趙原,金艷,張民
(天津科技大學(xué)食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室食品科學(xué)與工程學(xué)院,天津 300457)
小麥作為我國重要的糧食作物,其加工副產(chǎn)物小麥胚芽約占小麥籽粒的3%,其蛋白質(zhì)含量約30%,具有明顯的資源優(yōu)勢和營養(yǎng)價值[1]。然而,目前小麥胚芽主要作為飼料廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè),產(chǎn)品附加值較低,造成了極大的資源浪費(fèi)[2]。
活性肽一般含有2個~20個氨基酸,分子量小于6 000 Da,具有良好的生物活性,包括抗氧化、抗高血壓、抗血栓、抗菌和抗炎作用等[3-4]。與傳統(tǒng)藥物相比,活性肽具有易吸收、低毒、高效的競爭優(yōu)勢,在制藥領(lǐng)域有非常好的應(yīng)用前景。目前常用的制備方法包括發(fā)酵和酶解。同時,肽類物質(zhì)也具有一定的食品風(fēng)味特性,如呈鮮和增甜。從食物蛋白中提取或者通過氨基酸合成得到的分子量低于3 000 Da的呈味肽,因在天然食品以及加工食品中產(chǎn)生鮮明的特征滋味而引起人們的廣泛關(guān)注,已有多項研究從禽畜肉類、水產(chǎn)品、豆類等各種食物中制備獲得呈味肽[5]。相比于傳統(tǒng)的調(diào)味劑,呈味肽具有低熱量、天然健康的特性,具有非常好的開發(fā)前景和應(yīng)用價值。因此,本研究以脫脂麥胚為原料,將風(fēng)味與營養(yǎng)相統(tǒng)一,研究和開發(fā)具有生物活性的麥胚風(fēng)味肽,為提高小麥副產(chǎn)物綜合利用附加值、提升糧食資源綜合利用率提供新的思路,具有廣闊的市場前景和研究價值。
脫脂小麥胚芽(蛋白含量約為30%):河南省鯤華生物技術(shù)有限公司。
風(fēng)味蛋白酶(食品級):諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司;濃鹽酸、濃硫酸(均為分析純):天津市化學(xué)試劑一廠;無水乙醇、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀(均為分析純):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH):美國Sigma公司;2,2'-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽[2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt,ABTS]:上海麥克林生化科技有限公司;草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、抑菌酶、桿菌肽、乙氨酰-乙氨酰-乙氨酸(標(biāo)準(zhǔn)品):北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;5'-尿嘧啶核苷酸、5'-鳥嘌呤核苷酸、5'-次黃嘌呤核苷酸、5'-腺嘌呤核苷酸(標(biāo)準(zhǔn)品):壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。
電子分析天平(AB204-N):上海精科實(shí)業(yè)有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9070MBE):上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋(XMTD-204):天津歐諾儀器儀表有限公司;pH計(DHSJ-3F):上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;酶標(biāo)儀(Synergy HTX):美國伯騰儀器有限公司;氨基酸分析儀(L 8900):日立公司;氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(ISQ 7000)、真空冷凍干燥機(jī)(MODULYOD-230):賽默飛世爾科技公司;離心機(jī)(TDZ5-WS):長沙湘儀離心機(jī)儀器制造有限公司。
1.3.1 酶解麥胚單因素試驗(yàn)
以脫脂小麥胚芽粉為原料,用磷酸鹽緩沖溶液配制一定底物濃度的麥胚溶液,磁力攪拌器調(diào)漿5min,95℃水浴10 min后冷卻至酶解溫度,加入風(fēng)味蛋白酶,酶解3 h。經(jīng)90℃水浴滅酶15 min后離心(3 500 r/min、20 min),上清液冷凍干燥后備用。參考張玲等[6]的方法配制雙縮脲試劑測定酶解物中肽含量,并計算麥胚肽得率。單因素試驗(yàn)設(shè)計如下。
固定酶解溫度為50℃,酶添加量4%,底物濃度4%,以麥胚肽得率為指標(biāo),選取酶解pH值為4、5、6、7、8,考察酶解pH值對酶解制備麥胚肽的影響。
固定酶解pH值為6,酶添加量4%,底物濃度4%,以麥胚肽得率為指標(biāo),選取酶解溫度30、40、50、60、70℃,考察酶解溫度對酶解制備麥胚肽的影響。
