張賽男, 陳菲菲, 李 琳, 趙 莎, 王小康, 朱國強(qiáng), 朱曉芳

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225001; 2. 揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 皮膚科, 江蘇 揚(yáng)州, 225001;3. 大連醫(yī)科大學(xué), 遼寧 大連, 116044; 4. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225009)

銀屑病是一種由遺傳、環(huán)境共同作用誘發(fā)的免疫介導(dǎo)的慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性、系統(tǒng)性疾病，其中尋常型銀屑病是最常見的亞型，典型臨床表現(xiàn)為多發(fā)的鱗屑性紅斑，邊界清楚，周圍可有紅暈。銀屑病的發(fā)病機(jī)制研究[1]發(fā)現(xiàn)，炎癥性的細(xì)胞死亡在銀屑病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。細(xì)胞焦亡是由Gasdermin家族蛋白(GSDMs)介導(dǎo)的炎癥性的細(xì)胞程序性死亡，其發(fā)生過程中往往伴隨著炎癥因子表達(dá)的增多和機(jī)體炎癥水平的上調(diào)[2-3]。GSDMD是一種細(xì)胞膜穿孔蛋白，是焦亡的執(zhí)行蛋白，被炎性半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)切割為N端和C端，其N端結(jié)構(gòu)域可引發(fā)胞質(zhì)膜穿孔，細(xì)胞腫脹、裂解、死亡，導(dǎo)致白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-18等炎癥因子的釋放，誘導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)。然而GSDMD能夠介導(dǎo)IL-1β的釋放，卻不能介導(dǎo)IL-1β的成熟。經(jīng)典炎癥小體中的Caspase-1是IL-1β和IL-18的激活酶，可介導(dǎo)兩者的活化[4-6, 11]。本研究檢測(cè)進(jìn)行期尋常型銀屑病患者血清及皮損中焦亡關(guān)鍵因子Caspase-1的表達(dá)和銀屑病皮損中GSDMD、Gasdermin家族蛋白D-N端(GSDMD-N)表達(dá)情況，進(jìn)一步探討細(xì)胞焦亡在銀屑病發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象及樣本采集: 選取2020年4月—2021年10月在蘇北人民醫(yī)院皮膚科被診斷為進(jìn)行期尋常型銀屑病的20～50歲的30例患者為研究對(duì)象，并將其納入銀屑病組(PSO組，排除伴有其他疾病以及近期使用強(qiáng)效激素或免疫抑制劑治療的患者)，其中僅有20例患者同意進(jìn)行皮膚活檢獲取皮損，所有患者均同意收集血清。收集同時(shí)期在蘇北人民醫(yī)院體檢中心體檢的30例健康者的血清和整形外科20例健康求美者的皮膚組織(皮損)，并納入健康對(duì)照組(CON組)。研究對(duì)象均已簽署知情同意書，本研究已通過蘇北人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核。

1.1.2 樣品處理: 將收集的血清置于-80 ℃保存, 1個(gè)月內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。將2組收集的皮損分為2份, 1份置于10%中性福爾馬林4 ℃暫存, 1周內(nèi)進(jìn)行石蠟包埋、常溫保存，另1份立即液氮速凍并置于-80 ℃保存。

1.1.3 試劑及儀器: TRIzol Universal總RNA提取試劑及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京TIANGEN)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增試劑盒(南京Vazyme)、Caspase-1酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(武漢Elabscience)、Caspase-1抗體(英國Abcam)、二抗(常州Affinity)、GSDMD抗體(美國Proteintech)、GSDMD-N(美國Cell Signaling Technology)、DAB試劑盒(北京中杉金橋)、二步法試劑盒(北京中杉金橋)、蘇木素(Wellbio)、光學(xué)顯微鏡(motic)。

1.2 方法

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(qRT-PCR)檢測(cè)人血清Caspase-1mRNA表達(dá)情況。將血清室溫放至融化, 3 000轉(zhuǎn)/min離心1 min, 抽取上層血清，采用RNA提取試劑盒提取血清中的總RNA, 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)操作完全按照說明書進(jìn)行。在冰上配制PCR反應(yīng)液后進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng): 預(yù)變性95 ℃ 30 s, 進(jìn)行PCR循環(huán)(95 ℃、5 s, 60 ℃、40 s), 重復(fù)40個(gè)循環(huán)。引物及內(nèi)參序列見表1, 采用2-△△Ct公式進(jìn)行計(jì)算，分析Caspase-1mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物設(shè)計(jì)序列

