郭雅嫻，李姿坤，張喜瑞，張滿，梁彬，姬長(zhǎng)建，孫嬋嬋*

（1.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003；2.魯東大學(xué)食品工程學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264001；3.齊魯師范學(xué)院物理與電子工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250200）

乳清濃縮蛋白是牛奶中蛋白質(zhì)的一種，乳清濃縮蛋白中含有α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳鐵蛋白、生長(zhǎng)因子[1]等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有蛋白質(zhì)功效比值高、易被人體消化吸收等特點(diǎn)，是一種國(guó)際公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)人體蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑。此外，乳清濃縮蛋白還具有良好的乳化性、水合性、凝膠性、起泡性等，常作為乳化劑及發(fā)泡劑等應(yīng)用在食品工業(yè)中。

近年來，為了增強(qiáng)蛋白質(zhì)界面性質(zhì)，常用的改性方法主要包括化學(xué)改性、物理改性、生物改性。物理改性通常是指利用機(jī)械方法，如球磨、高壓均質(zhì)等對(duì)物質(zhì)進(jìn)行破碎以減小其顆粒尺寸。與化學(xué)改性相比，物理改性操作簡(jiǎn)單，不會(huì)產(chǎn)生污染性廢液。微?；夹g(shù)和納米粉碎都屬于物理改性方法。

納米粉碎可以顯著改變?cè)牧系拇笮?、結(jié)構(gòu)和比表面積等，能夠使物質(zhì)界面性質(zhì)得到增強(qiáng)，是近年來迅速發(fā)展形成的一種新興的高科技工業(yè)技術(shù)，目前被廣泛應(yīng)用于食品[3]、化妝品、醫(yī)療等領(lǐng)域。

微?；夹g(shù)是通過熱處理將蛋白質(zhì)變成一種凝膠狀態(tài)，再經(jīng)過高速剪切等操作使蛋白質(zhì)形成微凝膠顆粒。微凝膠顆粒是指粒徑大小在10 nm～1 000 nm之間的膠體分散體系，粒子具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和在溶劑中溶脹的性質(zhì)，具有穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，其尺寸小，比表面積大，表面有很多懸掛鏈段[2]，所以能夠不可逆地被吸附在相界面上，增強(qiáng)食品多相體系的穩(wěn)定性。

為進(jìn)一步擴(kuò)展乳清濃縮蛋白在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用，解決國(guó)內(nèi)蛋白質(zhì)微凝膠顆粒粒徑大、粒徑分布不集中、制備能耗高等問題，本文以乳清濃縮蛋白為對(duì)照，考察納米粉碎對(duì)乳清濃縮蛋白（whey protein concentrate，WPC）和乳清濃縮蛋白微凝膠顆粒（whey protein concentrate micro-gel particles，WPM） 多尺度結(jié)構(gòu)和界面性質(zhì)的影響，為蛋白質(zhì)微凝膠顆粒的制備和高效應(yīng)用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清濃縮蛋白粉（蛋白質(zhì)含量80%）：新西蘭恒天然公司；大豆油：益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司；磷酸鹽緩沖溶液（色譜純）：北京伊諾凱科技有限公司；氯化鈉（色譜純）：煙臺(tái)博納實(shí)驗(yàn)器材有限公司；甘氨酸：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；三羥甲基氨基甲烷[tris-（hydroxymethyl）-aminomethane，Tris]：美國(guó)Genview公司；5，5'-二硫代-2-硝基苯甲酸：上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CJM-SY-B型高能納米磨：中國(guó)秦皇島太極環(huán)納米產(chǎn)品有限公司；SY-2-6電熱恒溫水浴鍋：天津市歐諾儀器有限公司；Ultra-Turrax T25高速乳化剪切機(jī)：德國(guó)IKA公司；LC-20AT高效液相色譜儀、RF-20A紫外檢測(cè)器：日本島津公司；FL-2500熒光分光光度計(jì)：日本日立集團(tuán)；MS-DWS光學(xué)微流變分析儀、Turbiscan ASG靜態(tài)多散射穩(wěn)定性分析儀：法國(guó)Formulaction公司；CKX41倒置熒光顯微鏡：日本Olympus有限責(zé)任公司；BT-2001激光粒度分布儀：丹東百特儀器有限公司；T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳清濃縮蛋白的納米粉碎預(yù)處理