固定酶解pH值為6,酶解溫度為50℃,底物濃度4%,以麥胚肽得率為指標(biāo),選取酶添加量2%、3%、4%、5%、6%,考察酶添加量對酶解制備麥胚肽的影響。
固定酶解pH值為6,酶解溫度為50℃,酶添加量4%,以麥胚肽得率為指標(biāo),選取底物濃度2%、3%、4%、5%、6%,考察底物濃度對酶解制備麥胚肽的影響。
1.3.2 感官品評
將酶解物配制為10 mg/mL樣液并經(jīng)121℃滅菌20 min,選擇經(jīng)過培訓(xùn)的10名感官評定員(5男5女,年齡20歲~30歲)組成感官評定小組對其進(jìn)行品評,感官評分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。
表1 感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standard of sensory evaluation
1.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定
參考孫浩然[7]的方法,選擇頂空固相微萃取技術(shù)對酶解物氣味進(jìn)行收集,再利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行鑒定。
1.3.4 游離氨基酸含量的測定
參考吳陽[8]的方法稍作改動,稱取適量樣品充分溶解于超純水后與10%磺基水楊酸以3∶1的體積比混勻,于4℃下靜置1 h后反復(fù)低溫離心(10 000 r/min,10 min),取上清液,經(jīng)0.22 μm水膜過濾后上機(jī)進(jìn)行測定。
1.3.5 呈味核苷酸含量的測定
參考呂麗等[9]的方法,稍作改動,采用高效液相色譜法,色譜條件:色譜柱為ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(pH4.6)與甲醇的體積比97∶3;柱溫30℃;進(jìn)樣量20μL;檢測波長254 nm;流速0.6 mL/min。樣品經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣測定,同時利用標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間及峰面積做線性回歸方程。
1.3.6 有機(jī)酸含量的測定
參考GB 5009.157—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中有機(jī)酸的測定》[10],采用高效液相色譜法進(jìn)行有機(jī)酸的測定。
1.3.7 肽分子量分布的測定
參考張佳男[11]的方法,稍作改動,采用高效液相色譜法,色譜條件:TSK-gel 2000 SWXL色譜柱(7.8 mm×30 cm);流動相為乙腈-水-三氟乙酸體積比20∶80∶0.1;柱溫30 s;流速0.5 mL/min。進(jìn)樣前用0.22 μm微孔濾膜過濾。以標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間和相對分子質(zhì)量的對數(shù)做線性回歸方程。
1.3.8 超濾分離
將酶解物配制成一定濃度的溶液,依次使用截留量為10000Da和3000Da的超濾管,然后以8000 r/min在4℃下離心15 min,收集各組分濾液,-80℃冷凍干燥,保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.9 DPPH自由基清除能力的測定
參考Wang等[12]的方法,取一定體積的不同濃度樣品水溶液,加入等體積0.1 mmol/L DPPH的無水乙醇溶液,混勻,室溫避光反應(yīng)30 min后在517 nm處測得各吸光度,以相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸做對照試驗(yàn)。DPPH自由基清除率用以下公式計算。
式中:A為樣品+0.1 mmol/L DPPH無水乙醇溶液的吸光度;A0為樣品+無水乙醇溶液的吸光度;A1為水+0.1 mmol/L DPPH無水乙醇溶液的吸光度;A2為水+無水乙醇溶液的吸光度。
1.3.10 ABTS+自由基清除能力的測定
參考Chen等[13]的方法,將等體積7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液混勻,室溫避光反應(yīng)12 h~16 h后取一定體積混合液經(jīng)無水乙醇稀釋得到ABTS工作液,使其室溫避光放置30 min后在734 nm處的吸光度為0.70±0.02。取40 μL待測液和160 μL ABTS工作液于96孔酶標(biāo)板反應(yīng),測定其在734 nm處的吸光度,以相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸做對照試驗(yàn)。ABTS+自由基清除率用以下公式計算。
式中:A0為水+ABTS工作液的吸光度;A1為樣品+ABTS工作液的吸光度;A2為樣品+水的吸光度。
1.3.11 羥自由基清除能力的測定
