李聰穎 甘嘉禾 王美君 曹倍赫 黃瑛 何曦 華梓煜 孫銘浩 李仕明

1首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院 北京同仁眼科中心 北京市眼科學與視覺科學重點實驗室，北京 100730；2首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院眼科，北京 100029

近年來，近視已成為重要的公共衛(wèi)生問題，其患病率呈“流行性”增長，尤其是在亞洲一些地區(qū)，青少年近視患病率甚至高達90%以上。流行病學研究發(fā)現(xiàn)，光照不足和/或戶外活動減少會增加近視風險，增加戶外活動時間能夠延緩兒童近視發(fā)生，可能與戶外環(huán)境的高強度光照有關(guān)。動物實驗亦證實，增加光照強度能夠延緩樹鼩及豚鼠形覺剝奪性近視(form deprivation myopia，F(xiàn)DM)的進展，并減輕雛雞和恒河猴FDM程度。然而，低強度光照對近視發(fā)生和發(fā)展影響的研究較少，研究結(jié)果也存在爭議。有研究發(fā)現(xiàn)，50 lx的低強度光照條件下飼養(yǎng)的雛雞會發(fā)展成近視，(15±8)lx的低強度光照可導致恒河猴屈光度發(fā)生遠視性漂移,不同研究結(jié)果提示光照強度與近視發(fā)生和發(fā)展之間的關(guān)系較為復雜，并不是單一的線性關(guān)系，值得進一步研究。本研究擬觀察低強度光照、正常強度光照和高強度光照對豚鼠正常屈光發(fā)育和FDM的影響，為近視防控相關(guān)研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

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實驗動物及分組 選取健康無眼疾3周齡雄性三色豚鼠108只(購于北京芳元緣養(yǎng)殖場)，體質(zhì)量150.5～211.5 g，平均181.0 g。實驗動物的使用和喂養(yǎng)遵循中國科學技術(shù)委員會頒布的《實驗動物管理條例》，本研究方案經(jīng)首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院倫理委員會審核批準(批文號：TRLAWEC2022-S109)。

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2

主要試劑及儀器 復方托吡卡胺滴眼液、質(zhì)量分數(shù)0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液(日本參天制藥株式會社)。Quantel Medical Axis Nano眼科A型超聲診斷儀(1.03，法國Quantel Medical公司)；艾沃斯V3照度計、光照箱(上海錦玟儀器設(shè)備有限公司)；點狀光檢影鏡及鏡片箱(丹陽市華輝光學儀器有限公司)。

1.2 方法

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豚鼠分組及不同強度光照處理 將豚鼠分為正常屈光發(fā)育豚鼠群54只和FDM豚鼠群54只，采用隨機數(shù)表法分別分為低強度光照組、正常強度光照組和高強度光照組，每組18只，均在北京邁德康納生物技術(shù)有限公司飼養(yǎng)于20 cm×35 cm×60 cm光照箱，飼養(yǎng)溫度為20 ℃，濕度為60%。光照箱分為3層，每層天花板上安裝LED燈管，燈管位于飼養(yǎng)籠上方10 cm處，從上到下各層光照強度分別為20、300和5 000 lx，光照節(jié)律均為12 h光照(7：00-19：00)/12 h黑暗。

1

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2

豚鼠FDM模型的制作 采用文獻[15]中的經(jīng)典FDM造模方法，選用10寸白色不透明氣球套住豚鼠頭部，剪去部分氣球以暴露右眼、鼻唇部及耳部，保持左眼遮蓋。隨著豚鼠周齡增加及時更換合適的氣球尺寸，防止過緊造成皮膚損傷或者過松導致眼罩滑脫及旋轉(zhuǎn)(圖1)。每天檢查眼罩2次，若發(fā)現(xiàn)脫落及時重新佩戴，以確保眼罩遮蓋左眼。

