫30℃；進樣量20 μL；流動相用20%乙腈和超純水。硫代葡萄糖苷含量用μmol/g FW表示。

1.3.6 黑芥子酶活性的測定

根據(jù)王志英等[15]的試驗方法，稱0.5 g甘藍芽苗菜，加入3 mL磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH6.5），在冰浴條件下研磨，于10 000×g冷凍離心15 min，所得上清液即為粗酶液。取0.5 mL粗酶液和0.5 mL烯丙基硫苷（1 mmol/L）充分混合，37℃恒溫水浴鍋反應10 min，于100℃滅酶5 min后用葡萄糖試劑盒測定。以每分鐘被黑芥子酶轉化生成1 nmol葡萄糖為一個酶活力單位。黑芥子酶活性用nmol/（min·mg prot）表示。

1.3.7 異硫氰酸酯含量的測定

選取Guo等[16]的方法，稱甘藍芽苗菜0.5 g，加4 mL蒸餾水研磨，于40℃利用內(nèi)源酶酶解3 h，10 000×g離心15 min。取100 μL上清液，分別向其中加入200 μL 7 nmol/L 1，2-苯二硫醇、2 mL甲醇和1.8 mL 0.2 mol/L pH8.5硼砂緩沖液，混勻。65℃反應1 h，過0.45 μm濾膜，HPLC測定。HPLC條件為色譜柱：Agilent C18柱；波長：365 nm；流速：1 mL/min；進樣量：20 μL；流動相：甲醇-水（體積比為7∶3）。異硫氰酸酯含量用mg/100 g FW表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均設3次重復，數(shù)據(jù)用SPSS 26進行顯著性分析（p＜0.05），用 Mircosoft Excle 2013進行作圖。

2 結果與分析

2.1 藍光光周期對甘藍芽苗菜芽長及株重的影響

藍光光周期對甘藍芽苗菜芽長及株重的影響見圖1。

圖1 藍光光周期對甘藍芽苗菜芽長及株重的影響Fig.1 Effect of blue light photoperiod on sprout length and weight of cabbage sprouts

由圖1可知，與黑暗相比，藍光處理顯著抑制了甘藍芽苗菜的生長（p＜0.05），與 Zhuang等[11]對西蘭花芽苗菜的研究結果一致。在光周期為0～12 h/d，“新夏50”芽苗菜芽長明顯高于“紫紅鉆”，但在 16 h/d～24 h/d，兩個品種之間無顯著差異。張歡等[17]報道指出，紅光光周期從0延長到20 h/d，油葵芽苗菜下胚軸長逐漸降低，在20 h/d時達到最小值，本研究也得到相似結果，隨著光周期的延長，甘藍芽苗菜芽長不斷降低，光周期為16 h/d～24 h/d，芽長變化不顯著。同時，藍光對擬南芥芽長的抑制作用也與本研究相似，研究認為這種抑制作用開始于陰離子通道介導的質(zhì)膜去極化[18]。與對照組相比，藍光處理使兩種甘藍芽苗的株重顯著降低（p＜0.05），光周期為 24 h/d 時，“新夏 50”和“紫紅鉆”的株重分別比黑暗條件下減少了46.4%和55.2%，與芽長變化趨勢一致。

2.2 藍光光周期對甘藍芽苗菜抗壞血酸含量的影響

藍光光周期對甘藍芽苗菜抗壞血酸含量的影響見圖2。

圖2 藍光光周期對甘藍芽苗菜抗壞血酸含量的影響Fig.2 Effect of blue light photoperiod on ascorbic acid content in cabbage sprouts

