臧 鵬, 李進(jìn)霞, 李 吉, 張慧芝, 谷 艷

(1. 山西省大同市第三人民醫(yī)院 普通外科, 山西 大同, 037000;2. 山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 山西 大同, 037009)

深靜脈血栓形成(DVT)是指血液在深靜脈內(nèi)異常凝結(jié)而阻塞血液回流，并引起靜脈壁的炎性改變，是臨床上常見的周圍血管疾病。DVT好發(fā)于下肢，多見于高齡、制動(dòng)、手術(shù)、創(chuàng)傷、惡性腫瘤、產(chǎn)后、口服避孕藥等人群中。據(jù)研究[1-4]統(tǒng)計(jì)，血管疾病中DVT的發(fā)病率僅次于急性冠狀動(dòng)脈綜合征、腦卒中，是第三大常見的血管疾病。中國(guó)有關(guān)DVT確切發(fā)病機(jī)制的文獻(xiàn)報(bào)道較少，但隨著中國(guó)居民生活水平的提高、人均壽命的延長(zhǎng)，中國(guó)DVT的發(fā)病率有逐年升高的趨勢(shì)[5-7]。若DVT患者得不到及時(shí)、有效的治療，則可能會(huì)進(jìn)展為血栓形成后綜合征或血栓脫落導(dǎo)致肺栓塞，進(jìn)而危及生命。

DVT屬中醫(yī)“股腫”范疇，脈絡(luò)血瘀濕阻是其主要的病因病機(jī)，根據(jù)患者的臨床分型可采用補(bǔ)氣活血、溫補(bǔ)脾腎、清熱利濕的中藥復(fù)方進(jìn)行治療[8]。黃芪桂枝五物湯是由黃芪、桂枝、芍藥、生姜、大棗5味中藥配伍而成，是治療血痹的常用方劑。趙志麗等[9]運(yùn)用黃芪桂枝五物湯辨治肺癌下肢靜脈栓塞癥，不僅顯著改善了患者的臨床癥狀，而且極大地縮短了深靜脈血栓急性期、亞急性期病程。戴越保[10]發(fā)現(xiàn)黃芪桂枝五物湯可以有效地預(yù)防膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后DVT, 且效果優(yōu)于利伐沙班，具有良好的安全性。本研究采用黃芪桂枝五物湯干預(yù)DVT模型大鼠，觀察其對(duì)模型大鼠凝血指標(biāo)、血漿代謝產(chǎn)物以及血栓形成段組織形態(tài)學(xué)的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選取40只無特定病原體(SPF)級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g, 購自蘇州西山生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXK(京)2019-0010。將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、黃芪桂枝五物湯給藥組(中藥組)及低分子量肝素鈣陽性對(duì)照組(肝素鈣組)，每組10只。

1.2 藥品及黃芪桂枝五物湯凍干粉制備

黃芪、桂枝、芍藥、生姜、大棗均購自北京同仁堂大同連鎖藥店有限責(zé)任公司，由山西大同大學(xué)中醫(yī)藥健康服務(wù)學(xué)院柴茂山教授鑒定。低分子量肝素鈣(萬力舒，煙臺(tái)東誠(chéng)北方制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20153196)。按黃芪桂枝五物湯處方比例稱取黃芪15 g、桂枝12 g、芍藥12 g、生姜25 g、大棗4枚，加10倍量的水浸泡30 min, 煎煮1 h后倒出煎煮液; 再次加入8倍量的水復(fù)煎30 min, 合并2次煎煮液，經(jīng)5層紗布過濾后冷凍干燥，即得凍干粉，得率約為20%。

1.3 主要試劑與儀器

氯化鈉(SOLARBIO公司, CAS號(hào): 7647-14-5), 大鼠D-二聚體ELISA試劑盒(酶免, MM-0623R1), 蘇木素染液(中杉金橋, ZLI-9610), 伊紅染色液(Solarbio, G1100), 超凈高級(jí)封片膠(BASO, YZB), Scott藍(lán)化液(Solarbio, G1865); 微量注射泵(kd Scientific, LEGATO 130), 凝血儀(廣州萬孚, NX-102), 臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf, 5424R), 酶標(biāo)儀(北京六一, WD-2102B), 顯微鏡(OLYMPUS, CX41), 切片機(jī)(Leica, 2235), 超高效液相色譜(Thermo Fisher Scientific, Vanquish), 高分辨質(zhì)譜(Thermo Fisher Scientific, Q Exactive HFX)。