圖1 豚鼠單眼FDM模型Figure 1 Guinea pig model of monocular FDM

1

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2

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3

眼生物學參數(shù)的測量 采用測量醫(yī)師單盲法，分別于光照前及光照后2、4和6周摘除豚鼠眼罩進行眼生物學參數(shù)測量。正常屈光發(fā)育豚鼠測量結(jié)果為雙眼平均值；FDM豚鼠測量結(jié)果為FDM眼測量值。(1)眼軸長度(axial length，AL)測量 采用眼科A型超聲診斷儀測量豚鼠AL，頻率設(shè)置為11 mHz，設(shè)置超聲在前房、晶狀體和玻璃體的聲速分別為1 557.5、1 723.3和1 540 m/s。測量前采用0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液點眼行角膜表面麻醉，測量時探頭對準角膜中心，并垂直于角膜平面，AL定義為角膜頂點到視網(wǎng)膜黃斑區(qū)的距離。每眼重復測量7～9次，去除最大值和最小值后取平均值。(2)眼屈光度測量 驗光由2位熟練的專業(yè)驗光師和助手完成。采用復方托吡卡胺滴眼液點眼行睫狀肌麻痹，每5 min點眼1次，共2次，在瞳孔充分擴大的情況下于昏暗環(huán)境(<5 lx)中進行檢影驗光。檢查者的視線與豚鼠視線平行，檢影鏡光源發(fā)出的光經(jīng)過反光鏡照射在豚鼠視網(wǎng)膜上，通過視網(wǎng)膜光點反射在瞳孔區(qū)的映光動向判斷屈光狀態(tài)。根據(jù)等效球鏡原則計算屈光度，屈光度=球鏡度+1/2柱鏡度。AL和屈光度變化量為各測量時間點與光照前的差值。

表1 正常屈光發(fā)育豚鼠不同強度光照組不同光照時間AL比較(x±s,mm)Table 1 Comparison of AL of normal refractive development guinea pigs after different lighting duration among three groups (x±s,mm)組別眼數(shù)不同光照時間AL光照前光照2周光照4周光照6周正常強度光照組367.97±0.218.21±0.06a8.36±0.11ab8.57±0.08abc低強度光照組367.90±0.168.24±0.14a8.42±0.10ab8.61±0.14abc高強度光照組367.95±0.148.22±0.09a8.35±0.10ab8.53±0.10abc 注:F組別=0.365,P=0.697;F時間=353.750,P<0.001.與各自組內(nèi)光照前比較,aP<0.001;與各自組內(nèi)光照2周比較,bP<0.001;與各自組內(nèi)光照4周比較,cP<0.001(重復測量兩因素方差分析,Bonferroni檢驗) AL:眼軸長度 Note:Fgroup=0.365,P=0.697;Ftime=353.750,P<0.001.Compared with respective baseline,aP<0.001;compared with respective 2-week lighting,bP<0.001;compared with respective 4-week lighting,cP<0.001 (Repeated measures two-way ANOVA,Bonferroni test) AL:axial length

表2 正常屈光發(fā)育豚鼠不同強度光照組不同光照時間屈光度比較(x±s,D)Table 2 Comparison of diopter of normal refractive development guinea pigs after different lighting duration among three groups (x±s,D)組別眼數(shù)不同光照時間屈光度光照前光照2周光照4周光照6周正常強度光照組36+1.62±1.46+2.00±1.56+1.13±2.21+0.85±2.24低強度光照組36+1.70±1.24+1.27±2.21+0.41±3.07+0.27±2.66高強度光照組36+1.92±1.36+2.08±1.53+2.75±2.15a+2.03±2.45 注:F組別=3.576,P=0.034;F時間=2.739,P=0.058.與各自時間低強度光照組比較,aP<0.01(重復測量兩因素方差分析,Bonferroni檢驗) Note:Fgroup=3.576,P=0.034;Ftime=2.739,P=0.058.Compared with respective low intensity-lighting group,aP<0.01(Repeated measures two-way ANOVA,Bonferroni test)

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗并結(jié)合直方圖及QQ圖證實服從或接近正態(tài)分布，以表示，低強度光照組、正常強度光照組和高強度光照組在光照不同時間豚鼠AL和屈光度及其變化量總體比較均采用重復測量兩因素方差分析，若球形檢驗結(jié)果

P

<0.05，以“Greenhouse-Geisser”矯正結(jié)果為準，

P

<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。多重比較采用Bonferroni法，并依據(jù)比較次數(shù)校正檢驗水準，α'=α/κ。