參考朱楚楚[14]的方法,依次向試管中加入1.0 mL 6.0 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液、1.0 mL 6 mmol/L的硫酸亞鐵溶液和1.0 mL樣品溶液,最后加1.0 mL 6 mmol/L的過氧化氫溶液啟動反應(yīng),搖勻后在37℃水浴反應(yīng)30 min,測定其在510 nm波長處的吸光度,以相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸做對照試驗(yàn)。羥自由基清除率用以下公式計算。
式中:A0為硫酸亞鐵+過氧化氫+水+水楊酸的吸光度;A1為硫酸亞鐵+過氧化氫+樣品+水楊酸的吸光度;A2為硫酸亞鐵+水+樣品+水楊酸的吸光度。
1.3.12 還原力的測定
參考趙寒青[15]的方法,取不同濃度的樣品溶液各1 mL,依次加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH6.6)和2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的亞鐵氰化鉀溶液,渦旋30 s,在50℃水浴條件下反應(yīng)20 min,迅速冷卻后加入2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸溶液終止反應(yīng),混勻離心(3 000 r/min,10 min),取上清液 2.5 mL于試管,加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化鐵溶液后再次混勻,室溫避光放置10 min后于700 nm處測其吸光度,以相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸做對照試驗(yàn)。
所有試驗(yàn)平行進(jìn)行3次,試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用Origin 2019b、GraphPad Prism 8和IBM SPSS Statistics 26進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表繪制。
2.1.1 酶解pH值對麥胚肽得率和風(fēng)味的影響
酶解pH值對麥胚肽得率和風(fēng)味的影響如圖1所示。
圖1 酶解pH值對麥胚肽得率和風(fēng)味的影響Fig.1 Effects of pH value of enzymatic hydrolysis on the yield and flavor of wheat germ peptides
在不同酶解pH值條件下利用風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行麥胚酶解,麥胚肽得率有顯著差異,隨著酶解pH值的提高,肽得率呈現(xiàn)一個先上升后趨于平緩的趨勢,在pH值為7時達(dá)到最大,此時麥胚肽得率為(6.11±0.14)%。同時,感官評分結(jié)果表明,酶解pH值的改變對酶解物的咸味和香味有一定影響,且均無異味產(chǎn)生,這可能是由于酶解pH值影響美拉德反應(yīng)程度的不同從而生成不同風(fēng)味物質(zhì)。當(dāng)酶解pH值為7時呈現(xiàn)一定的咸鮮風(fēng)味和較好的香氣,因此選擇酶解pH7為最佳。
2.1.2 酶解溫度對麥胚肽得率和風(fēng)味的影響
酶解溫度對麥胚肽得率和風(fēng)味的影響如圖2所示。
圖2 酶解溫度對麥胚肽得率和風(fēng)味的影響Fig.2 Effects of enzymatic hydrolysis temperature on the yield and flavor of wheat germ peptides
當(dāng)酶解溫度由30℃升高到70℃,麥胚肽得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,在50℃時達(dá)到最大。其原因可能是風(fēng)味蛋白酶活性在30℃~50℃范圍內(nèi)隨著溫度的升高而提高,蛋白水解度逐漸上升,而當(dāng)溫度大于60℃時酶活受到抑制導(dǎo)致水解度下降。結(jié)合感官評分結(jié)果,酶解溫度在50℃和60℃時酶解物表現(xiàn)出較好的香氣和鮮味,因此選擇50℃為最佳酶解溫度。
2.1.3 酶添加量對麥胚肽得率和風(fēng)味的影響
酶添加量對麥胚肽得率和風(fēng)味的影響如圖3所示。
圖3 酶添加量對麥胚肽得率和風(fēng)味的影響Fig.3 Effects of enzyme addition on the yield and flavor of wheat germ peptides
隨著蛋白酶添加量的增大,麥胚肽得率不斷提高,當(dāng)酶添加量大于4%時,麥胚肽得率有所下降并逐漸趨于平緩,可能是反應(yīng)中的酶達(dá)到一定含量時,酶與底物的反應(yīng)過剩導(dǎo)致反應(yīng)速度變小,繼續(xù)增大酶添加量,反應(yīng)體系中的水解度的變化已經(jīng)不明顯。結(jié)合感官評分結(jié)果,在酶添加量介于3%~6%時,酶解物有一定的咸鮮風(fēng)味,其它味覺感官不突出,但整體呈現(xiàn)一定香氣。綜合上述情況,選擇4%為最佳酶添加量。
