魯誠 張鳳妍 張宇航 張佳娟

1新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院眼科，新鄉(xiāng) 453000；2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，鄭州 450000

白內(nèi)障是嚴重致盲眼病，常用的治療方法是手術(shù)治療，尋求白內(nèi)障的非手術(shù)治療方法一直是相關(guān)研究的熱點。研究顯示，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)參與細胞增生、凋亡和氧化應(yīng)激過程，如KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物1(KCNQ1 overlapping transcript 1，KCNQ1OT1)在過氧化氫(hydrogen peroxide，HO)誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells，LECs)中表達量升高，其可通過靶向負調(diào)控miR-214抑制LECs凋亡。微小RNA(micro RNA，miRNA)廣泛參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，包括白內(nèi)障。miR-199a-5p在高糖誘導(dǎo)人LECs中表達量減少，miR-199a-5p通過負調(diào)控特異性蛋白1而抑制細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。LECs的EMT與白內(nèi)障發(fā)病密切相關(guān)。如何干預(yù)HO誘導(dǎo)人LECs的生物學(xué)行為對于白內(nèi)障的防治具有重要意義。關(guān)于KCNQ1OT1和miR-199a-5p調(diào)控作用研究鮮有報道，在線生物信息學(xué)網(wǎng)站Starbase預(yù)測顯示，KCNQ1OT1與miR-199a-5p有互補結(jié)合位點，推測KCNQ1OT1和miR-199a-5p共同參與LECs的生物學(xué)功能，但二者間的相互作用及其能否對白內(nèi)障的EMT過程產(chǎn)生影響尚未闡明。本研究擬探討KCNQ1OT1和miR-199a-5p的相互作用及其對氧化應(yīng)激狀態(tài)下人LECs增生、凋亡的影響及可能的作用機制，以期為白內(nèi)障的治療尋找新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1

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1

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1

標(biāo)本及細胞來源 收集2018年12月至2019年8月在新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院行白內(nèi)障手術(shù)的23例年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者的晶狀體前囊膜組織，同時收集20例正常供體眼晶狀體前囊膜組織。本研究方案經(jīng)新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準[批文號：2019(001)]，患者家屬均簽署知情同意書。人LECs株SRA01/04購于上海研生生化公司。本實驗在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科學(xué)與視覺科學(xué)實驗室進行。

1

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1

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2

主要試劑及儀器 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；HO(美國Sigma公司)；小干擾RNA-陰性對照(small interfering RNA-negative control，siR-NC)、siRNA-KCNQ1OT1、miR-NC、miR-199a-5p、抗miR-NC、抗-miR-199a-5p(廣州銳博生物科技有限公司)；Lipofectamine2000試劑盒、Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒(日本Toyobo公司)；MTT試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；凋亡試劑盒(上海貝博生物科技有限公司)；鼠單克隆bcl-2抗體(12381-1-AP)、鼠單克隆bax抗體(50571-2-Ig)、鼠單克隆甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(59094-1-Ig)(美國Protein Tech公司)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的兔抗羊IgG(SV0002)(武漢博士德生物工程有限公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、丙二醛(malonaldehyde，MDA)試劑盒(南京建成生物研究所)；雙熒光素酶活性試劑盒(美國Promega公司)。MultiskanFC Microplate Photometer酶標(biāo)儀、AttuneNxT流式細胞儀、Applied Biosystems PCR儀(美國Thermo公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1

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2

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1

細胞培養(yǎng) LECs(SRA01/04)解凍復(fù)蘇后接種在含有質(zhì)量分數(shù)10%胎牛血清、100 U/ml(商品單位)青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液內(nèi)，在37 ℃、體積分數(shù)5% CO恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，待細胞生長融合至85%，加入胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。取第5代細胞用于后續(xù)實驗。

1

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2

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2

細胞分組及處理 取對數(shù)生長期細胞以1×10個/孔接種在96孔板中，將細胞分為空白對照組、模型對照組、siR-NC組、siR-KCNQ1OT1組、miR-NC組、miR-199a-5p組、siR-KCNQ1OT1+anti-miR-NC組和siR-KCNQ1OT1+ anti-miR-199a-5p組。空白對照組不做任何處理；模型對照組采用100 μmol/L HO培養(yǎng)細胞24 h制作氧化應(yīng)激損傷模型；其余各組按照Lipofectamine2000試劑盒說明分別用siR-NC、siR-KCNQ1OT1、miR-NC、miR-199a-5p、siR-KCNQ1OT1+anti-miR-NC、siR-KCNQ1OT1+anti-miR-199a-5p轉(zhuǎn)染LECs 6 h后更換培養(yǎng)基，添加100 μmol/L HO繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1

