姜明霞, 王 宇, 呂桂蘭, 周軼南,董杏媛, 許 琦, 鄭錦鋒

(中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院, 1. 營養(yǎng)科,2. 國家腎臟疾病臨床醫(yī)學研究中心, 江蘇 南京, 210002)

糖尿病腎病(DKD)的發(fā)病機制復雜，至今尚未完全闡明，可能與遺傳易感性、糖代謝紊亂、細胞因子、炎癥機制等多種因素有關。單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)是DKD重要的生物學標志物，其引起的炎癥反應可引起腎血管損傷、腎基質纖維化以及腎組織結構重建[1]。轉化生長因子β1(TGF-β1)是一種調節(jié)細胞生長和分化的蛋白，可在多種細胞中表達，參與細胞外基質沉淀及纖維化的發(fā)生，包括Ⅰ型膠原蛋白(COL-Ⅰ)和纖維連接蛋白。MCP-1能夠活化糖尿病高糖狀態(tài)下的腎臟巨噬細胞，增加TGF-β1分泌，并組成MCP-1/TGF-β1通路參與DKD的發(fā)生[2-3]。除了腎小球的結構和功能變化之外，腎小管和腎小管間質的損傷和炎癥也參與DKD的發(fā)展[4-5]。腎小管上皮細胞被認為是促進炎癥、腎小管變性和纖維化的介質[6]。因此，本研究選用HK-2細胞作為實驗對象，通過高糖作用建立糖損傷腎小管的體外模型，觀察必需脂肪酸α-亞麻酸(ALA)/亞油酸(LA)對腎小管損傷的作用和效果。

ALA和LA是人體必需脂肪酸，具有多種多樣的生理功能。本課題組前期研究[7-8]結果證明, ALA/LA可改善HK-2細胞的糖毒性和氧化應激作用，但對于MCP-1/TGF-β1介導的腎纖維化損傷尚無研究。本研究旨在觀察ALA/LA對高糖損傷HK-2細胞MCP-1、TGF-β1和COL-Ⅰ表達的影響，探討ALA/LA通過該信號通路保護DKD患者腎臟的功能和結構，減緩腎臟炎癥狀態(tài)及纖維化的發(fā)生發(fā)展的相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ALA、LA和二十碳五烯酸(EPA)購自美國Nuchek公司; 成人腎臟近曲小管上皮細胞(HK-2)購自美國標準菌種收藏中心 (ATCC); 胎牛血清、DMEM/F12液體培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自Gibco公司; 二甲基亞楓(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自Sigma公司; 牛血清白蛋白(BSA)購自Amersco公司; 葡萄糖和NaOH均為國產分析純試劑。Trizol試劑盒購自Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒購自Thermo公司, RNA酶抑制劑購自Fermentas公司，聚合酶鏈反應(PCR)引物由上海生工生物有限公司合成，人MCP-1、TGF-β1和COL-Ⅰ酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒均購自凱基生物科技發(fā)展有限公司。儀器: CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司), 酶標儀(美國Bio-Rad公司), THZ-C恒溫震蕩器(北京佳源興業(yè)科技有限公司)，倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司), 溫控水浴箱(金壇科興儀器廠), 722型分光光度計(上海第三分析儀器廠)，低溫高速離心機、臺式高速離心機(Eppendorf), 制冰機(AF-100, Scotsman); -80 ℃冰箱(美國Revco)。

1.2 方法

1.2.1 ALA/LA/BSA溶液制備: 參照COUSIN S P等[9]方法，將ALA、LA制成5 mmol/L ALA/LA/BSA 儲存液，冷卻至室溫，無菌過濾(0.45 mm), 分裝儲存, -20 ℃保存。每次實驗前取出ALA/LA/BSA儲存液，于55 ℃水浴中加熱 15 min 后，冷卻至室溫備用。

1.2.2 HK-2細胞培養(yǎng): HK-2細胞接種于含100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 葡萄糖毒性測定: 取對數生長期細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL(含5×103個細胞)。待細胞貼壁后，吸去原培養(yǎng)液，加入不同濃度葡萄糖溶液(17.5、30.1、35.1、40.2、48.7、56.5、64.3 mmol/L), 培養(yǎng)48 h后，吸去培養(yǎng)液，加入MTT 溶液, 37 ℃孵育4 h, 棄上清，加入DMSO, 室溫避光置搖床低速震蕩10 min, 用酶標儀測定490 nm處光密度(OD)值，計算細胞存活率[5]。存活率=(實驗組OD-對照組OD)×100%。