將1 kg乳清濃縮蛋白粉加入到高能納米磨的研磨槽中，按照質(zhì)量比6∶1加入研磨球。為了防止蛋白質(zhì)的熱變性，研磨槽中工作溫度采用冷卻循環(huán)系統(tǒng)，控制在35℃以下。將納米粉碎4 h和8 h的乳清濃縮蛋白樣品分別命名為sWPC-4h和sWPC-8h。

1.3.2 乳清濃縮蛋白微凝膠顆粒的制備

采用微?；夹g(shù)制備乳清濃縮蛋白微凝膠顆粒。具體操作流程和技術(shù)參數(shù)：分別將WPC、sWPC-4h和sWPC-8h各12 g均勻分散于100 mL去離子水中，85℃處理30 min，4℃陳化10 h，10 000 r/min高速均質(zhì)處理10 min。

WPM、sWPM-4h和 sWPM-8h分別為以 WPC、sWPC-4h和sWPC-8h為原料制備的微凝膠顆粒樣品。

1.3.3 納米粉碎對(duì)乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒粒徑的影響

以去離子水為分散介質(zhì)，采用激光粒度分布儀對(duì)乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒的粒徑進(jìn)行測(cè)定：將樣品添加到裝有800 mL去離子水的攪拌式測(cè)量池中，為了避免蛋白質(zhì)的多重散射效應(yīng)，保證測(cè)量的準(zhǔn)確性，遮光度應(yīng)達(dá)到10%～15%[4]。每個(gè)不同處理方式的樣品均測(cè)量3次[5]，取平均值。

1.3.4 納米粉碎對(duì)乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒分子量的影響

采用高效液相色譜儀檢測(cè)各蛋白質(zhì)樣品分子量。色譜條件[6]：LC-20AT高效液相色譜儀和RF-20A紫外檢測(cè)器組成的高效液相系統(tǒng)；分析柱為Biosep-SECS4000；洗脫液為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH6.7）；流速0.6 mL/min。洗脫液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，超聲脫氣。將10 mg/mL樣品溶液以10 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.45 μm水相過濾器過濾，上樣量20 μL，采用恒流洗脫。

1.3.5 納米粉碎對(duì)乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒游離巰基含量的影響

參考劉鑫碩[7]的Ellman試劑分析方法，并稍作改動(dòng)，稱取樣品各50 mg，加入8 mL Tris-甘氨酸緩沖液，充分溶解，8 000 r/min離心10 min。量取1 mL上清液，加入2 mL Tris-甘氨酸緩沖液，0.02 mL Ellman試劑，充分混勻，室溫反應(yīng)25 min，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定412 nm處吸光度。

1.3.6 納米粉碎對(duì)乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒內(nèi)源性熒光光譜的影響

將乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒進(jìn)行冷凍干燥處理，將凍干粉溶解于5mmol/L的磷酸鹽緩沖液中，配制濃度為0.05mg/mL蛋白質(zhì)待測(cè)液，將pH值調(diào)至7備用。設(shè)置熒光分光光度計(jì)的激發(fā)波長(zhǎng)為295nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫距離為5nm[8]，掃描波長(zhǎng)范圍為300nm～400 nm。

1.3.7 O/W型乳液的制備

取適量 WPC、sWPC-4h、sWPC-8h、WPM、sWPM-4h、sWPM-8h分別與大豆油混合，置于50 mL離心管中，12 000 r/min高速乳化均質(zhì)處理3 min，即得到含油量為40%的O/W型乳液。

1.3.8 乳液微流變特性的測(cè)定

光學(xué)微流變分析儀是基于多散斑擴(kuò)散光譜（multi-speckle diffusing wave spectroscopy，MS-DWS） 技術(shù)測(cè)定乳液微流變特性。光束照射到乳液中懸浮的油滴時(shí)發(fā)生多次散射[9]，散射后的光被含有軌跡分析程序的圖像處理系統(tǒng)接收并進(jìn)行分析，得到散斑圖像[10]。對(duì)每個(gè)油滴的位移分析后，繪制其均方位移曲線，進(jìn)而計(jì)算得到微流變特性。

取20 mL乳液樣品于測(cè)試瓶（平底圓柱形玻璃管，高140 mm，直徑16 mm）中，然后測(cè)定各乳液的黏性、彈性、固液平衡值和流動(dòng)性指數(shù)。