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2

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3

實時熒光定量PCR檢測晶狀體前囊膜組織及各組細胞中KCNQ1OT1和miR-199a-5p表達 取晶狀體前囊膜組織及各組培養(yǎng)的細胞，采用Trizol試劑盒抽提細胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，按照熒光定量試劑盒的操作步驟進行PCR反應(yīng)。引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。KCNQ1OT1正向引物序列：5'-GCACTCTGGGTCCTGTTCTC-3'，反向引物序列：5'-CACTTCCCTGCCTCCTACAC-3'；GAPDH正向引物序列：5'-ATCACTGCCACCCAGAAGAC-3'，反向引物序列：5'-TTTCTAGACGGCAGGTCAGG-3'。miR199a-5p正向引物序列：5'-TTATTACCCAGGCAGACACCG-3'，反向引物序列：5'-AGTGCGAACTGTGGCGAT-3'；U6正向引物序列：5'-CTTCGGCAGCACATATAC-3'，反向引物序列：5'-GAACGCTTCACGAATTTGC-3'。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；60 ℃延長5 min。以GAPDH作為KCNQ1OT1反應(yīng)的內(nèi)參，U6作為miR-199a-5p反應(yīng)的內(nèi)參，采用2法計算KCNQ1OT1和miR-199a-5p相對表達量。

1

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2

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4

MTT法檢測細胞活力 將培養(yǎng)的各組細胞接種在96孔板中，細胞密度為5×10個/ml，在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，每孔培養(yǎng)基中加入20 μl MTT，室溫培養(yǎng)4 h，加入DMSO溶液150 μl，結(jié)晶振蕩溶解，采用酶標(biāo)儀在波長為490 nm處檢測吸光度(

A

)值。細胞生存率(%)=(實驗組

A

值-空白組

A

值)/(對照組

A

值-空白組

A

值)×100%。

1

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2

.

5

流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 將培養(yǎng)的各組細胞接種在6孔板中，細胞密度為1×10個/ml，加入磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)制備細胞懸液，取懸液200 μl，加入Annexin V-FITC和PI 5 μl，避光孵育15 min，加入PBS 150 μl重懸細胞1 h，流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。細胞凋亡率(%)=早期凋亡細胞百分率+晚期凋亡細胞百分率。

1

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2

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6

Western blot法檢測細胞中bcl-2和bax蛋白表達 取各組培養(yǎng)細胞加入蛋白裂解液提取細胞總蛋白，按照BCA法定量蛋白。100 ℃變性10 min，取35 μg上樣，10% SDS-PAGE處理蛋白樣品，轉(zhuǎn)膜，采用新鮮脫脂牛奶封閉2 h，分別加入bcl-2(1∶ 500)、bax(1∶ 500)和GAPDH抗體(1∶ 1 000)，4 ℃孵育24 h，加入HRP標(biāo)記的IgG抗體(1∶ 2 500)，37 ℃孵育2 h，加入化學(xué)發(fā)光液顯影并拍照，應(yīng)用Band Scan 5.0凝膠軟件掃描分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達量。

1

.

2

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7

ELISA法檢測各組細胞中SOD活性和MDA含量 取各組培養(yǎng)細胞，離心半徑14 cm，1 000 r/min離心10 min，收集細胞上清液，根據(jù)SOD試劑盒說明書步驟，將上清液稀釋至150 μl，酶標(biāo)儀上檢測589 nm處

A

值，計算細胞SOD活性。SOD活性值=(對照組

A

值-實驗組

A

值)×樣品體積/(0.5×對照組

A

值×樣品鮮重×測定樣品用量)。按照MDA試劑盒說明書步驟，將上清液稀釋至10 μl，與待測樣本混勻，離心取上清液，于酶標(biāo)儀上檢測530 nm、600 nm處