1.2.4 實驗分組: 本實驗中將細胞分為6組。① 正常對照組(N組): HK-2細胞正常生長于DMEM/F12培養(yǎng)液; ② 高糖模型組(G組): HK-2細胞在DMEM/F12培養(yǎng)液基礎上加入高濃度葡萄糖共同培養(yǎng); ③ 陽性對照組(E組): EPA作為陽性對照物，該組HK-2細胞在高糖環(huán)境下，給予10、50、100、200 μmol/L共4種濃度EPA分別進行干預; ④ ALA組(A組): 該組HK-2細胞在高糖環(huán)境下，給予10、50、100、200 μmol/L共4種濃度ALA分別進行干預; ⑤ LA組(L組): 該組HK-2細胞在高糖環(huán)境下，給予10、50、100、200 μmol/L共4種濃度LA分別進行干預; ⑥ ALA/LA組(M組): 該組HK-2細胞在高糖環(huán)境下，給予ALA/LA混合液分別干預, ALA/LA濃度為50、100 μmol/L, 比例分別是1∶1、1∶4、1∶8。

1.2.5 ELISA測定HK-2細胞上清中TGF-β1、MCP-1和COL-Ⅰ含量: HK-2細胞經高糖培養(yǎng)以及ALA/LA干預后，分離獲得細胞上清液，按照相應指標ELISA試劑盒的說明書進行操作，采用酶標儀測定OD值，計算TGF-β1、MCP-1和COL-Ⅰ表達量。

1.2.6 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)測定HK-2細胞TGF-β1、MCP-1和COL-ⅠmRNA的表達: 收集各組細胞，采用Trizol 試劑盒提取細胞TGF-β1、MCP-1和COL-Ⅰ總RNA, 方法按照試劑盒說明書進行。PCR擴增引物根據GenBank 中相應基因序列設計，引物序列:MCP-1-F為5′-TATTGTCCACTGACCCC-3′,MCP-1-R為5′-CTTCACCCAACTCCTAACCT-3;TGF-β1-F為5′-AGCTGTACATTGACTTCCGCAAGG-3,TGF-β1-R為5′-CAGGCAGAAGTTGGCGTGGTAG-3′;COL-Ⅰ-F為5′-TAGGTAGGCCATTGTGTATGCAGC-3′,COL-Ⅰ-R為5′-ACATGTTCAGCTTTGTGGCC-3′;β-actin-F為CCTAAAAGCCACCCCACTTC,β-actin-R為AGGGAGACCAAAAGCCTTCA。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 高濃度葡萄糖對HK-2細胞的作用

根據MTT實驗結果，與17.5 mmol/L濃度相比，葡萄糖濃度從40.2 mmol/L開始，細胞的存活率受到抑制，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 在40.2～60.4 mmol/L范圍內，葡萄糖濃度與HK-2 細胞存活率呈負相關(r=-0.91,P<0.05)。60.4 mmol/L濃度時, HK-2 細胞的存活率最低(圖1)。結合文獻和課題組前期實驗[5, 7]結果, 本研究采用葡萄糖濃度40.2 mmol/L、培養(yǎng)48 h作為HK-2細胞的高糖損傷條件。

與17.5 mmol/L濃度相比, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。圖1 不同濃度葡萄糖對HK-2細胞活力的影響(48 h)

2.2 ALA/LA降低糖損傷HK-2細胞的MCP-1水平

經高糖培養(yǎng)后，與正常對照組相比, HK-2細胞上清液MCP-1水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。給予糖損傷HK-2細胞100 μmol/L ALA 和 LA(A3組、L3組)，50、100 μmol/L EPA(E2組、E3組)干預48 h后，細胞上清液MCP-1含量較高糖模型組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 給予HK-2細胞終濃度為50 μmol/L 和100 μmol/L, 且比例為1∶4的ALA/LA混合液(M2組、M5組)作用48 h后，干預組HK-2細胞上清液MCP-1含量低于高糖模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中，干預濃度為100 μmol/L, 比例為1∶4的ALA/LA混合液(M5組)的干預效果最佳。見圖2。

N: 正常對照組; G: 高糖模型組; A1～A4: ALA干預組,干預物濃度分別為10、50、100、200 μmol/L; L1～L4: LA干預組,干預物濃度分別為10、50、100、200 μmol/L; E1～E4: EPA干預組,干預物濃度分別為10、50、100、200 μmol/L; M1～M3: ALA/LA混合干預組,干預物濃度為50 μmol/L, 混合比例分別為 1∶1、1∶4、1∶8; M4～M6: ALA/LA混合干預組,干預物濃度為100 μmol/L, 混合比例分別為 1∶1、1∶4、1∶8。與正常對照組相比, *P<0.05; 與高糖模型組相比, #P<0.05。圖2 ALA/LA對糖損傷HK-2細胞MCP-1表達的影響

