陳靖陽，徐小艾，王 婉，黃 山，沈 紅，3*

(1.北京農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/動(dòng)物類國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，北京 102206；2.北京大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院 口腔醫(yī)療器械檢驗(yàn)中心，北京 100081；3.北京農(nóng)學(xué)院 獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(skeletal muscle satellite cells,SMSCs)是肌細(xì)胞膜和基膜之間的具有增殖和分化能力的干細(xì)胞，對(duì)于出生后動(dòng)物骨骼肌的生長(zhǎng)、再生修復(fù)和維持具有重要意義[1]。SMSCs在成年動(dòng)物體內(nèi)一般為靜息狀態(tài)，而在動(dòng)物發(fā)育過程中肌肉組織受到一定刺激時(shí)細(xì)胞呈現(xiàn)活化狀態(tài)，SMSCs分化成肌細(xì)胞，肌細(xì)胞融合成肌管最后形成成熟的肌纖維[2]，達(dá)到肌纖維修復(fù)損傷[3-4]。在SMSCs細(xì)胞增殖分化融合過程中，參與肌纖維生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的生肌調(diào)節(jié)因子主要有生肌調(diào)節(jié)因子(myogenic regulatory factors,MRFs)基因家族、Pax(Paired box)基因家族和肌肉生成抑制因子基因(myostatin，MSTN)[5]。研究表明，過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子1α(peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator 1α, PGC-1α)屬于共激活轉(zhuǎn)錄因子家族成員，參與調(diào)控機(jī)體的能量代謝、骨骼肌生理等諸多骨骼肌相關(guān)生理過程[6]。機(jī)體受氧化應(yīng)激刺激時(shí)產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)，超出機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的清除能力，造成細(xì)胞及組織的損傷[7]，影響骨骼肌的發(fā)育及損傷的修復(fù)。中藥典籍中記載地鱉(Eupofyphagasinensis,ES)具有活血散瘀、接筋續(xù)骨、散結(jié)止痛等功效[8]。樸美子等[9]研究認(rèn)為地鱉(ES peptide,ESP)能抑制小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，清除自由基，激活抗氧化酶表達(dá)，具有明顯的抗氧化作用。本研究以H2O2刺激C2C12細(xì)胞為模型，研究ESP對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下C2C12細(xì)胞增殖分化融合以及肌調(diào)節(jié)因子基因表達(dá)的影響，為開發(fā)ESP作為抗氧化劑應(yīng)用于畜禽安全健康養(yǎng)殖提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶購自Gibco公司，高糖DMEM培養(yǎng)基購自Sigma公司，肌細(xì)胞生成素(MyoG)抗體、羊抗鼠FITC-IgG購自武漢博士德生物科技有限公司，HiFi-MmlV cDNA第1鏈合成試劑盒購自江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司，TB Green?Premix Ex TaqTM購自TaKaRa公司，所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，馬血清(HS)購自北京索萊寶生物科技有限公司公司；ESP參照文獻(xiàn)[10]方法，由本實(shí)驗(yàn)室采用酶解及超濾法制備，通過層析法及Tricine-SDS-PAGE驗(yàn)證純化得相對(duì)分子質(zhì)量小于10 kDa的小肽；小鼠成肌細(xì)胞C2C12購自國家實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞資源共享平臺(tái)，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及試驗(yàn)分組

1.2.1藥物濃度選擇 在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度的H2O2可建立氧化應(yīng)激模型，叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)是抗氧化信號(hào)通路的強(qiáng)效誘導(dǎo)劑，可緩解細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，利用400 μmol/L H2O2刺激8 h并給予1 μmol/L TBHQ可成功建立氧化應(yīng)激及陽性對(duì)照C2C12細(xì)胞模型[11-14]。前期研究結(jié)果表明，給予H2O2刺激的細(xì)胞200 mg/L ESP可顯著緩解細(xì)胞的氧化損傷，發(fā)揮對(duì)氧化應(yīng)激細(xì)胞的保護(hù)作用[14-15]。

1.2.2細(xì)胞增殖培養(yǎng) C2C12細(xì)胞于培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS)中，培養(yǎng)細(xì)胞至85%左右，收集細(xì)胞并分組，即對(duì)照組、模型組(H2O2)、ESP組(H2O2+ESP)及陽性藥物組(H2O2+TBHQ)，ESP組細(xì)胞培養(yǎng)基添加ESP 200 mg/L，陽性藥物組細(xì)胞培養(yǎng)基添加TBHQ 1 μmol/L，除對(duì)照組外所有組細(xì)胞在試驗(yàn)結(jié)束前8 h 培養(yǎng)基添加H2O2400 μmol/L處理細(xì)胞。