A

值，計算細胞MDA含量。MDA含量=6.45×(

A

-

A

)-0.560。

1

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2

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8

雙熒光素酶報告實驗檢測法驗證KCNQ1OT1和miR-199a-5p的關(guān)系 生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測顯示，KCNQ1OT1與miR-199a-5p有結(jié)合互補關(guān)系，構(gòu)建KCNQ1OT1野生型載體(KCNQ1OT1-WT)和突變型載體(KCNQ1OT1-MUT)，分別與miR-NC和miR-199a-5p轉(zhuǎn)染LECs(SRA01/04)48 h，采用雙熒光素酶活性試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗證實呈正態(tài)分布，以表達，2個組間計量資料數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本

t

檢驗；多組間計量資料的數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-

t

檢驗。

P

<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常供體和白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜組織中KCNQ1OT1和miR-199a-5p表達比較

與正常供體組織相比，白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜組織內(nèi)KCNQ1OT1 mRNA相對表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

t

=14.112，

P

<0.001)；miR-199a-5p相對表達量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

t

=16.507，

P

<0.001)(表1)。

2.2 模型對照組與空白對照組細胞中KCNQ1OT1和miR-199a-5p相對表達量比較

與空白對照組比較，模型對照組細胞中KCNQ1OT1 mRNA相對表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

t

=15.449，

P

<0.001)；miR-199a-5p相對表達量較空白對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

t

=22.823，

P

<0.001)(表2)。

表1 正常供體和白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜組織中KCNQ1OT1和miR-199a-5p相對表達量比較(x±s)Table 1 Comparison of the expressions of KCNQ1OT1 and miR-199a-5p in lens anterior capsule between normal donor and cataract patients (x±s)組織樣本量KCNQ1OT1miR-199a-5p正常供體前囊膜200.97±0.191.04±0.15白內(nèi)障患者前囊膜232.41±0.420.36±0.12t值14.11216.507P值<0.001<0.001 注:(獨立樣本t檢驗) KCNQ1OT1:KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物1;miR:微小RNA Note:(Independent samples t test) KCNQ1OT1:KCNQ1 overlap-ping transcript 1;miR:microRNA

表2 模型對照組與空白對照組細胞中KCNQ1OT1和miR-199a-5p相對表達量比較(x±s)Table 2 Comparison of the relative expression levels of KCNQ1OT1 and miR-199a-5p between two groups (x±s)組別樣本量KCNQ1OT1miR-199a-5p空白對照組91.03±0.090.97±0.08模型對照組92.35±0.240.32±0.03t值15.44922.823P值<0.001<0.001 注:(獨立樣本t檢驗) KCNQ1OT1:KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物1;miR:微小RNA Note:(Independent samples t test) KCNQ1OT1:KCNQ1 overlap-ping transcript 1;miR:microRNA

2.3 不同siRNA轉(zhuǎn)染組KCNQ1OT1及凋亡相關(guān)蛋白表達量比較

模型對照組、siR-NC組細胞中bax蛋白表達條帶強于空白對照組和siR-KCNQ1OT1組，bcl-2蛋白表達條帶弱于模型對照組和siR-NC組(圖1)?？瞻讓φ战M、模型對照組、siR-NC組、siR-KCNQ1OT1組細胞中KCNQ1OT1及bcl-2和bax蛋白相對表達量總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=96.159、175.196、85.656，均

P

<0.001)，其中與空白對照組比較，模型對照組細胞中KCNQ1OT1和bax蛋白相對表達量明顯升高，bcl-2蛋白相對表達量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均

P

<0.05)；與siR-NC組比較，siR-KCNQ1OT1組細胞中KCNQ1OT1和bax蛋白相對表達量降低，bcl-2蛋白相對表達量升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均

P

<0.05)(圖1，表3)。

圖1 不同siRNA轉(zhuǎn)染組凋亡相關(guān)蛋白表達電泳圖 1：空白對照組；2：模型對照組；3：siR-NC組；4：siR-KCNQ1OT1組 bax：bcl-2相關(guān)X蛋白；bcl-2：B細胞淋巴瘤/白血病-2；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶Figure 1 Electrophoretogram of apoptosis-related protein in different siRNA transfection groups 1：blank control group；2：model control group；3：siR-NC group；4：siR-KCNQ1OT1 group bax：bcl-2 related X protein；bcl-2：B-cell lymphoma/leukemia-2；GAPDH：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