2 結(jié)果

2.1 正常屈光發(fā)育豚鼠不同強度光照組不同光照時間AL和屈光度比較

正常屈光發(fā)育豚鼠不同強度光照組AL值組間總體比較差異無統(tǒng)計學意義(

F

=0.365，

P

=0.697)，光照不同時間各組豚鼠AL值總體比較差異有統(tǒng)計學意義(

F

=353.750，

P

<0.001)(表1)。不同強度光照組豚鼠屈光度總體比較差異有統(tǒng)計學意義(

F

=3.576，

P

=0.034)，其中高強度光照組光照4周豚鼠屈光度值明顯大于低強度光照組，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.01)(表2)。

2.2 FDM豚鼠不同強度光照組不同光照時間AL和屈光度比較

低強度光照組、正常強度光照組和高強度光照組光照不同時間FDM豚鼠AL值和屈光度值總體比較差異均有統(tǒng)計學意義(

F

=408.302、27.407，均

P

<0.001)。低強度光照組光照2周FDM眼屈光度值大于光照前屈光度，產(chǎn)生短暫性遠視漂移，但差異尚無統(tǒng)計學意義(

P

>0.05)(表3,4)。

表3 FDM豚鼠不同強度光照組不同光照時間AL比較(x±s,mm)Table 3 Comparison of AL of FDM guinea pigs after different lighting duration among three groups (x±s,mm)組別眼數(shù)不同光照時間AL光照前光照2周光照4周光照6周正常強度光照組187.91±0.178.17±0.15a8.45±0.16b8.70±0.16c低強度光照組187.92±0.218.21±0.16a8.41±0.16b8.58±0.14c高強度光照組187.91±0.198.25±0.17a8.43±0.16b8.60±0.19c 注:F組別=0.105,P=0.900;F時間=408.302,P<0.001.與各自光照前比較,aP<0.001;與各自組內(nèi)光照2周比較,bP<0.001;與各自組內(nèi)光照4周比較,cP<0.001(重復測量兩因素方差分析,Bonferroni檢驗) FDM:形覺剝奪性近視;AL:眼軸長度 Note:Fgroup=0.105,P=0.900;Ftime=408.302,P<0.001.Compared with respective pre-lighting,aP<0.001;compared with respective 2-week lighting,bP<0.001;compared with respective 4-week lighting,cP<0.001 (Repeated measures two-way ANOVA,Bonfer-roni test) FDM:form deprivation myopia;AL:axial length

表4 FDM豚鼠不同強度光照組不同光照時間屈光度比較(x±s,D)Table 4 Comparison of diopter of FDM guinea pigs after different lighting duration among three groups(x±s,D)組別眼數(shù)不同光照時間屈光度光照前光照2周光照4周光照6周正常強度光照組18+1.80±0.82+0.24±2.64-0.40±2.22a-2.83±2.35bc低強度光照組18+1.90±0.97+2.35±1.95+0.02±2.37-1.91±3.91b高強度光照組18+1.55±1.39+0.26±2.22-0.25±3.01a-2.41±4.29b 注:F組別=0.973,P=0.387;F時間=27.407,P<0.001.與各自光照前比較,aP<0.001;與各自光照2周比較,bP<0.001;與各自光照4周比較,cP<0.001(重復測量兩因素方差分析,Bonferroni檢驗) FDM:形覺剝奪性近視 Note:Fgroup=0.973,P=0.387;Ftime=27.407,P<0.001.Compared with respective pre-lighting,aP<0.001;compared with respective 2-week lighting,bP<0.001;compared with respective 4-week lighting,cP<0.001 (Repeated measures two-way ANOVA,Bonferroni test) FDM:form deprivation myopia

2.3 各組豚鼠AL和屈光度變化趨勢

正常屈光度發(fā)育豚鼠光照不同時間豚鼠AL變化量總體比較差異有統(tǒng)計學意義(

F

=215.765，

P

<0.001)，其中高強度光照組AL最短且變化量最小，光照4周豚鼠屈光度變化量明顯小于低強度光照組，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)，低強度光照組豚鼠AL最長且變化量最大；正常屈光度發(fā)育豚鼠高強度光照組呈相對遠視狀態(tài)，低強度光照組呈相對近視狀態(tài)。從光照4周開始，F(xiàn)DM豚鼠低強度光照組和高強度光照組AL變化量與正常強度光照組相比均有減小趨勢，且各時間點豚鼠屈光度近視漂移程度均小于正常強度光照組，F(xiàn)DM眼低強度光照組光照2周屈光度變化量明顯小于正常強度光照組，產(chǎn)生短暫性遠視漂移(圖2)。