1.2.3細(xì)胞分化培養(yǎng) C2C12細(xì)胞于培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS)中，培養(yǎng)細(xì)胞至85%左右，收集細(xì)胞并分組，分組情況同1.2.1，將培養(yǎng)基換為分化培養(yǎng)基(DMEM+2% HS)，試驗(yàn)結(jié)束前向培養(yǎng)基中添加ESP、H2O2等藥物處理。

1.3 熒光定量PCR檢測(cè)肌調(diào)節(jié)因子基因表達(dá)細(xì)胞分組培養(yǎng)，吸棄培養(yǎng)基并用PBS潤(rùn)洗細(xì)胞，TRIzol 法提取收集細(xì)胞總RNA，按照HiFi-MMLV cDNA Kit說明書操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得第1鏈產(chǎn)物cDNA，查閱GenBank并設(shè)計(jì)相關(guān)引物(表1)，具體按照TB Green?Premix Ex TaqTM說明書操作，采用20 μL體系：預(yù)變性95℃ 30 s，變性95℃ 5 s，退火/延伸54～59℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。采用Step One Software v2.3軟件分析數(shù)據(jù)，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 目的基因擴(kuò)增引物信息

1.4 姬姆薩染色細(xì)胞及顯微鏡觀察細(xì)胞分組處理， 4%多聚甲醛4℃固定細(xì)胞20 min，PBS漂洗，加姬姆薩染液30 min，棄去染色液，PBS漂洗后置于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、拍照。按照公式計(jì)算肌管融合率(%)= 肌管細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù)×100% 。

1.5 免疫熒光檢測(cè)MyoG蛋白表達(dá)細(xì)胞分組處理，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS潤(rùn)洗，0.3% Triton X-100處理15 min，PBS漂洗，10%山羊血清封閉細(xì)胞1 h后加入MyoG一抗，4℃孵育過夜， PBST潤(rùn)洗，加FITC標(biāo)記的二抗于37℃孵育1 h，PBST潤(rùn)洗后加DAPI復(fù)染細(xì)胞核5 min，PBST潤(rùn)洗后取出玻片并封片，顯微鏡觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 ESP對(duì)H2O2刺激增殖C2C12細(xì)胞肌調(diào)節(jié)因子基因表達(dá)的影響采用RT-qPCR檢測(cè)肌調(diào)節(jié)因子mRNA表達(dá)，結(jié)果如圖1所示。與對(duì)照組相比，模型組C2C12細(xì)胞表達(dá)Pax7、Myf5和MyoD水平顯著下調(diào) (P<0.01)；ESP組細(xì)胞內(nèi)Pax7、Myf5和MyoDmRNA水平顯著高于H2O2組(P<0.01)，結(jié)果表明ESP能緩解H2O2對(duì)細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)因子(Pax7、Myf5、MyoD)基因表達(dá)的抑制作用。

與對(duì)照組比較，** P<0.01；與模型組比較，+P<0.05，++ P<0.01

2.2 ESP對(duì)H2O2刺激分化C2C12細(xì)胞肌調(diào)節(jié)因子基因表達(dá)的影響RT-qPCR分析分化過程中肌調(diào)節(jié)因子(MyoD、Myf6、MyoG)mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)C2C12細(xì)胞增殖階段(1～3 d)MyoDmRNA表達(dá)水平逐漸升高，進(jìn)入細(xì)胞分化初期后逐漸下降，ESP組和陽性藥物組細(xì)胞內(nèi)MyoDmRNA水平明顯高于H2O2組和對(duì)照組(P<0.01)；隨著細(xì)胞分化細(xì)胞內(nèi)MyoGmRNA表達(dá)逐漸升高，在分化末期(5 d)達(dá)到峰值，H2O2組較對(duì)照組MyoGmRNA水平顯著降低(P<0.01)，但ESP組和陽性藥物組MyoGmRNA水平均顯著高于 H2O2組(P<0.01)；Myf6 mRNA水平在細(xì)胞分化中期(5～7 d)逐漸升高，H2O2組Myf6 mRNA水平顯著低于對(duì)照組 (P<0.01)，ESP組和陽性藥物組Myf6 mRNA水平顯著高于H2O2組(P<0.01)，結(jié)果表明,ESP可以提高細(xì)胞分化階段肌分化調(diào)節(jié)因子(MyoD、MyoG、Myf6)mRNA表達(dá)水平(圖2)。