表3 不同siRNA轉(zhuǎn)染組細胞中KCNQ1OT1及凋亡相關(guān)蛋白相對表達量比較(x±s)Table 3 Comparison of the relative expressions of KCNQ1OT1 and apoptosis-related proteins among different siRNA transfection groups (x±s)組別樣本量KCNQ1OT1bcl-2bax空白對照組90.98±0.060.97±0.080.92±0.07模型對照組92.21±0.22a0.41±0.03a1.76±0.16asiR-NC組92.16±0.240.44±0.041.72±0.15siR-KCNQ1OT1組91.54±0.13b0.67±0.07b1.26±0.12bF值96.159175.19685.656P值<0.001<0.001<0.001 注:與空白對照組比較,aP<0.05;與siR-NC組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) siRNA:小干擾RNA;KCNQ1OT1:KC-NQ1重疊轉(zhuǎn)錄物1;NC:陰性對照;bcl-2:B細胞淋巴瘤/白血病-2;bax:bcl-2相關(guān)X蛋白 Note:Compared with blank control group,aP<0.05;compared with siR-NC group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) siRNA:small interfering RNA;KCNQ1OT1:KCNQ1 overlapping transcript 1;NC:negative control;bcl-2:B-cell lymphoma/leukemia-2;bax:bcl-2 re-lated X protein

2.4 不同siRNA轉(zhuǎn)染組細胞生存率和凋亡率比較

空白對照組、模型對照組、siR-NC組、siR-KCNQ1OT1組細胞生存率和凋亡率總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=136.460、137.352，均

P

<0.001)，其中與空白對照組比較，模型對照組細胞生存率明顯降低，細胞凋亡率明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均

P

<0.05)；與siR-NC組比較，siR-KCNQ1OT1組細胞生存率明顯升高，細胞凋亡率明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均

P

<0.05)(圖2，表4)。

圖2 流式細胞術(shù)檢測不同siRNA轉(zhuǎn)染組細胞凋亡水平 A：空白對照組 B：模型對照組 C：siR-NC組 D：siR-KCNQ1OT1組Figure 2 Cell apoptosis analysis of different siRNA transfection groups detected by flow cytometry A：blank control group B：model control group C：siR-NC group D：siR-KCNQ1OT1 group

2.5 不同siRNA轉(zhuǎn)染組細胞中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較

不同轉(zhuǎn)染組細胞中SOD活性值和MDA含量總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=162.758、81.059，均

P

<0.001)，其中與空白對照組相比，模型對照組SOD活性值顯著降低，MDA含量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均

P

<0.05)；與siR-NC組比較，siR-KCNQ1OT1組SOD活性值顯著升高，MDA含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均

P

<0.05)(表5)。

2.6 KCNQ1OT1與miR-199a-5p的靶向關(guān)系

在線生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示，KCNQ1OT1與miR-199a-5p存在互補的核苷酸序列。與miR-NC組比較，miR-199a-5p組的KCNQ1OT1-WT熒光素酶活性值顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

t

=21.131，

P

<0.001)，2個組間KCNQ1OT1-MUT熒光素酶活性值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

t

=1.302，

P

=0.211)(圖3，表6)。

表4 不同siRNA轉(zhuǎn)染組細胞生存率和凋亡率比較(x±s,%)Table 4 Comparison of cell survival rate and apoptosis rate among different siRNA transfection groups (x±s,%)組別樣本量細胞生存率細胞凋亡率空白對照組998.2±9.89.2±0.9模型對照組942.5±4.6a26.5±2.9asiR-NC組946.7±4.227.2±3.1siR-KCNQ1OT1組975.1±6.7b15.3±1.2bF值136.460137.352P值<0.001<0.001 注:與空白對照組比較,aP<0.05;與siR-NC組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) siRNA:小干擾RNA;NC:陰性對照;KC-NQ1OT1:KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物1 Note:Compared with blank control group,aP<0.05;compared with siR-NC group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) siRNA:small interfering RNA;NC:negative control;KCNQ1OT1:KCNQ1 o-verlapping transcript 1