2.3 ALA/LA降低糖損傷HK-2細胞的TGF-β1水平

高糖培養(yǎng)后，與正常對照組細胞相比, HK-2細胞上清液TGF-β1水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。給予HK-2細胞100、200 μmol/L ALA(A3組、A4組), 100 μmol/L LA(L3組), 10、50、100、200 μmol/L EPA(E1組、E2組、E3組、E4組)干預48 h后，與高糖模型組相比，細胞上清液TGF-β1含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 另外給予HK-2細胞終濃度分別為50 μmol/L和100 μmol/L, 比例為1∶4的ALA/LA混合液(M2組、M5組)干預48 h后，細胞上清液TGF-β1含量均低于高糖模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中, 100 μmol/L ALA(A3組)和100 μmol/L、比例為1∶4的ALA/LA混合液(M5組)對高糖損傷HK-2細胞的作用效果較好。見圖3。

N: 正常對照組; G: 高糖模型組; A1～A4: ALA干預組,干預物濃度分別為10、50、100、200 μmol/L; L1～L4: LA干預組,干預物濃度分別為10、50、100、200 μmol/L; E1～E4: EPA干預組,干預物濃度分別為10、50、100、200 μmol/L; M1～M3: ALA/LA混合干預組,干預物濃度為50 μmol/L, 混合比例分別為 1∶1, 1∶4、1∶8; M4～M6: ALA/LA混合干預組,干預物濃度為100 μmol/L, 混合比例分別為 1∶1、1∶4、1∶8。與正常對照組相比, *P<0.05; 與高糖模型組相比, #P<0.05。圖3 ALA/LA對糖損傷HK-2細胞TGF-β1表達的影響

2.4 ALA/LA降低糖損傷HK-2細胞的COL-Ⅰ水平

高糖培養(yǎng)后，與正常對照組相比，高糖模型組HK-2細胞上清液COL-Ⅰ水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。給予HK-2細胞100、200 μmol/L ALA(A3組、A4組), 10、50、100 μmol/L LA(L1組、L2組、L3組)，10、50、100 μmol/L EPA(E1組、E2組、E3組)以及終濃度為50 μmol/L、比例為1∶4的ALA/LA混合液(M2組)干預48 h后，細胞上清液COL-Ⅰ含量均低于高糖模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

N: 正常對照組; G: 高糖模型組; A1～A4: ALA干預組,干預物濃度分別為10、50、100、200 μmol/L; L1～L4: LA干預組,干預物濃度分別為10、50、100、200 μmol/L; E1～E4: EPA干預組,干預物濃度分別為10、50、100、200 μmol/L; M1～M3: ALA/LA混合干預組,干預物濃度為50 μmol/L, 混合比例分別為 1∶1, 1∶4、1∶8; M4～M6: ALA/LA混合干預組,干預物濃度為100 μmol/L, 混合比例分別為 1∶1、1∶4、1∶8。與正常對照組相比, *P<0.05; 與高糖模型組相比, #P<0.05。圖4 ALA/LA對糖損傷HK-2細胞COL-Ⅰ表達的影響

2.5 ALA/LA降低糖損傷HK-2細胞的MCP-1mRNA水平

與正常對照組相比，高糖模型組HK-2細胞MCP-1mRNA水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。給予HK-2細胞50 μmol/L ALA(A2組), 50、100 μmol/L LA(L2組、L3組)和100 μmol/L EPA(E3組)，以及50、100 μmol/L比例為1∶4的ALA/LA(M2組、M5組)干預48 h后，與高糖模型組相比，細胞MCP-1mRNA水平下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5。

A: MCP-1電泳圖: B: MCP-1 mRNA相對表達量。N: 正常對照組; G: 高糖模型組; A2、A3: ALA干預組,干預物濃度分別為50、100 μmol/L; L2、L3: LA干預組,干預物濃度分別為50、100 μmol/L; E2、E3: EPA干預組,干預物濃度分別為50、100 μmol/L; M2、M5: ALA/LA混合干預組,干預物濃度為50、100 μmol/L, 混合比例為1∶4。與正常對照組相比, *P<0.05; 與高糖模型組相比, #P﹤0.05。圖5 ALA/LA對糖損傷HK-2細胞MCP-1 mRNA表達的影響

2.6 ALA/LA降低糖損傷HK-2細胞的TGF-β1 mRNA水平

與正常對照組相比，高糖模型組HK-2細胞TGF-β1mRNA 水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在前期實驗的基礎上，給予50、100 μmol/L的 ALA、LA和EPA(A2組、A3組、L2組、L3組、E2組、E3組)干預48 h后, HK-2細胞TGF-β1mRNA水平均低于高糖模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖6。