1.3.9 乳液穩(wěn)定性的測(cè)定

采用靜態(tài)多散射穩(wěn)定性分析儀對(duì)乳液的穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定，采用脈沖近紅外光源（波長(zhǎng)880 nm）自下而上掃描樣品[11]，兩個(gè)光學(xué)探測(cè)器分別同步搜集透射光（transmission，TM）和背散射光（backscattering，BS）。在一定時(shí)間連續(xù)掃描樣品，獲得透射光與背散射光信號(hào)對(duì)樣品高度的函數(shù)曲線圖，即可反映出樣品中顆粒運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)，進(jìn)而預(yù)測(cè)出乳液的穩(wěn)定性[12]。由于乳液均呈現(xiàn)白色不透明狀，樣品透射光量較小，本測(cè)定中主要選用背散射光強(qiáng)。

取20 mL乳液樣品于測(cè)試瓶（平底圓柱形玻璃管，高140 mm，直徑16 mm）中，在室溫（25℃）下每2 h掃描1次，連續(xù)掃描24 h。

1.3.10 乳液微觀形態(tài)的觀察

取少量乳液樣品置于載玻片上，小心蓋上蓋玻片，避免氣泡的產(chǎn)生。采用倒置熒光顯微鏡（400倍）進(jìn)行觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米粉碎對(duì)乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒粒徑的影響

納米粉碎對(duì)乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒粒徑分布的影響見圖1。

圖1 納米粉碎對(duì)乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒粒徑分布的影響Fig.1 Effect of nano grinding on particle size distribution of WPC and WPM

由圖1可知，經(jīng)過納米粉碎的乳清濃縮蛋白微凝膠顆粒的粒徑分布更加集中，有效粒徑的范圍和占比更大；各樣品粒徑分布均呈現(xiàn)正態(tài)分布，因此可以采用中位粒徑表征粒徑大小。

將各樣品中位粒徑進(jìn)行匯總，結(jié)果見表1。

表1 納米粉碎對(duì)乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒中位粒徑的影響Table 1 Effect of nano grinding on median particle size of WPC and WPM

由表1可知，納米粉碎和微?；夹g(shù)處理均可以顯著降低乳清濃縮蛋白的中位粒徑（p＜0.05）。且隨著納米粉碎時(shí)間的延長(zhǎng)，中位粒徑隨之減小（p＜0.05）。說明納米粉碎和微?；夹g(shù)均破壞了蛋白質(zhì)分子間的作用力，減小了蛋白質(zhì)的尺寸。

2.2 納米粉碎對(duì)乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒分子量的影響

乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒的高效液相色譜見圖2。

圖2 乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒的高效液相色譜圖Fig.2High performance liquid chromatograms of WPC and WPM

由圖2可知，WPC在11、22、24 min附近分別洗脫出了3種物質(zhì)，查閱文獻(xiàn)可知[13]，峰1為牛血清白蛋白，峰2為β-乳球蛋白，峰3為α-乳白蛋白。與色譜圖對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間和峰面積數(shù)據(jù)如表2所示。

表2 納米粉碎對(duì)WPC及WPM的保留時(shí)間與峰面積的影響Table 2 Effect of nano grinding on retention time and area of peaks of WPC and WPM

由表2可知，經(jīng)過納米粉碎處理后的乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒出峰時(shí)間無明顯變化，說明蛋白質(zhì)的分子量無明顯差異。經(jīng)納米粉碎后，sWPC-4h和sWPC-8h的峰1、峰2和峰3的峰面積均大于WPC，且隨納米粉碎處理時(shí)間的延長(zhǎng)總體呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)。這可能是由于納米粉碎破壞了蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致牛血清白蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白在流動(dòng)相中的溶解性增加。

WPM中未洗脫出峰1，可能是由于蛋白質(zhì)變性形成不溶性聚集物，在流動(dòng)相中溶解度降低，低于檢測(cè)限。與WPM相比，sWPM-4h、sWPM-8h峰3的面積增加是因?yàn)棣?乳白蛋白為一種鈣離子結(jié)合蛋白，在經(jīng)過納米粉碎后，鈣離子仍緊密結(jié)合在蛋白質(zhì)上，導(dǎo)致其有較高的熱穩(wěn)定性。

2.3 納米粉碎對(duì)乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒游離巰基含量的影響

游離巰基含量的變化會(huì)影響蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)[14]。納米粉碎對(duì)乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒游離巰基含量的影響見表3。