表5 不同siRNA轉(zhuǎn)染組細胞中SOD活性值和MDA含量比較(x±s)Table 5 Comparison of SOD activity and MDA concentration in cells among different siRNA transfection groups (x±s)組別樣本量SOD活性值[mmol/(L·min)]MDA含量(mmol/L)空白對照組945.4±3.936.7±3.5模型對照組921.4±2.2a65.4±5.7asiR-NC組918.6±1.868.6±6.1siR-KCNQ1OT1組932.5±3.1b49.2±4.0bF值162.75881.059P值<0.001<0.001 注:與空白對照組比較,aP<0.05;與siR-NC組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) siRNA:小干擾RNA;SOD:超氧化物歧化酶;MDA:丙二醛;NC:陰性對照;KCNQ1OT1:KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物1 Note:Compared with blank control group,aP<0.05;compared with siR-NC group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) siRNA:small interfering RNA;SOD:superoxide dismutase;MDA:malondialde-hyde;NC:negative control;KCNQ1OT1:KCNQ1 overlapping transcript 1

圖3 KCNQ1OT1與miR-199a-5p結(jié)合位點 KCNQ1OT1：KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物1；WT：野生型；miR：微小RNA；MUT：突變型Figure 3 The binding site of KCNQ1OT1 and miR-199a-5p KCNQ1OT1：KCNQ1 overlapping transcript 1；WT：wild type；miR：microRNA；MUT：mutant type

表6 各組間野生型和突變型KCNQ1OT1熒光素酶活性值比較(x±s)Table 6 Comparison of the luciferase activity of wild-type and mutant KCNQ1OT1 between two groups (x±s)組別KCNQ1OT1-WTKCNQ1OT1-MUTmiR-NC組1.03±0.080.95±0.07miR-199a-5p組0.40±0.040.99±0.06t值21.1311.302P值<0.0010.211 注:(獨立樣本t檢驗) KCNQ1OT1:KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物1;WT:野生型;MUT:突變型;miR:微小RNA;NC:陰性對照 Note:(Independent samples t test) KCNQ1OT1:KCNQ1 overlap-ping transcript 1;WT:wild type;MUT:mutant type;miR:microRNA;NC:negative control

2.7 不同miRNA轉(zhuǎn)染組細胞miR-199a-5p及凋亡相關(guān)蛋白表達量比較

模型對照組和miR-NC組細胞中bax蛋白表達條帶明顯強于空白對照組，bcl-2蛋白表達條帶弱于空白對照組；miR-199a-5p組細胞中bax蛋白表達條帶明顯弱于miR-NC組，bcl-2蛋白表達條帶強于模型對照組和miR-NC對照組(圖4)。空白對照組、模型對照組、miR-NC組和miR-199a-5p組miR-199a-5p及bcl-2和bax蛋白相對表達量總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=367.360、220.909、61.407，均

P

<0.001)，其中與空白對照組比較，模型對照組miR-199a-5p和bcl-2蛋白相對表達量下降，bax蛋白相對表達量升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均

P

<0.05)；與miR-NC組比較，miR-199a-5p組miR-199a-5p和bcl-2蛋白相對表達量明顯升高，bax蛋白相對表達量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均

P

<0.05)(表7)。

圖4 不同miRNA轉(zhuǎn)染組凋亡相關(guān)蛋白表達電泳圖 1：空白對照組；2：模型對照組；3：miR-NC組；4：miR-199a-5p組 bax：bcl-2相關(guān)X蛋白；bcl-2：B細胞淋巴瘤/白血病-2；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶Figure 4 Electrophoretogram of apoptosis-related proteins in different miRNA transfection groups 1：blank control group；2：model control group；3：miR-NC group；4：miR-199a-5p group bax：bcl-2 related X Protein；bcl-2：B-cell lymphoma/leukemia-2；GAPDH：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