1.4 造模與給藥

模型組、中藥組及肝素鈣組均參照文獻(xiàn)[11]構(gòu)建不完全結(jié)扎的大鼠股靜脈血栓模型，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉(300 mg/kg), 待麻醉生效后，剃去大鼠腹股溝處鼠毛并消毒皮膚; 沿左腹股溝區(qū)中點(diǎn)做2 cm縱行切口，分離左股靜脈，在左股靜脈近心端處繞絲線行不完全結(jié)扎，使血管腔縮小約1/2以減慢血流; 從左股靜脈遠(yuǎn)心端緩慢注入10%高滲鹽水0.4 mL, 此時(shí)可觀察到股靜脈變?yōu)榘导t色，提示血栓形成; 檢查周圍組織無出血后縫合切口，外敷消毒紗布[11]。假手術(shù)組不結(jié)扎、不給予高滲鹽水刺激，其余操作同模型組。中藥組給予藥物凍干粉溶液2.0 g/(kg·d), 按每100 g為1 mL的比例灌胃; 肝素鈣組給予低分子量肝素鈣351.43 IU/(kg·d), 按每100 g為0.1 mL的比例皮下注射; 假手術(shù)組、模型組均以每100 g為1 mL的蒸餾水灌胃，各組大鼠給藥時(shí)間均為造模前7 d至造模后7 d, 給藥1次/d, 持續(xù)給藥14 d。

1.5 樣本采集與檢測(cè)

治療結(jié)束后的第1天，將各組大鼠用5%水合氯醛腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈取血，置于冷水浴冷卻的肝素抗凝管中，混勻，4 ℃下3 000 轉(zhuǎn)/min離心10 min, 分離血漿并保存于-80 ℃冰箱中; 經(jīng)原切口取出各組大鼠股靜脈血栓段。將各組大鼠股靜脈段進(jìn)行常規(guī)固定、包埋、切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察各組大鼠局部血栓形成靜脈段組織形態(tài)學(xué)的差異。采用凝血儀及原裝配套試劑檢測(cè)各組大鼠血中活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、凝血酶時(shí)間(TT)以及纖維蛋白原(FIB)水平; 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血中D-二聚體(D-D)水平。血漿代謝產(chǎn)物檢測(cè)流程: 取血漿100 μL, 加入400 μL提取液[甲醇∶乙腈=1∶1的體積比(V/V)], 渦旋混合30 s, 12 000轉(zhuǎn)/min離心15 min, 取上清液進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠行為學(xué)比較

造模前7 d時(shí)，各組大鼠精神狀況良好，四肢活動(dòng)及飲食正常。造模后，假手術(shù)組大鼠精神狀態(tài)良好，左下肢無明顯腫脹，行動(dòng)無明顯受限; 其他3組大鼠造模后精神狀況一般，左下肢明顯腫脹、青紫，活動(dòng)減少。持續(xù)給藥7 d后，肝素鈣組、中藥組大鼠較模型組大鼠精神狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，左下肢血運(yùn)明顯改善，食欲增加，提示低分子量肝素鈣和黃芪桂枝五物湯均能改善DVT大鼠的一般狀態(tài)。

2.2 各組大鼠凝血指標(biāo)比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠FIB及D-D水平均升高, APTT、PT、TT均縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 說明DVT大鼠體內(nèi)處于高凝狀態(tài)，容易產(chǎn)生血栓; 與模型組比較，肝素鈣組、中藥組FIB及D-D水平均下降, APTT、PT、TT均延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 說明低分子量肝素鈣和黃芪桂枝五物湯均能增強(qiáng)大鼠體內(nèi)的抗凝系統(tǒng)功能; 與肝素鈣組比較，中藥組D-D水平更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 說明黃芪桂枝五物湯對(duì)D-D的調(diào)節(jié)作用更為顯著。見表1。