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)人血清Caspase-1表達(dá)水平。將血清室溫放至融化, 3 000轉(zhuǎn)/min離心1 min, 抽取上層血清，嚴(yán)格按照Caspase-1酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒說明書檢測(cè)PSO組及CON組血清中Caspase-1表達(dá)水平。

采用蛋白質(zhì)印跡法(WB)檢測(cè)皮膚組織中Caspase-1蛋白表達(dá)情況。將皮膚組織從-80 ℃冰箱取出后加入適量液氮于研缽中進(jìn)行研磨，磨至粉末狀后加入100∶1的Ripa裂解液和PMSF溶液預(yù)混液(每10 mg皮損中加入40 μL預(yù)混液)，冰上提取組織總蛋白。采用二喹啉甲酸(BCA)法檢測(cè)蛋白濃度, 4∶ 1加入蛋白上樣緩沖液(5×), 95 ℃恒溫水浴鍋中加熱5 min, 收集上清，依次進(jìn)行配膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗(4 ℃過夜)、孵育二抗(室溫40 min)。采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)并用Image J軟件分析。

采用免疫組織化學(xué)(IHC)染色法檢測(cè)GSDMD、GSDMD-N表達(dá)情況。將石蠟包埋的皮膚組織脫蠟、水化、切片后熱修復(fù)抗原，將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH值為6.0)中連續(xù)煮20 min后，冷卻20 min后拿出，冷卻至室溫。加入1%高碘酸放置于室溫10 min, 以滅活內(nèi)源性酶。孵育一抗: 滴加適當(dāng)稀釋的一抗GSDMD(1∶ 50), GSDMD-N(1∶50), 4 ℃過夜。孵育二抗: 滴加50～100 μL二抗, 37 ℃孵育30 min, DAB顯色，采用蘇木素復(fù)染，各級(jí)乙醇(60%～100%)脫水。切片脫水后置于二甲苯中浸泡10 min, 重復(fù)2次，采用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。根據(jù)染色強(qiáng)度計(jì)分，以>50%細(xì)胞的染色情況計(jì)分，未染色為0分，淺黃色至黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。細(xì)胞染色陽性率: 顯微鏡下放大400倍情況下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算染色細(xì)胞的陽性率，取平均值。無陽性為0分, 1%～25%為1分, >25%～50%為2分, >50%～75%為3分, >75%為4分。根據(jù)細(xì)胞染色的深淺及染色率進(jìn)行綜合評(píng)分: 0分為陰性, 1～3分為弱陽性(+), 4～5分為陽性(), 6～7分為強(qiáng)陽性()。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 2組血清中Caspase-1 mRNA表達(dá)水平和Caspase-1蛋白表達(dá)水平

qRT-PCR結(jié)果顯示, PSO組血清中Caspase-1mRNA表達(dá)水平高于CON組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明, PSO組血清中Caspase-1蛋白表達(dá)水平高于CON組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 2組血清中Caspase-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量和Caspase-1蛋白表達(dá)水平比較

2.2 2組皮損中Caspase-1、Pro-Caspase-1和Cleaved Caspase-1蛋白的表達(dá)水平

WB檢測(cè)結(jié)果表明, PSO組皮損中的Pro-Caspase-1蛋白表達(dá)水平低于CON組, Cleaved Caspase-1蛋白表達(dá)水平高于CON組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01); PSO組與CON組的Caspase-1蛋白總體表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 見圖1。

A: PSO組和對(duì)照組皮損的WB電泳圖; B: 2組皮損中的Pro-Caspase-1蛋白含量; C: 2組皮損中的Cleaved-Caspase-1蛋白含量; D: 2組皮損中的Caspase-1總蛋白含量。與CON組比較, **P<0.01。圖1 2組皮損中Caspase-1、Pro-Caspase-1和Cleaved Caspase-1蛋白表達(dá)水平

2.3 PSO組和CON組皮損中GSDMD、GSDMD-N蛋白表達(dá)情況

光鏡下觀察到黃色或棕黃色(深至褐色)的顆粒沉著。GSDMD的IHC結(jié)果提示, PSO組無陰性及弱陽性患者, 8例為陽性, 12例為強(qiáng)陽性; CON組無陰性, 2例為弱陽性, 15例為陽性, 3例為強(qiáng)陽性。PSO組表皮及真皮中GSDMD表達(dá)的陽性率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。GSDMD-N的IHC結(jié)果提示, PSO組無陰性, 4例為弱陽性, 13例為陽性, 3例為強(qiáng)陽性; CON組13例為陰性, 7例為弱陽性，無陽性及強(qiáng)陽性。PSO組的表皮及真皮中GSDMD-N表達(dá)的陽性率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), 見圖2。