表7 不同miRNA轉(zhuǎn)染組細胞中miR-199a-5表達及凋亡相關(guān)蛋白相對表達量比較(x±s)Table 7 Comparison of the expression of miR-199a-5 and the relative expression of apoptosis-related proteins among different miRNA transfection groups (x±s)組別樣本量miR-199a-5pbcl-2bax空白對照組90.99±0.060.95±0.070.96±0.08模型對照組90.35±0.03a0.42±0.03a1.66±0.15amiR-NC組90.38±0.040.39±0.041.61±0.14miR-199a-5p組90.63±0.05b0.66±0.06b1.26±0.12bF值367.360220.90961.407P值<0.001<0.001<0.001 注:與空白對照組比較,aP<0.01;與miR-NC組比較,bP<0.01(單因素方差分析,LSD-t檢驗) miRNA:微小RNA;NC:陰性對照;bcl-2:B細胞淋巴瘤/白血病-2;bax:bcl-2相關(guān)X蛋白 Note:Compared with blank control group,aP<0.01;compared with miR-NC group,bP<0.01 (One-way ANOVA,LSD-t test) miRNA:microRNA;NC:negative control;bcl-2:B-cell lymphoma/leukemia-2;bax:bcl-2 related X protein

2.8 不同miRNA轉(zhuǎn)染組細胞生存率和凋亡率比較

空白對照組、模型對照組、miR-NC組和miR-199a-5p組細胞生存率和凋亡率總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=184.269、370.944，均

P

<0.001)，其中與空白對照組比較，模型對照組細胞生存率明顯降低，細胞凋亡率明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均

P

<0.05)；與miR-NC組比較，miR-199a-5p組細胞生存率明顯升高，細胞凋亡率明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均

P

<0.05)(圖5，表8)。

圖5 流式細胞術(shù)檢測不同miRNA轉(zhuǎn)染組細胞凋亡水平 A：空白對照組 B：模型對照組 C：miR-NC組 D：miR-199a-5p組Figure 5 Cell apoptosis analysis of different miRNA transfection groups determined by flow cytometry A：blank control group B：model control group C：miR-NC group D：miR-199a-5p group

2.9 不同miRNA轉(zhuǎn)染組SOD活性值和MDA含量比較

空白對照組、模型對照組、miR-NC組和miR-199a-5p組SOD活性值和MDA含量總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=164.651、66.376，均

P

<0.001)，其中與空白對照組比較，模型對照組SOD活性值明顯降低，MDA含量明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均

P

<0.05)；與miR-NC組比較，miR-199a-5p組SOD活性值明顯升高，MDA含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)(表9)。

2

.

10

抑制miR-199a-5p表達后miR-199a-5p相對表達量、細胞生存率、凋亡和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較與siR-KCNQ1OT1+anti-miR-NC組相比，siR-KCNQ1OT1+anti-miR-199a-5p組bax蛋白表達條帶增強，bcl-2蛋白表達條帶減弱。siR-KCNQ1OT1+anti-miR-199a-5p組miR-199a-5p相對表達量、細胞生存率、bcl-2蛋白相對表達量和SOD活性值明顯低于siR-KCNQ1OT1+anti-miR-NC組，細胞凋亡率、bax蛋白相對表達量和MDA含量顯著高于siR-KCNQ1OT1+anti-miR-NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均

P

<0.05)(圖6，7，表10)。

表8 不同miRNA轉(zhuǎn)染組細胞生存率和凋亡率比較(x±s,%)Table 8 Comparison of cell survival rate and apoptosis rate among different miRNA transfection groups (x±s,%)組別樣本量細胞生存率細胞凋亡率空白對照組999.7±8.78.7±0.6模型對照組945.4±3.9a27.1±1.9amiR-NC組941.2±4.126.4±1.7miR-199a-5p組969.5±5.8b14.2±1.1bF值184.269370.944P值<0.001<0.001 注:與空白對照組比較,aP<0.05;與miR-NC組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) miRNA:微小RNA;NC:陰性對照 Note:Compared with blank control group,aP<0.05;compared with miR-NC group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) miRNA:microRNA;NC:negative control

表9 不同miRNA轉(zhuǎn)染組細胞中SOD活性值和MDA含量比較(x±s)Table 9 Comparison of SOD activity and MDA concentration among different miRNA transfection groups (x±s)組別樣本量SOD活性值[mmol/(min·L)]MDA含量(mmol/L)空白對照組941.2±3.433.4±3.1模型對照組917.2±1.8a61.6±5.8amiR-NC組920.4±2.058.4±5.5miR-199a-5p組928.6±2.5b45.1±4.2bF值164.65166.376P值<0.001<0.001 注:與空白對照組比較,aP<0.01;與miR-NC組比較,bP<0.01(單因素方差分析,LSD-t檢驗) miRNA:微小RNA;SOD:超氧化物歧化酶;MDA:丙二醛;NC:陰性對照 Note:Compared with blank control group,aP<0.01;compared with miR-NC group,bP<0.01 (One-way ANOVA,LSD-t test) miRNA:microRNA SOD:superoxide dismutase;MDA:malondialdehyde;NC:negative control