A: TGF-β1電泳圖: B: TGF-β1 mRNA相對表達量。N: 正常對照組; G: 高糖模型組; A2、A3: ALA干預組,干預物濃度分別為50、100 μmol/L; L2、L3: LA干預組,干預物濃度分別為50、100 μmol/L; E2、E3: EPA干預組,干預物濃度分別為50、100 μmol/L; M2、M5: ALA/LA,混合干預組干預物濃度為50、100 μmol/L, 混合比例為1∶4。與正常對照組相比, *P<0.05; 與高糖模型組相比, #P<0.05。圖6 ALA/LA對糖損傷HK-2細胞TGF-β1 mRNA表達的影響

2.7 ALA/LA降低糖損傷HK-2細胞的COL-Ⅰ mRNA水平

高糖培養(yǎng)后, HK-2細胞COL-ⅠmRNA水平高于正常對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在前期實驗的基礎上，給予糖損傷HK-2細胞100 μmol/L ALA(A3組)、50 μmol/L LA(L2組)，以及終濃度為50 μmol/L、比例為1∶4的ALA/LA(M2組)混合液干預48 h后, HK-2細胞COL-ⅠmRNA水平低于高糖模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖7。

A: COL-Ⅰ電泳圖: B: COL-Ⅰ mRNA相對表達量。N: 正常對照組; G: 高糖模型組; A2、A3: ALA干預組,干預物濃度分別為50、100 μmol/L; L2、L3: LA干預組,干預物濃度分別為50、100 μmol/L; E2、E3: EPA干預組,干預物濃度分別為50、100 μmol/L; M2、M5: ALA/LA混合干預組,干預物濃度為50、100 μmol/L, 混合比例為1∶4。與高糖模型組相比, #P<0.05。圖7 ALA/LA對糖損傷HK-2細胞COL-Ⅰ mRNA表達的影響

3 討 論

COL-Ⅰ可在DKD進展過程中沉積于腎小球基底膜、系膜基質和腎小管間質。腎小管上皮細胞可通過分泌豐富的細胞外基質、細胞因子和黏附分子填充腎小管間質空間，并通過信號通路相互影響，損害腎實質細胞和重塑腎臟結構[10-12]。TGF-β信號系統(tǒng)可損害腎小管細胞完整性，導致腎小管萎縮，并通過誘導上皮細胞凋亡或自噬導致腎小管間質纖維化。本研究結果顯示，高糖模型組HK-2細胞外液TGF-β1和COL-Ⅰ水平顯著高于正常對照組(P<0.05), 提示高糖可刺激HK-2細胞分泌TGF-β1, 進而促進COL-Ⅰ生成。這與陳繼業(yè)等[13]提出的觀點一致，高糖可刺激HK-2細胞增強膠原和TGF-β1基因轉錄，導致腎小管基底膜增厚和腎小管間質組織學異常。

本研究結果進一步顯示，經ALA、ALA/LA干預48 h后，高糖損傷HK-2細胞TGF-β1和COL-Ⅰ含量，以及細胞TGF-β1和COL-ⅠmRNA水平都較高糖模型組顯著降低(P<0.05), 表明ALA/LA可延緩HK-2細胞的纖維化進程。ALA和LA為人體必需脂肪酸，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種生理功能。本課題組前期實驗結果表明, ALA/LA可提高糖損傷HK-2細胞的抗氧化酶活力，降低活性氧簇(ROS)的生成，提高HK-2細胞的抗氧化能力。ROS可激活TGF-β1信號通路，觸發(fā)多種細胞分泌TGF-β1, 產生纖維化的作用。但ALA/LA通過抑制ROS的生成，下調TGF-β1的表達，延緩纖維化的作用機制還有待進一步研究。

腎臟的炎癥因子和炎癥狀態(tài)對于促進DKD的發(fā)展和進展至關重要，是DKD的主要病理生理學參與者[14]。MCP-1是單核細胞的有效趨化因子，可影響DKD進程中單核細胞相關炎癥的整個級聯(lián)反應，包括從骨髓釋放單核細胞，建立黏附和浸潤的趨化因子梯度[8]。MCP-1和TGF-β1是相互作用的細胞因子, TGF-β1能刺激MCP-1在腎近端小管中的表達，引起巨噬細胞的浸潤[15]。本研究結果顯示, HK-2細胞在高糖環(huán)境下,MCP-1基因和MCP-1蛋白的表達量均顯著增加(P<0.05)。且經ALA、ALA/LA干預48 h后，與高糖模型組相比, HK-2細胞MCP-1含量以及MCP-1mRNA水平顯著降低(P<0.05), 證明一定劑量ALA、ALA/LA可從基因和蛋白水平抑制MCP-1的產生。因此，通過ALA/LA抑制MCP-1/TGF-β1的表達，下調COL-Ⅰ的生成，減緩HK-2細胞纖維化的進程，有望成為治療DKD的新策略、新方法。