圖2 不同光照時間各組豚鼠AL及屈光度變化量趨勢 A：正常屈光發(fā)育豚鼠AL變化量趨勢 B：正常屈光發(fā)育豚鼠屈光度變化量趨勢 C：FDM豚鼠AL變化量趨勢 D：FDM豚鼠屈光度變化量趨勢 與低強度光照組比較，aP<0.05 AL：眼軸長度Figure 2 Change trend of AL and diopter in various groups A:Change trend of AL in the normal refractive development guinea pigs B:Change trend of diopter in the normal refractive development guinea pigs C:Change trend of AL in FDM guinea pigs D:Change trend of diopter in FDM guinea pigs Compared with the low intensity-lighting group,aP<0.05 AL:axial length

3 討論

本研究探討不同強度光照對豚鼠屈光發(fā)育和FDM眼的影響，發(fā)現(xiàn)高強度光照組正常屈光發(fā)育豚鼠屈光度呈相對遠視狀態(tài)，AL最短且變化量最小，低強度光照組豚鼠屈光度呈相對近視趨勢，AL最長且變化量最大，其中光照4周低強度光照組豚鼠屈光度小于高強度光照組，其變化量顯著大于高強度光照組，提示提高光照度能夠抑制屈光發(fā)育過程中的AL增長和屈光度向近視漂移，可作為預防近視的一種措施。本研究還發(fā)現(xiàn)，從光照4周開始，低強度光照組和高強度光照組FDM豚鼠AL變化量與正常強度光照組相比有減小趨勢。低強度光照組和高強度光照組光照不同時間豚鼠近視漂移程度均小于正常強度光照組，但低強度光照組光照2周屈光度遠視漂移。這些研究結(jié)果提示，低強度光照并非必然促進豚鼠FDM進展，其原因和機制值得進一步研究。

光暴露是影響眼球屈光發(fā)育的重要環(huán)境因素，光照可以轉(zhuǎn)換為影響眼球生長的生物信號。已有研究表明，在兒童眼屈光發(fā)育過程中，長期暴露在較低強度光照(200 lx)下會減少兒童遠視儲備，增加近視風險，而戶外高強度光照可防止近視度數(shù)過快增長。Cohen等研究發(fā)現(xiàn)，50 lx低強度光照飼養(yǎng)90 d雛雞AL和玻璃體腔較長，呈絕對性近視狀態(tài)，但10 000 lx高強度光照呈遠視狀態(tài)。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，低強度光照不一定加速近視的發(fā)生和發(fā)展。因此，本研究設(shè)計3種不同強度光照進行比較，進一步探討低強度光照對近視發(fā)生和發(fā)展的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)低強度光照有延緩FDM進展的趨勢，與Ashby等及She等研究結(jié)果一致。Ashby等研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DM雛雞以間歇性50 lx低強度光照6 h不會促進近視進展，表明短暫低強度光照可能不是禽類近視發(fā)展的風險因素。She等對發(fā)育早期的恒河猴進行研究，發(fā)現(xiàn)(15±8)lx低強度光照對FDM程度和AL均無明顯影響，而且可以阻止FDM的恢復，進一步研究還發(fā)現(xiàn)(15±8)lx低強度光照也可降低恒河猴眼球?qū)ν哥R誘導的屈光度改變。上述2種情況均與脈絡(luò)膜未增厚有關(guān)，低強度光照會減弱眼球?qū)鈱W離焦信號的反應(yīng)，這表明在低強度光照下，由于光刺激減少，眼球?qū)ν饨缜飧深A作出適當反應(yīng)的可能性減小。

不同動物視網(wǎng)膜感光細胞的數(shù)量比例不同，這是導致對光線強弱敏感度不同的生理基礎(chǔ)。如鳥類視網(wǎng)膜中視錐細胞與視桿細胞比例為3∶ 2，視錐細胞數(shù)量占優(yōu)勢，而靈長類動物視網(wǎng)膜中視錐細胞與視桿細胞比例為1∶ 20，視桿細胞數(shù)量占優(yōu)勢。Hn等研究發(fā)現(xiàn)，視桿細胞轉(zhuǎn)導蛋白敲除