2.1.4 底物濃度對麥胚肽得率和風(fēng)味的影響
底物濃度對麥胚肽得率和風(fēng)味的影響如圖4所示。
圖4 底物濃度對麥胚肽得率和風(fēng)味的影響Fig.4 Effects of substrate concentration on the yield and flavor of wheat germ peptides
底物濃度過高,體系的流動性變差,使底物蛋白與酶分子之間的相互運(yùn)動減弱,降低底物蛋白與酶分子的碰撞概率,進(jìn)而反應(yīng)速度減慢;其次,體系中的底物蛋白會在酶的活性位點(diǎn)積累,形成無活性的中間產(chǎn)物,從而抑制水解反應(yīng)[16]。由圖4可以看到,隨著底物濃度的增加,多肽的得率呈現(xiàn)顯著下降的趨勢。同時,當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%時,鮮、咸味較為突出,其它味覺感官不突出,且呈現(xiàn)一定香氣。綜合上述情況,選擇2%為最佳底物濃度。
酶解物中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定結(jié)果如表2所示。
表2 酶解物中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定Table 2 Determination of volatile flavor substances in the hydrolysate
經(jīng)過對比特征揮發(fā)性化合物的保留時間和遷移時間,對酶解物的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行定性分析,得到27種化合物,其中包括5種醇類、2種醛類、2種酯類、3種酸類、1種酚類、1種酮類、11種烴類和2種雜環(huán)類,這些化合物構(gòu)成了酶解物的揮發(fā)性風(fēng)味輪廓。其中,烴類物質(zhì)的含量最高,其次是醇類和酸類。烴類化合物可能是由脂肪氧化降解產(chǎn)生的,且大部分烴類物質(zhì)香氣較弱或無氣味[17-18]。壓榨后,麥胚中的油脂不能完全去除,因此,醇類物質(zhì)可能是由于脫脂麥胚殘油中的不飽和脂肪酸被氧化酶氧化,再被裂解酶或氧化還原酶催化生成[19]。醇類一般具有令人愉悅的氣味,苯乙醇是我國規(guī)定允許使用的食用香料,具有清甜的玫瑰樣香氣。不飽和醇類的閾值較飽和醇低,對風(fēng)味貢獻(xiàn)大[20]。酸類物質(zhì)是酯類化合物合成的前體物質(zhì)之一,可以由氨基酸降解后通過氧化或還原作用產(chǎn)生,也可通過飽和脂肪酸自身氧化降解產(chǎn)生[21]。正己酸、乙酸和辛酸整體上表現(xiàn)出不愉快的香氣。除此之外,醛類和酯類物質(zhì)也為產(chǎn)物提供了較好的花果樣香氣。其中,醛類物質(zhì)主要來自脂肪的氧化分解或者美拉德反應(yīng),閾值較低,對氣味形成的貢獻(xiàn)較大[22-24]。酯類物質(zhì)由醇和羧酸酯化而成,通常為食物提供良好的香氣[25],如γ-壬內(nèi)酯有濃郁椰子香氣,常用于調(diào)配食用香精。
酶解物中游離氨基酸含量如表3所示。
表3 酶解物中游離氨基酸的含量Table 3 Content of free amino acids in the hydrolysate
氨基酸間的相互作用對酶解物的風(fēng)味有一定的影響[19]。根據(jù)對游離氨基酸滋味特征的描述,游離氨基酸呈味特征以鮮味、甜味、苦味為主[26],對酶解物中的游離氨基酸的含量進(jìn)行測定,可以發(fā)現(xiàn)鮮味氨基酸和甜味氨基酸的含量遠(yuǎn)低于其閾值,苦味氨基酸中尤其以精氨酸的含量較高,達(dá)到10.132 mg/g,這可能是由于過度的酶解,肽中的疏水性氨基酸逐漸暴露在側(cè)鏈的外面,是酶解物呈苦味的原因之一[19]。
酶解物中呈味核苷酸含量如表4所示。
表4 酶解物中呈味核苷酸的含量Table 4 Content of flavoring nucleotides in the hydrolysate
呈味核苷酸的含量與酶解物的風(fēng)味密切相關(guān),其中AMP、GMP和IMP是鮮味的重要貢獻(xiàn)者,并與游離氨基酸存在協(xié)同作用[27]。相關(guān)研究分析了酶解物中UMP、GMP、IMP、AMP的含量。GMP和IMP是主要的呈鮮味核苷酸,其閾值分別為0.2 mg/g和1.8 mg/g[28-29]。其中,在酶解物中檢出GMP含量為(0.143±0.026)mg/g。
酶解物中有機(jī)酸含量如表5所示。
表5 酶解物中有機(jī)酸的含量Table 5 Content of organic acids in the hydrolysate
有機(jī)酸是主要的酸味物質(zhì)成分,其酸性源于羧基,其含量和種類對產(chǎn)品的風(fēng)味特性起到非常重要的作用。有機(jī)酸會影響感官特性,不僅能通過自身酸味調(diào)節(jié)口腔對其它滋味的感知,又能通過影響體系pH值來調(diào)控滋味物質(zhì)之間的交互作用,從而影響消費(fèi)者對產(chǎn)品的接受程度[30-31]。有機(jī)酸可分為揮發(fā)酸和不揮發(fā)酸,不揮發(fā)酸包括酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸等。其中,酶解物中的酒石酸和琥珀酸的含量相對較高,是主要呈味有機(jī)酸。