藍光處理能夠顯著提高甘藍芽苗菜的抗壞血酸含量（p＜0.05），隨著光周期的延長，芽苗菜抗壞血酸含量整體呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，兩個品種之間差異不明顯。張歡等[19]研究表明，藍光處理蘿卜芽苗菜下胚軸中抗壞血酸含量最高，可能與抗壞血酸合成分解相關酶（半乳糖內(nèi)酯脫氫酶、抗壞血酸氧化酶和抗壞血酸過氧化物酶）對光的響應機理不同。此外，還發(fā)現(xiàn)藍光可促進擬南芥和煙草中的磷酸甘醇突變酶的表達，此酶與抗壞血酸生物合成基因密切相關，從而使抗壞血酸含量增加[20]。本研究中，“新夏50”在16 h/d抗壞血酸含量達到最高，“紫紅鉆”在12 h/d抗壞血酸含量最高，分別是對照組的1.86倍和1.72倍。

2.3 藍光光周期對甘藍芽苗菜花色苷含量的影響

藍光光周期對甘藍芽苗菜花色苷含量的影響見圖3。

圖3 藍光光周期對甘藍芽苗菜花色苷含量的影響Fig.3 Effect of blue light photoperiod on anthocyanin content in cabbage sprouts

研究表明，光照處理通過提高花色苷合成通路中相關基因表達水平實現(xiàn)花色苷的積累[21]。藍光處理提高花色苷合成途徑中苯丙氨酸解氨酶及查爾酮異構酶活力，從而提高西蘭花芽苗菜中的花色苷含量[22]。由圖3可知，藍光處理顯著提高甘藍芽苗菜中花色苷含量（p＜0.05），光周期為 20 h/d 時，“紫紅鉆”芽苗菜花色苷含量為66.07 mg/100 g FW，是對照的9.14倍?！靶孪?0”芽苗菜在光周期24 h/d時花色苷含量最高，為20.53 mg/100 g FW，為對照組的10.98倍?！白霞t鉆”芽苗菜花色苷含量明顯高于“新夏50”。

2.4 藍光光周期對甘藍芽苗菜硫代葡萄糖苷含量的影響

藍光光周期對甘藍芽苗菜硫代葡萄糖苷含量的影響見表1。

表1 藍光光周期對甘藍芽苗菜硫代葡萄糖苷含量的影響Table 1 Effect of blue light photoperiod on glucosinolate content in cabbage sprouts μmol/g FW

研究發(fā)現(xiàn)，植物品種不同硫苷含量差異很大[15]。本研究中兩種芽苗菜硫苷種類和含量也不同，“新夏50”和“紫紅鉆”芽苗菜中均以脂肪族硫苷為主，分別占總硫代葡萄糖苷的95.91%和86.63%；“新夏50”芽苗菜中最多的硫苷為2-丙烯基硫苷，3-甲基亞磺?；蜍沾沃霞t鉆”芽苗菜中3-甲基亞磺?；蜍蘸孔罡撸坏枷阕辶蜍瘴丛凇靶孪?0”中檢測到。藍光處理明顯提高了兩種甘藍芽苗中硫苷含量，與黑暗相比，脂肪族硫苷、芳香族硫苷和吲哚族硫苷含量都有不同程度的增加。在光周期16 h/d時，“新夏50”甘藍芽苗中總硫代葡萄糖苷含量達到最大值，為22.23 μmol/g FW，比對照增加了81.91%；2-丙烯基硫苷和3-甲基亞磺?；蜍蛰^對照相比增加了66.45%和43.02%?！白霞t鉆”甘藍芽苗菜中總硫代葡萄糖苷含量在光周期12h/d時最高，是黑暗處理下的2.23倍，3-甲基亞磺?；蜍蛰^對照組提高63.92%。

2.5 藍光光周期對甘藍芽苗菜黑芥子酶活性的影響

藍光光周期對甘藍芽苗菜黑芥子酶活性的影響見圖4。

圖4 藍光光周期對甘藍芽苗菜黑芥子酶活性的影響Fig.4 Effect of blue light photoperiod on myrosinase activity in cabbage sprouts