表3 納米粉碎對(duì)乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒游離巰基含量的影響Table 3 Effect of nano grinding on the content of free sulfhydryl groups in WPC and WPM

由表3可以看出，納米粉碎和微?；夹g(shù)處理均降低了乳清濃縮蛋白的游離巰基含量，這可能是由于納米粉碎和微?；夹g(shù)將大顆粒蛋白破碎成小顆粒的過程中，原本被埋藏在分子內(nèi)部的游離巰基暴露而被氧化成二硫鍵，這使得蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)更為緊密。結(jié)合高效液相色譜結(jié)果，蛋白質(zhì)分子量并無明顯差異，說明樣品經(jīng)過納米粉碎后，其一級(jí)結(jié)構(gòu)并未受到破壞，說明二硫鍵的形成是在分子內(nèi)，而不是在分子間。

2.4 納米粉碎對(duì)乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒內(nèi)源性熒光光譜的影響

6種樣品的內(nèi)源性熒光光譜見圖3。

圖3 納米粉碎對(duì)乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒內(nèi)源性熒光光譜的影響Fig.3 Effect of nano grinding on endogenous fluorescence spectra of WPC and WPM

由圖 3 可知，WPC、sWPC-4h、sWPC-8h、WPM、sWPM-4h、sWPM-8h的最大吸收波長(zhǎng)（λmax） 分別為333、334、336、337、338、339 nm。說明納米粉碎和微粒化處理后的乳清濃縮蛋白及其微凝膠顆粒的λmax均出現(xiàn)不同程度的紅移。表明納米粉碎和微粒化技術(shù)處理，使得原本在WPC內(nèi)部的酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等疏水性發(fā)色基團(tuán)暴露出來，蛋白質(zhì)的表面疏水性發(fā)生改變。而蛋白質(zhì)多尺度結(jié)構(gòu)的改變會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致其功能性質(zhì)的改變，如界面性質(zhì)等。

2.5 乳液的微流變特性

采用光學(xué)微流變分析儀測(cè)定各乳液的微流變特性，結(jié)果如圖4、圖5所示。

圖4 各乳液的彈性和黏性測(cè)定結(jié)果Fig.4 Elasticity index and viscosity index of emulsions

圖5 乳液的固液平衡值和流動(dòng)性指數(shù)測(cè)定結(jié)果Fig.5 Solid-liquid balance and fluidity index

由圖4可知，在考察時(shí)間內(nèi)，微凝膠顆粒乳液的黏性和彈性均大于乳清濃縮蛋白乳液。其中，sWPM-8h乳液具有最強(qiáng)的黏性和彈性，呈現(xiàn)出典型黏彈性流體特性。由圖4a可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，sWPC-4h乳液的彈性逐漸大于WPC，sWPM-4h乳液的彈性逐漸接近于WPM；由圖4b可知sWPC-8h乳液的黏性略高于sWPC-4h和WPC。

天然乳清濃縮蛋白是球蛋白，疏水基團(tuán)內(nèi)埋[15]，使得其在乳液中與油的作用相對(duì)較弱。由以上可知，經(jīng)過納米粉碎預(yù)處理可使蛋白質(zhì)和油結(jié)合更加緊密，這使得乳液的黏性和彈性均得到增強(qiáng)。

固液平衡值（solid-liquid balance，SLB）表征了樣品的相態(tài)：SLB=0.5說明樣品內(nèi)部達(dá)到固液平衡，即不呈現(xiàn)典型的固體相態(tài)或液體相態(tài)；當(dāng)0＜SLB＜0.5時(shí)，說明樣品呈現(xiàn)固態(tài)主導(dǎo)的相態(tài)（凝膠態(tài)），且該數(shù)值越小，說明樣品呈現(xiàn)越典型的凝膠態(tài)特征；而如果0.5＜SLB＜1.0說明樣品呈現(xiàn)液體主導(dǎo)的相態(tài)（流態(tài)），且數(shù)值越大說明樣品的流動(dòng)性越大[16]。