A: 銀屑病患者皮損的GSDMD染色結(jié)果(放大100倍); B: 銀屑病患者皮損的GSDMD染色結(jié)果(放大400倍); C: 對(duì)照組皮膚組織的GSDMD染色結(jié)果(放大100倍); D: 對(duì)照組皮膚組織的GSDMD染色結(jié)果(放大400倍); E: 銀屑病患者皮損的GSDMD-N染色結(jié)果(放大100倍); F: 銀屑病患者皮損的GSDMD-N染色結(jié)果(放大400倍); G: 對(duì)照組皮膚組織的GSDMD-N染色結(jié)果(放大100倍); H: 對(duì)照組皮膚組織的GSDMD-N染色結(jié)果(放大400倍)。圖2 銀屑病患者及對(duì)照組皮膚組織中GSDMD、GSDMD-N的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色)

3 討 論

銀屑病是一種免疫介導(dǎo)的慢性炎癥性疾病，極易復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響患者身心健康，現(xiàn)已被認(rèn)為是一種系統(tǒng)性疾病，其病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚未完全闡明[7]。研究[8]表明，細(xì)胞焦亡在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞焦亡是由GSDM蛋白家族介導(dǎo)的依賴于炎性小體和半胱-天冬酶(Caspases)的炎癥性程序死亡。GSDMD作為焦亡的執(zhí)行蛋白，發(fā)揮作用需要炎性Caspases (Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11)及炎性小體的激活，激活后可導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡，同時(shí)釋放細(xì)胞內(nèi)的炎癥因子及細(xì)胞內(nèi)容物, Caspase-1也可介導(dǎo)IL-1β進(jìn)一步的激活。因此, Caspase-1在GSDMD的激活階段及GSDMD打孔完成后的炎癥階段都可發(fā)揮重要作用，說明GSDMD及Caspase-1可能與銀屑病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。

Caspase-1是Caspase家族中被研究較多的一種炎癥性Caspase, 在多種炎癥性疾病中發(fā)揮作用，尤其對(duì)炎癥因子IL-1β、IL-18和IL-37的釋放有很大促進(jìn)作用，這些炎癥因子已被證明與銀屑病的發(fā)生密切相關(guān)[9-10]。本研究結(jié)果表明，進(jìn)行期尋常型銀屑病患者皮損中Pro-Caspase-1蛋白水平低于對(duì)照組, Cleaved Caspase-1蛋白水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), 而Caspase-1總體蛋白水平與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 表明進(jìn)行期尋常型銀屑病患者皮損中的Pro-Caspase-1被激活，參與了銀屑病的發(fā)生和發(fā)展。JOHANSEN C等[11]研究結(jié)果表明，銀屑病患者皮損內(nèi)的Caspase-1mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組，皮損內(nèi)的Caspase-1 蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組。SU F等[12]研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者皮損部位的Caspase-1的中間形態(tài)(即本研究中Cleaved Caspase-1)含量高于非皮損部位，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 但Pro-Caspase-1含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

本研究通過IHC染色的方法進(jìn)一步驗(yàn)證了尋常型銀屑病患者皮損中GSDMD和GSDMD-N蛋白量高于對(duì)照組，且GSDMD和GSDMD-N在皮損表皮和真皮中表達(dá)均增高，但以表皮增高為主，提示GSDMD可能參與尋常型銀屑病的發(fā)生與發(fā)展。

雖然本研究顯示了焦亡執(zhí)行蛋白GSDMD和焦亡關(guān)鍵因子Caspase-1在尋常型銀屑病患者體內(nèi)表達(dá)明顯增加，但銀屑病患者皮損部位和非皮損部位Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N的表達(dá)是否存在差異以及銀屑病患者血清中增加的Caspase-1是否為其活性形式尚未證實(shí)。此外，細(xì)胞焦亡機(jī)制復(fù)雜，本研究僅驗(yàn)證了尋常型銀屑病患者Caspase-1和GSDMD的表達(dá)增加，還有更多的焦亡相關(guān)因子尚未檢測(cè)，且銀屑病發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，細(xì)胞焦亡是否為其主要發(fā)病機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。