圖6 抑制miR-199a-5p表達后凋亡相關(guān)蛋白表達電泳圖 1：siR-KCNQ1OT1+anti-miR-NC組；2：siR-KCNQ1OT1+anti-miR-199a-5p組 bax：bcl-2相關(guān)X蛋白；bcl-2：B細胞淋巴瘤/白血病-2；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶Figure 6 Electrophoretogram of apoptosis-related proteins after inhibiting miR-199a-5p expression 1：siR-KCNQ1OT1+anti-miR-NC group；2：siR-KCNQ1OT1+anti-miR-199a-5p group bax：bcl-2 related X protein；bcl-2：B-cell lymphoma/leukemia-2；GAPDH：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

表10 抑制miR-199a-5p表達后各組miR-199a-5p相對表達量、細胞生存率、凋亡和氧化應(yīng)激指標(biāo)比較(x±s)Table 10 Comparison of relative expression level of miR-199a-5p,cell survial rate,apoptosis and oxidative stress index between two groups after inhibiting miR-199a-5p expression (x±s)組別樣本量miR-199a-5p相對表達量細胞生存率(%)細胞凋亡率(%)bcl-2蛋白相對表達量bax蛋白相對表達量SOD活性值[mmol/(L·min)]MDA含量(mmol/L)siR-KCNQ1OT1+anti-miR-NC組90.93±0.0778.2±7.214.4±1.60.72±0.071.32±0.1436.7±3.445.2±3.8siR-KCNQ1OT1+anti-miR-199a-5p組90.35±0.0362.3±6.821.4±1.80.53±0.041.58±0.1625.3±2.253.2±4.7t值22.8474.8168.7207.0703.6698.4453.971P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.0010.001 注:(獨立樣本t檢驗) miR:微小RNA;KCNQ1OT1:KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物1;NC:陰性對照;bcl-2:B細胞淋巴瘤/白血病-2;bax:bcl-2相關(guān)X蛋白;SOD:超氧化物歧化酶;MDA:丙二醛 Note: (Independent samples t test) miR:microRNA;KCNQ1OT1:KCNQ1 overlapping transcript 1;NC:negative control;bcl-2:B-cell lympho-ma/leukemia-2;bax:bcl-2 related X protein;SOD:superoxide dismutase;MDA:malondialdehyde

圖7 流式細胞術(shù)檢測抑制miR-199a-5p表達后細胞凋亡水平 A：siR-KCNQ1OT1+anti-miR-NC組 B：siR-KCNQ1OT1+anti-miR-199a-5p組Figure 7 Cell apoptosis analysis after the inhibition of miR-199a-5p detected by flow cytometry A：siR-KCNQ1OT1+anti-miR-NC group B：siR-KCNQ1OT1+anti-miR-199a-5p group

3 討論

LECs凋亡是除先天性白內(nèi)障外其他類型白內(nèi)障形成的細胞分子基礎(chǔ)，減輕LECs凋亡和氧化損傷是防治白內(nèi)障的關(guān)鍵。在體外實驗中常用HO、高糖和高鈣等因素誘導(dǎo)LECs產(chǎn)生大量活性氧，促進細胞氧化損傷和凋亡。本研究采用100 μmol/L HO誘導(dǎo)人LECs損傷后，細胞活力和SOD活性明顯降低，細胞凋亡率和MDA含量顯著升高，bcl-2蛋白表達下調(diào)，bax蛋白表達上調(diào)，表明HO誘導(dǎo)的人LECs損傷模型構(gòu)建成功。