Gnat1

小鼠的正視化出現(xiàn)異常，且無法誘導出FDM。Landis等研究發(fā)現(xiàn)，不同光亮度對屈光度的影響不同，暴露于暗光(1.6×10cd/m)或明光(4.7×10cd/m)環(huán)境下時透鏡誘導小鼠發(fā)生的近視漂移程度明顯小于中間光(1.6×10cd/m)環(huán)境。也有研究采用僅有視桿細胞的小鼠進行研究，發(fā)現(xiàn)視桿細胞通路能夠在暗光下抑制近視，但在明亮光下則未出現(xiàn)該現(xiàn)象。本研究采用的豚鼠與恒河猴、小鼠均屬于哺乳動物，低強度光照未促進近視進展還可能與視桿通路在屈光發(fā)育中的重要作用有關(guān)。

視桿細胞是感受弱光刺激的細胞，對光線的強弱反應(yīng)非常敏感。視桿細胞與視網(wǎng)膜AⅡ型無長突細胞形成突觸，這些無長突細胞與雙極細胞相連，激活雙極細胞后刺激多巴胺釋放。多巴胺是眼屈光發(fā)育的停止信號，對眼球生長有較強的抑制作用。AⅡ型無長突細胞在近似于黃昏光照度水平(300 lx)時電耦合程度最高，該條件下多巴胺將不能有效釋放，這可能是低強度光照與正常強度光照相比呈現(xiàn)相對遠視的原因。最近有研究發(fā)現(xiàn)，視桿細胞在持續(xù)的強光條件下也是活躍的。這些研究均表明刺激視桿細胞和其介導的多巴胺釋放可能有助于低強度光照對近視發(fā)展的保護作用。

光照波長也會影響屈光發(fā)育，不同波長的單色光對不同動物眼球的屈光發(fā)育可產(chǎn)生不同影響。在長波長光下，豚鼠和雛雞可發(fā)生近視，而恒河猴和樹鼩則發(fā)生遠視。在短波長光下，雛雞和小鼠遠視程度增加。不同波長光可能是通過影響視網(wǎng)膜色素上皮細胞的增生及其分泌的生長因子來影響屈光發(fā)育，如短波長藍光可延緩視網(wǎng)膜色素上皮細胞生長及其細胞因子分泌，進而延緩近視的發(fā)生和發(fā)展。此外，光照度大于250 lx的530 nm單色光可以抑制大鼠視網(wǎng)膜Müller細胞生長，并下調(diào)細胞中近視相關(guān)細胞因子表達，進而在近視的形成中發(fā)揮作用。以上研究表明，光線的不同特征對眼球屈光發(fā)育的影響較為復雜，光照強度與近視發(fā)生和發(fā)展并不是單純的線性關(guān)系。

本實驗仍存在一定局限性，如給豚鼠佩戴眼罩可能會導致部分角膜感染與磨損，可能使角膜曲率發(fā)生改變。在今后的研究中，我們將用紅外驗光儀進行驗光并測量角膜曲率，進一步探討不同強度的光照對屈光發(fā)育和FDM的影響。此外，不同強度光照對屈光度和AL產(chǎn)生影響的分子機制也有待進一步探討。

總之，本研究結(jié)果支持低強度光照并非必然會增加FDM的發(fā)生和發(fā)展。對于光線如何與視覺信號相互作用以影響近視進展，目前尚未完全了解。外界低強度光照具體通過何種方式影響眼部發(fā)育，以及低強度光照是否可以作為近視防控的環(huán)境因素還有待進一步研究。

利益沖突

所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明

李聰穎：參與研究實施、分析/解釋數(shù)據(jù)、論文撰寫及修改；甘嘉禾：參與實驗設(shè)計、研究實施、修改論文；王美君：參與研究實施、數(shù)據(jù)采集；曹倍赫、黃瑛：參與研究實施、生物測量及數(shù)據(jù)采集；何曦、華梓煜、孫銘浩：參與研究實施；李仕明：參與實驗設(shè)計、實驗指導、數(shù)據(jù)分析、對論文智力性內(nèi)容的修改及最終定稿