表1 各組大鼠凝血指標(biāo)比較

與假手術(shù)組比較, *P<0.05; 與模型組比較, #P<0.05; 與肝素鈣組比較, △P<0.05。

2.3 黃芪桂枝五物湯對(duì)DVT大鼠代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用

對(duì)假手術(shù)組與模型組的血漿代謝產(chǎn)物進(jìn)行單元統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2組間共有27個(gè)變量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(篩選條件為fold change≤0.5或fold change≥2, 同時(shí)P<0.05), 這些差異代謝物反映了DVT大鼠的代謝紊亂情況。計(jì)算差異代謝物在中藥組及肝素鈣組中的均值，找尋各給藥組中向假手術(shù)組有恢復(fù)趨勢(shì)的代謝產(chǎn)物，并與模型組進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析。結(jié)果表明，治療14 d后，黃芪桂枝五物湯可以使14種差異代謝物的水平趨向假手術(shù)組恢復(fù)，主要涉及改善維生素K、三甲基胺氮氧化物(TMAO)、鵝肌肽、L-肌肽、肉堿代謝、膽汁酸代謝和脂代謝等; 低分子量肝素鈣可以使8種差異代謝物的水平趨向假手術(shù)組恢復(fù)，主要涉及TMAO、鵝肌肽、L-肌肽、肉堿代謝以及氨基酸代謝等。上述結(jié)果說明黃芪桂枝五物湯可以更全面地改善DVT大鼠的代謝異常。見表2。

表2 各組大鼠差異代謝物水平比較

2.4 各組大鼠靜脈血栓段的組織形態(tài)學(xué)差異

假手術(shù)組靜脈管腔中無血栓形成，管腔結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊，管壁無水腫及炎性浸潤(rùn); 模型組中靜脈管腔被血栓填塞，管壁水腫增厚，內(nèi)膜不規(guī)則，可見內(nèi)皮細(xì)胞脫落，靜脈壁與血栓粘連，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較為嚴(yán)重; 肝素鈣組靜脈管腔內(nèi)部分血栓崩解，部分血栓收縮，血栓與靜脈壁可見局限性粘連，血管內(nèi)皮細(xì)胞可見部分脫落，靜脈壁水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組輕; 中藥組靜脈管腔內(nèi)血栓大部分崩解消失，殘留少量血栓收縮，腔內(nèi)再通明顯，血栓與靜脈壁無明顯粘連，管壁結(jié)構(gòu)較完整，內(nèi)皮細(xì)胞脫落較少，管壁炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較輕。見圖1。

A、B: 假手術(shù)組; C、D: 模型組; E、F: 肝素鈣組; G、H: 中藥組。A、C、E、G放大倍數(shù)為100倍, B、D、F、H放大倍數(shù)為400倍。圖1 各組大鼠靜脈血栓的組織形態(tài)學(xué)差異(HE染色)

3 討 論

DVT是臨床上常見的周圍血管疾病之一，是血液在下肢深靜脈內(nèi)異常凝結(jié)引起的靜脈回流障礙性疾病，屬于臨床急危重癥。目前，除導(dǎo)管溶栓、吸栓等介入手術(shù)外，藥物溶栓和抗凝是DVT的主要治療方法，可以有效抑制血栓的擴(kuò)展，降低肺栓塞和血栓后綜合征的發(fā)生率[13]。然而，西藥在抗凝和溶栓的同時(shí)易引發(fā)出血等不良反應(yīng)，例如胃腸出血、硬膜外血腫、腹膜后血腫等[14-16]; 肝素類抗凝藥則必須靜脈或皮下注射給藥，操作繁瑣; 口服抗凝藥華法林的治療效果易受多種食物和藥物的影響; 利伐沙班(新型凝血因子抑制劑)的價(jià)格比較昂貴，在一定程度上限制了臨床應(yīng)用。