由圖 5可以看出，WPC、sWPC-4h、sWPC-8h 3 個(gè)樣品制備的乳液的SLB均大于0.5，呈現(xiàn)出流體特性。sWPM-4h和sWPM-8h制備的乳液的SLB值都小于0.5，說明均呈現(xiàn)類固體的凝膠態(tài)。這可能是因?yàn)閟WPM-4h和sWPM-8h中親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)的分布比例適中，能夠很好地在水油界面保持穩(wěn)定，形成較小的油滴，從而形成結(jié)構(gòu)致密的乳液[17-18]。圖5顯示，WPC和sWPC-4h乳液流動(dòng)性指數(shù)較大且較為接近，sWPC-8h、WPM、sWPM-4h、sWPM-8h次之。說明納米粉碎能夠提高乳清濃縮蛋白的界面性質(zhì)。

2.6 乳液貯藏穩(wěn)定性分析

圖6展示了各乳液的背散射光強(qiáng)隨著時(shí)間的變化情況。

圖6 乳液背散射光強(qiáng)隨著時(shí)間的改變Fig.6 Back-scattering light profile in the function of test tube height for emulsions

WPC、sWPC-4h和sWPC-8h乳液在室溫下貯藏過程中，樣品的底部均出現(xiàn)了蛋白質(zhì)沉淀，但是并沒有出現(xiàn)油的析出。這是由于部分蛋白質(zhì)與油滴結(jié)合形成密度小于連續(xù)相的聚集體[19-20]，在貯藏過程中向頂部移動(dòng)，而未與油滴結(jié)合的蛋白質(zhì)則快速向底部移動(dòng)，表現(xiàn)為沉淀的發(fā)生[21-22]。WPM和sWPM-4h乳液的上層均出現(xiàn)了油的析出。這是由于此時(shí)乳液中油滴過多，蛋白質(zhì)覆蓋率不足，油相暴露，油滴為趨于穩(wěn)定會(huì)和鄰近油滴共用蛋白質(zhì)，從而導(dǎo)致絮凝。由于密度較小，油滴聚集后會(huì)快速向頂部移動(dòng)，表現(xiàn)為頂層析出。由圖6可以看出，sWPM-8h乳液整體的背散射光強(qiáng)比較穩(wěn)定，沒有明顯變化，展示了極高的貯藏穩(wěn)定性。

2.7 乳液的微觀結(jié)構(gòu)觀察

在蛋白質(zhì)分子中，色氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸3個(gè)氨基酸殘基均能夠發(fā)射熒光[23]。采用倒置熒光顯微鏡觀察各乳液的微觀結(jié)構(gòu)，經(jīng)特定濾光片，會(huì)看到蛋白質(zhì)樣品呈現(xiàn)明黃色，如圖7所示。

圖7 乳液的微觀結(jié)構(gòu)Fig.7 Microstructure of emulsions

由圖7可以看出，油滴在乳液中均能夠以圓形液滴均勻存在。乳液中蛋白質(zhì)吸附在油水界面上，它能降低兩相的界面張力，促進(jìn)乳液形成，并且還能形成一層保護(hù)膜，保護(hù)油滴不被破壞，使乳液處于穩(wěn)定狀態(tài)。

相同含油量的乳液油滴由大到小依次為WPC、sWPC-4h、sWPC-8h、WPM、sWPM-4h、sWPM-8h。結(jié)合微觀結(jié)構(gòu)觀察和穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，油滴的大小與穩(wěn)定性成反比，這與Sun等[24]研究結(jié)果一致，表明乳液油滴粒徑的減小增加了乳液的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

納米粉碎可以顯著減小WPC和WPM的粒徑，且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，粒徑隨之減小，其中sWPM-8h粒徑最小。此外，納米粉碎后，WPM粒徑分布的集中程度得到增強(qiáng)。納米粉碎和微粒化技術(shù)處理后，蛋白質(zhì)分子量并無明顯差異。WPC和WPM的游離巰基含量減少，證明了分子內(nèi)二硫鍵的形成，這有利于蛋白質(zhì)的緊密空間結(jié)構(gòu)的形成。WPC和WPM的最大吸收波長(zhǎng)出現(xiàn)紅移，說明納米粉碎和微粒化技術(shù)增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的表面疏水性。經(jīng)納米粉碎和微粒化處理后，乳液黏彈性和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性整體上增強(qiáng)，固液平衡值整體上降低，乳液油滴大小減小。其中，sWPM-8h乳液具有最強(qiáng)的黏性和彈性、較小的固液平衡值、最小的流動(dòng)性指數(shù)和最高的貯藏穩(wěn)定性。以上結(jié)果說明納米粉碎和微?；夹g(shù)能夠改善乳清濃縮蛋白的界面性質(zhì)。