與對(duì)照組比較，*P<0.05，** P<0.01；與模型組比較，+P<0.05，++ P<0.01

2.3 ESP對(duì)H2O2刺激分化C2C12細(xì)胞MyoG蛋白表達(dá)的影響MyoG為成肌調(diào)節(jié)因子家族的主要成員，是評(píng)價(jià)成肌分化狀態(tài)以及肌管形成的重要指標(biāo)。結(jié)果顯示，在9 d時(shí)，對(duì)照組可見大量細(xì)胞表達(dá)MyoG蛋白且排列整齊有粗大多核肌管產(chǎn)生，約55% 陽性細(xì)胞表達(dá)MyoG，模型組表達(dá)MyoG蛋白細(xì)胞數(shù)明顯減少且低于對(duì)照組，細(xì)胞多核肌管減少以及肌管細(xì)小，ESP組和陽性藥物組表達(dá)MyoG蛋白細(xì)胞數(shù)提高到約50%，高于模型組，細(xì)胞多核肌管粗大，肌管數(shù)量增多(圖3)。

A..表達(dá)MyoG細(xì)胞熒光圖；B.表達(dá)MyoG細(xì)胞百分率；與對(duì)照組比較，** P<0.01；與模型比較，++ P<0.01

2.4 ESP對(duì)H2O2刺激分化C2C12細(xì)胞誘導(dǎo)分化形態(tài)的影響采用姬姆薩染色誘導(dǎo)分化的細(xì)胞，顯微鏡下可見C2C12細(xì)胞從典型成纖維狀細(xì)胞逐漸分化融合成多核肌管。在9 d時(shí)顯微鏡觀察ESP對(duì)細(xì)胞形態(tài)影響，結(jié)果對(duì)照組細(xì)胞可見大量粗大的多核肌管，且肌管排列整齊，肌管融合率細(xì)胞數(shù)在40%左右；與對(duì)照組相比，H2O2組細(xì)胞聚集成團(tuán)，排列稀疏雜亂，僅有少量細(xì)小肌管形成，肌管融合細(xì)胞數(shù)降至約35%；與H2O2組相比，ESP和陽性藥物組細(xì)胞聚集成團(tuán)現(xiàn)象減少，粗大的多核肌管形成增多，細(xì)胞形態(tài)接近對(duì)照組，肌管融合細(xì)胞數(shù)增加至40%左右 (圖4)。

A..姬姆薩染色的細(xì)胞；B.細(xì)胞分化融合率；與對(duì)照組比較，** P<0.01；與模型組比較，++ P<0.01

3 討論

肌肉組織是一種終末分化結(jié)構(gòu)，自身不能形成新的骨骼肌纖維，肌肉的再生主要是由SMSCs來完成[16]。C2C12 細(xì)胞是小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞經(jīng)過永生化得來的細(xì)胞株[17]，其具有良好的分化能力，成為研究肌細(xì)胞分化模型。有研究表明，2% HS可誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞體外分化為成熟的肌細(xì)胞，7～9 d細(xì)胞分化達(dá)到終末階段然后細(xì)胞逐漸凋亡[18]。SMSCs在骨骼肌受到直接創(chuàng)傷(如劇烈的體力活動(dòng)、撕裂傷)或間接原因(如神經(jīng)功能障礙或先天性遺傳缺陷)后通過增殖和分化及融合形成新的肌管達(dá)到肌纖維修復(fù)及再生[19-20]，肌纖維修復(fù)和再生過程受眾多肌調(diào)節(jié)因子調(diào)控[5,21]，如MRFs、Pax基因等，而肌調(diào)節(jié)因子的表達(dá)則受上游PGC-1α調(diào)控[22]。MRFs基因家族蛋白轉(zhuǎn)錄因子主要有MyoD、Myf6、MyoG和Myf5等，這些生肌調(diào)節(jié)因子主要調(diào)控骨骼肌正常生長(zhǎng)發(fā)育、肌細(xì)胞增殖、成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及肌纖維的形成[5,23]。Pax基因?qū)〖?xì)胞分化、更新、凋亡也起重要的調(diào)控作用[24]。Pax是一類高度保守的基因，其調(diào)控SMSCs的激活和遷移，SMSCs增殖過程中Pax7處于高表達(dá)狀態(tài)，但隨著骨骼肌分化Pax7表達(dá)下調(diào)[25]。在SMSCs肌源性分化過程中Pax7通過調(diào)節(jié)MyoD的表達(dá)實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)SMSCs的增殖和分化[26]，Myf5和MyoD參與SMSCs的定型及其在SMSCs分化前表達(dá)，是SMSCs增殖的標(biāo)志[27-28]。MyoD和Myf5是骨骼肌分化過程中最早表達(dá)的基因，它們幾乎同步表達(dá)并共同激活骨骼肌的分化，SMSCs分化進(jìn)入成肌狀態(tài)時(shí)MyoD或Myf5基因表達(dá)上調(diào)[29]，但骨骼肌細(xì)胞分化開始時(shí)MyoD表達(dá)量較低，此時(shí)MyoG與MHC表達(dá)量較高[30]。細(xì)胞內(nèi)過量ROS可引起氧化應(yīng)激的發(fā)生，導(dǎo)致肌細(xì)胞蛋白質(zhì)降解、增加細(xì)胞死亡率、肌肉組織喪失功能等，影響骨骼肌的功能及再生能力，也導(dǎo)致諸多肌肉疾病[31]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)下C2C12細(xì)胞增殖過程初期增殖因子Pax7、Myf5、MyoD基因表達(dá)顯著下調(diào)，而ESP可以顯著上調(diào)氧化應(yīng)激SMSCs內(nèi)各增殖因子的基因表達(dá)水平，表明ESP可通過參與調(diào)節(jié)增殖因子的基因表達(dá)增強(qiáng)氧化應(yīng)激狀態(tài)SMSCs的增殖能力。