鮮味作為第5種基本味覺,是由鮮味物質(zhì)與受體結(jié)合產(chǎn)生的味覺感受,根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異性,鮮味物質(zhì)可分為氨基酸及其鹽類、核苷酸類、有機(jī)酸類、肽類等[32]。琥珀酸及其鈉鹽作為有機(jī)酸類,被認(rèn)定屬于鮮味物質(zhì),貢獻(xiàn)了特殊的鮮味和酸味[33-34]。琥珀酸的閾值為10.6 mg/100 g,在不同的濃度下,琥珀酸會產(chǎn)生強(qiáng)烈的咸味和苦味[35]。
酶解物中肽分子量分布如表6所示。
表6 酶解物中肽分子量分布Table 6 Molecular weight distribution of peptides in the hydrolysate
酶解物中肽分子量主要分布在小于3 000 Da的部分,占總量的(63.93±1.23)%,其次是 3 000 Da~10 000 Da和大于10 000 Da的部分。有研究表明,呈味肽的分子量主要集中在3 000 Da以下[5],因此,后續(xù)試驗(yàn)重點(diǎn)研究部分是分子量小于3 000 Da的酶解物。
對分子量小于3000Da酶解物的DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、羥自由基清除率和還原力進(jìn)行測定,以抗壞血酸為陽性對照,結(jié)果如圖5~圖8所示。
圖5 DPPH自由基清除能力的測定Fig.5 Measurement of DPPH free radical scavenging ability
圖6 ABTS+自由基清除能力的測定Fig.6 Measurement of ABTS+free radical scavenging ability
圖7 羥自由基清除能力的測定Fig.7 Measurement of hydroxyl free radical scavenging ability
圖8 還原力的測定Fig.8 Determination of reducing power
在濃度為0.1 mg/mL~10.0 mg/mL時,分子量小于3 000 Da的酶解物的DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、羥自由基清除率和還原力都隨著濃度的增加而增加。其中,分子量小于3 000 Da的酶解物的DPPH自由基清除能力(IC50值為10.327 mg/mL)和還原力相對較弱,遠(yuǎn)低于同濃度下的抗壞血酸。在濃度為10.0 mg/mL時,分子量小于3 000 Da的酶解物對ABTS+自由基的清除能力只略低于抗壞血酸,分別為92.22%和99.67%,IC50值為0.448 mg/mL。相同濃度下,分子量小于3 000 Da的酶解物對羥自由基的清除能力也只略低于抗壞血酸,分別為95.51%和99.93%,IC50值為0.574 mg/mL??傮w而言,分子量小于3 000 Da的酶解物具有較好的體外抗氧化活性。
通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化風(fēng)味蛋白酶酶解麥胚制備風(fēng)味活性肽的工藝參數(shù),并對酶解物中風(fēng)味物質(zhì)含量、肽分子量分布及其體外抗氧化活性進(jìn)行了測定。結(jié)果表明,麥胚最佳酶解條件為pH7,底物濃度2%,酶解溫度50℃,酶添加量4%,此時麥胚肽得率達(dá)到(8.17±0.70)%。在此工藝條件下,酶解物中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)以烴類、酸類和醇類物質(zhì)為主,主要呈鮮物質(zhì)天冬氨酸的含量為0.936 mg/g,5'-鳥嘌呤核苷酸的含量為(0.143±0.026)mg/g,琥珀酸的含量為(18.75±2.45)mg/g,使酶解物整體表現(xiàn)出一定的咸鮮滋味并伴有清淡的香氣。同時,體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明分子量小于3 000 Da的酶解物的DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、羥自由基清除率的IC50值分別為 10.327、0.448、0.574 mg/mL,表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。綜上,本文所制備的麥胚酶解物兼具良好的風(fēng)味特性和抗氧化活性,為充分開發(fā)優(yōu)質(zhì)資源小麥胚芽,提高小麥副產(chǎn)品的市場化應(yīng)用,促進(jìn)營養(yǎng)健康食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供參考。