光處理能夠誘導黑芥子酶基因表達并提高其活性[7]。如圖4所示，不同藍光光周期下，兩種甘藍芽苗菜的黑芥子酶活性變化基本一致，呈折線型變化。與黑暗相比，藍光處理降低了“新夏50”甘藍芽苗菜的黑芥子酶活性，在4 h/d藍光處理黑芥子酶活性最低，較對照降低77.08%；光周期4 h/d～24 h/d黑芥子酶活性不斷增強，然后又持續(xù)下降。“紫紅鉆”黑芥子酶活性則不同于“新夏50”，光周期為12 h/d和16 h/d時黑芥子酶活性略高于對照組，12 h/d時藍光處理活性最高，為24.75 nmol/（min·mg prot），20 h/d時活性最低，為5.61 nmol/（min·mg prot）。本研究結果表明藍光光周期對不同品種植物的黑芥子酶活性影響也不同，這可能與黑芥子酶基因表達有關，但具體機理還有待于深入研究。

2.6 藍光光周期對甘藍芽苗菜異硫氰酸酯含量的影響

藍光光周期對甘藍芽苗菜異硫氰酸酯含量的影響見圖5。

圖5 藍光光周期對甘藍芽苗菜異硫氰酸酯含量的影響Fig.5 Effect of blue light photoperiod on isothiocyanate content in cabbage sprouts

異硫氰酸酯是硫代葡萄糖苷在黑芥子酶的作用下形成的產(chǎn)物之一，也是十字花科植物中起重要生理功能的物質(zhì)。異硫氰酸酯主要來自于脂肪族硫苷和芳香族硫苷，而吲哚族硫苷降解生成的異硫氰酸酯非常不穩(wěn)定，會迅速降解生成其它產(chǎn)物，如GB的最終降解產(chǎn)物是3-吲哚甲醇，3-吲哚乙腈和3，3-二吲哚甲烷[23]。如圖5所示，“紫紅鉆”芽苗菜的異硫氰酸酯含量明顯高于“新夏50”，而“新夏50”芽苗菜中異硫氰酸酯的前體物質(zhì)——硫苷的含量顯著高于“紫紅鉆”，原因一方面是由于“紫紅鉆”芽苗菜的黑芥子酶活力更高；另一方面可能是“新夏50”芽苗菜中上皮硫特異蛋白的活性更高，因為上皮硫特異蛋白的存在使硫苷向腈類物質(zhì)方向水解，從而降低異硫氰酸酯的形成[24]。Zhuang等[11]研究表明藍光主要通過調(diào)控硫苷降解途徑從而提高西蘭花芽苗菜中蘿卜硫素形成。本研究中，與對照相比，藍光處理顯著提高甘藍芽苗菜中異硫氰酸酯的形成（p＜0.05），兩種芽苗菜均在光周期8 h/d時異硫氰酸酯含量最高，分別是對照處理的1.51倍和1.41倍，與硫苷變化趨勢不同，表明藍光光周期也調(diào)控了硫苷的降解途徑，但機理有待進一步研究。

3 結論

本研究發(fā)現(xiàn)藍光雖然抑制甘藍芽苗菜的生長，但活性物質(zhì)抗壞血酸、花色苷、硫代葡萄糖苷和異硫氰酸酯含量明顯提高。隨著藍光光周期增加，抗壞血酸含量先增加后降低，2種芽苗菜在光周期為12 h/d～20 h/d，抗壞血酸含量相對較高?；ㄉ蘸侩S著光周期增加先增加并逐漸趨于平緩，“紫紅鉆”芽苗菜顯著高于“新夏50”芽苗菜。2種甘藍芽苗菜中硫代葡萄糖苷含量均在光周期12 h/d～16 h/d達到最高。雖然“新夏50”芽苗菜中硫苷含量明顯高于“紫紅鉆”芽苗菜，但異硫氰酸酯相反，“紫紅鉆”芽苗菜中異硫氰酸酯明顯高于“新夏50”，且均在藍光光周期8 h/d時相對較高。綜合考慮，藍光光周期12 h/d～16 h/d更適合甘藍芽苗菜的培育，且“紫紅鉆”芽苗菜比“新夏50”營養(yǎng)價值更高。本研究為藍光在甘藍芽苗菜的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論支撐，為我國甘藍芽苗菜產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供科學依據(jù)。