MyoG是骨骼肌分化的早期標(biāo)志物，在肌細(xì)胞融合形成肌纖維的過程中起著中心調(diào)節(jié)作用[32]。細(xì)胞分化初期MyoD高表達(dá)，隨著細(xì)胞分化其表達(dá)逐漸下降，但隨著SMSCs細(xì)胞分化至終末階段，MyoG表達(dá)逐漸提高并促進(jìn)肌管形成，增加分化細(xì)胞肌球蛋白重鏈(MyHC)等蛋白表達(dá)[33-34]，此時(shí)MyoGmRNA表達(dá)逐漸升高直至細(xì)胞融合階段，在細(xì)胞分化末期及融合過程中Myf6表達(dá)增加。隨著MyoG基因表達(dá)量逐漸提高，SMSCs相互融合形成多核肌管，其中Myf6輔助MyoG在SMSCs的融合階段發(fā)揮作用[33]。MyoD在細(xì)胞分化初期表達(dá)且是細(xì)胞進(jìn)入分化階段的標(biāo)志物，小鼠肌肉發(fā)生過程中如阻遏Myf5和MyoD表達(dá)，小鼠無法生成骨骼肌[26,35]。王媛妹[36]采用胰高血糖素肽-1類似物利拉魯肽處理C2C12細(xì)胞，結(jié)果C2C12細(xì)胞分化過程中細(xì)胞分化調(diào)節(jié)因子MyoD和Myosin表達(dá)量提高，結(jié)果表明利拉魯肽可促進(jìn)體外肌源性骨骼肌細(xì)胞分化。PGC-1α參與調(diào)控肌分化調(diào)節(jié)因子如MyoD的表達(dá)[22]，諸多肽類物質(zhì)如海參肽、神經(jīng)肽等可通過激活PGC-1α促進(jìn)氧化應(yīng)激狀態(tài)下肌細(xì)胞的生長(zhǎng)[37-38]。本試驗(yàn)中ESP處理氧化應(yīng)激狀態(tài)下分化過程中的SMSCs時(shí)，肌分化調(diào)節(jié)因子MyoD、MyoG及Myf6基因表達(dá)明顯下調(diào)，而ESP可以顯著促進(jìn)氧化應(yīng)激狀態(tài)C2C12細(xì)胞增殖因子表達(dá)上調(diào)，提示ESP能緩解氧化應(yīng)激狀態(tài)細(xì)胞分化抑制狀態(tài)，進(jìn)一步通過形態(tài)學(xué)觀察也發(fā)現(xiàn)ESP可以明顯促進(jìn)SMSCs分化過程中肌管的形成，表明ESP可以通過參與調(diào)節(jié)分化融合因子的基因表達(dá)促進(jìn)氧化應(yīng)激狀態(tài)下SMSCs分化為成熟的肌管，其機(jī)制可能與PGC-1α的激活相關(guān)。

綜上所述，體外誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞分化肌細(xì)胞，在氧化應(yīng)激狀態(tài)C2C12細(xì)胞肌調(diào)節(jié)因子表達(dá)下調(diào)抑制SMSCs增殖分化及融合，而ESP通過上調(diào)肌調(diào)節(jié)因子(Pax7、Myf5、MyoD、MyoG、Myf6)基因表達(dá)促進(jìn)SMSCs增殖分化融合成多核肌管，其機(jī)制可能與上游PGC-1α的激活相關(guān)，表明ESP有望開發(fā)成抗氧化劑應(yīng)用于禽類養(yǎng)殖促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育。