DVT屬中醫(yī)“股腫”范疇，脈絡(luò)血瘀濕阻是該病的主要病機(jī); 中醫(yī)學(xué)認(rèn)為氣為血帥，氣傷則血行不暢，氣不暢則血行緩慢，以致瘀血阻于脈中。黃芪桂枝五物湯由黃芪、桂枝、芍藥、生姜、大棗5味中藥配伍而成，具有益氣通經(jīng)、活血通絡(luò)之功效，可以有效防治DVT。凝血四項(xiàng)包括APTT、PT、TT以及FIB, 是臨床上常用的檢測(cè)凝血功能的指標(biāo)，對(duì)疾病診斷具有重要的意義。APTT主要反映內(nèi)源性凝血系統(tǒng)狀況, PT主要反映外源性凝血系統(tǒng)狀況, TT及FIB反映纖維蛋白原是否正常。APTT、PT、TT縮短提示機(jī)體處于高凝狀態(tài)，容易發(fā)生血栓栓塞性疾病; 血漿FIB是纖維蛋白的前體，在凝血的最后階段，可溶性纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白，從而使血液凝固，F(xiàn)IB水平升高提示機(jī)體的凝血系統(tǒng)活性可能增強(qiáng)。

D-D是交聯(lián)纖維蛋白的特異性降解產(chǎn)物之一，是繼發(fā)性纖維蛋白溶解亢進(jìn)的特有代謝產(chǎn)物。D-D水平與血栓的大小及活動(dòng)性相關(guān)，發(fā)生下肢DVT的同時(shí)纖溶系統(tǒng)也被激活，血液中D-D水平升高[17], 因此D-D是下肢DVT的常用輔助診斷指標(biāo)。本研究中，模型組大鼠APTT、PT、TT均顯著縮短，而FIB、D-D顯著升高，說明DVT模型大鼠體內(nèi)存在高凝狀態(tài)和繼發(fā)性纖維蛋白溶解亢進(jìn)。DVT模型大鼠經(jīng)黃芪桂枝五物湯治療后，APTT、PT、TT均顯著延長(zhǎng)，而血漿FIB、D-D水平均顯著降低，且D-D水平較肝素鈣組下降更為顯著，說明黃芪桂枝五物湯具有顯著的抗凝作用，可改善機(jī)體的高凝狀態(tài)。

針對(duì)血漿代謝產(chǎn)物的分析發(fā)現(xiàn)，模型組中維生素K水平較假手術(shù)組顯著升高，而維生素K具有促進(jìn)凝血的作用，說明模型組大鼠處于高凝狀態(tài)，而黃芪桂枝五物湯可能通過抑制DVT大鼠維生素K的吸收來下調(diào)維生素K水平，從而改善DVT大鼠的高凝狀態(tài)。研究[18]報(bào)道TMAO可以促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化性血栓的形成，本研究發(fā)現(xiàn)模型組TMAO水平較假手術(shù)組顯著升高，印證了TMAO與血栓形成的關(guān)聯(lián)性，而黃芪桂枝五物湯可以顯著下調(diào)TMAO水平。此外，與低分子量肝素鈣相比，黃芪桂枝五物湯可以顯著改善DVT大鼠體內(nèi)的鵝肌肽、L-肌肽、肉堿代謝、膽汁酸代謝和脂代謝，說明中藥對(duì)DVT的治療效果更為全面。

本研究還通過組織形態(tài)學(xué)方法直觀地觀察了局部血管及血栓狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠靜脈管腔被血栓填塞，管壁水腫增厚，內(nèi)膜不規(guī)則，可見內(nèi)皮細(xì)胞脫落，靜脈壁與血栓粘連，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較為嚴(yán)重; 肝素鈣組靜脈管腔內(nèi)部分血栓崩解，部分血栓收縮，血栓與靜脈壁可見局限性粘連，血管內(nèi)皮細(xì)胞部分脫落，靜脈壁水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組輕; 中藥組靜脈管腔內(nèi)血栓大部分崩解消失，殘留少量血栓收縮，腔內(nèi)再通明顯，血栓與靜脈壁無明顯粘連，管壁結(jié)構(gòu)較完整，內(nèi)皮細(xì)胞脫落較少，管壁炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較輕。組織形態(tài)學(xué)結(jié)果證實(shí)了黃芪桂枝五物湯具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抑制血栓形成、減少炎細(xì)胞浸潤(rùn)等作用。

綜上所述，黃芪桂枝五物湯具有抗凝、改善代謝紊亂、抑制血栓形成、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞以及減輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等作用，這可能是其治療DVT的重要機(jī)制。