LncRNA已被證實在白內(nèi)障疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，如肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)在高糖誘導(dǎo)的人LECs中表達上調(diào)，MALAT1通過激活p38MAPK信號通路促進高糖誘導(dǎo)人LECs凋亡和氧化應(yīng)激，并抑制細胞增生。Du等研究結(jié)果顯示，INK4基因座中反義非編碼RNA(antisense noncoding RNA in the INK4 locus，ANRIL)在HO誘導(dǎo)的人LECs中表達上調(diào)，ANRIL通過靶向負調(diào)控miR-21促進HO誘導(dǎo)的人LECs凋亡。KCNQ1OT1位于人染色體11p15.5，在多種疾病中表達上調(diào)，如KCNQ1OT1在白內(nèi)障組織和轉(zhuǎn)化生長因子β2(transforming growth factor-β2，TGF-β2)誘導(dǎo)的人LECs中表達上調(diào)，沉默KCNQ1OT1通過調(diào)節(jié)miR-29c-3p/FOS軸促進TGF-β2誘導(dǎo)的人LECs增生和轉(zhuǎn)移，并抑制細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)HO誘導(dǎo)人LECs損傷后KCNQ1OT1表達上調(diào)，抑制KCNQ1OT1能夠增強細胞活力和SOD活性，降低細胞凋亡率和MDA含量，上調(diào)bcl-2蛋白表達，下調(diào)bax蛋白表達，表明抑制KCNQ1OT1可以增強LECs活力，減緩細胞凋亡和氧化應(yīng)激，這與之前的研究結(jié)果相似。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a-5p在高糖誘導(dǎo)人LECs中表達下調(diào)，miR-199a-5p通過SP1調(diào)控細胞的EMT過程，但是對HO誘導(dǎo)的人LECs研究機制尚不明確。在線生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果顯示，KCNQ1OT1和miR-199a-5p有互補的結(jié)合位點，并進行首次驗證。

miRNA已經(jīng)成為近年在白內(nèi)障研究中的熱點，如miR-34a、miR-124和miR-204等已被證實與白內(nèi)障相關(guān)。Zhou等研究顯示，miR-23b-3p在白內(nèi)障組織和HO誘導(dǎo)的人LECs中表達上調(diào)，miRNA-23b-3p通過靶向負調(diào)控SIRT1抑制HO誘導(dǎo)的人LECs凋亡和自噬，這與本研究結(jié)果相反。Li等研究顯示，miR-182-5p在HO誘導(dǎo)的人LECs中表達下調(diào)，而過表達miR-182-5p可增強LECs增生活性，并抑制細胞凋亡和氧化損傷。以上研究說明miRNA與白內(nèi)障發(fā)展有關(guān)，但是miR-199a-5p與白內(nèi)障的研究鮮有報道。本研究結(jié)果顯示，miR-199a-5p在HO誘導(dǎo)人LECs中表達下調(diào)，過表達miR-199a-5p可以增強細胞活力和SOD活性，細胞凋亡率和MDA含量降低，上調(diào)bcl-2蛋白表達，下調(diào)bax蛋白表達。KCNQ1OT1可通過調(diào)控下游多個miRNA影響疾病的發(fā)生和發(fā)展，通過在線生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測顯示，miR-199a-5p是KCNQ1OT1的靶標(biāo)，雙熒光素酶報告實驗證實KCNQ1OT1可以靶向miR-199a-5p的表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-199a-5p表達可部分恢復(fù)抑制KCNQ1OT1對HO誘導(dǎo)的人LECs增生、凋亡和氧化應(yīng)激的影響，說明KCNQ1OT1通過靶向負調(diào)控miR-199a-5p的表達減弱HO誘導(dǎo)人LECs損傷。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示在HO誘導(dǎo)的人LECs氧化應(yīng)激損傷中KCNQ1OT1表達上調(diào)，miR-199a-5p表達下調(diào)，siRNA-KCNQ1OT1通過上調(diào)miR-199a-5p的表達增強人LECs的活力，并抑制細胞凋亡和氧化應(yīng)激。關(guān)于miR-199a-5p對下游基因的調(diào)控作用以及KCNQ1OT1與miR-199a-5p對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用機制需要進一步研究。

利益沖突

所有作者均聲明不存在任何利益沖突

作者貢獻聲明

魯誠：醞釀和設(shè)計實驗、實施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草及修改文章；張鳳妍：醞釀和設(shè)計實驗、實施研究、對文章知識性內(nèi)容的審閱和智力性內(nèi)容的修改及定稿；張宇航：采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章；張佳娟：采集數(shù)據(jù)