杜屹原，孟憲菁，楊 斌，宋 亮，朱光旭，周 曉，張嬡萍，潘 潔，江琳琳

(1.中國科學院西雙版納熱帶植物園熱帶森林生態(tài)學重點實驗室，云南 勐侖 666303；2.中國科學院大學，北京 100049；3.賽默飛世爾科技(中國)有限公司，上海 201206；4.中國科學院核心植物園，云南 勐侖 666303；5.貴陽學院生物與環(huán)境工程學院，貴州 貴陽 550005；6.普洱學院，云南 普洱 665000；7.沈陽農(nóng)業(yè)大學，遼寧 沈陽 110866)

具備連續(xù)流進樣技術的同位素比值質(zhì)譜(isotope ratio mass spectrometry, IRMS)具有自動化程度高、分析速度快和穩(wěn)定性好等特點，已被廣泛應用于地球化學[1-2]、環(huán)境科學[3-4]和食品科學[5-6]等領域。以往研究大多數(shù)基于元素分析(elemental analyzer)-同位素比值質(zhì)譜(EA-IRMS)聯(lián)機系統(tǒng)的快速燃燒原理，可對樣品總體碳(δ13C)、氮(δ15N)同位素進行測定，極大地拓展了同位素技術的指示、示蹤和整合功能[7-8]。但是，由于研究對象在物種、時間和空間上的變化，導致了其體系內(nèi)部不同化合物代謝過程的差異性與復雜性，僅依賴總體同位素分析往往缺乏代表性和可信性，甚至可能造成分析過程的誤判。體系內(nèi)特定化合物通常具有較固定或明確的生物化學過程，針對特定化合物的同位素分析具有更好的指向性。盡管如此，目前的EA-IRMS無法檢測復雜體系中特定化合物的同位素組成。

氣相色譜-燃燒-同位素比值質(zhì)譜儀(GC-C-IRMS)聯(lián)機系統(tǒng)可對復雜體系中的不同化合物進行色譜分離，依次燃燒轉(zhuǎn)化為氣態(tài)的CO2或N2，實現(xiàn)特定化合物δ13C和δ15N的測定[5,9-10]，具有靈敏度高、檢測范圍寬和重現(xiàn)性好等優(yōu)點[9,11-14]。精度和準確度是評價GC-C-IRMS性能的關鍵指標，對于評價GC-C-IRMS對特定化合物的檢測能力具有重要意義[7,15-17]?？紤]到節(jié)省成本或待測樣品稀缺，目標化合物濃度(或C、N元素含量)較低時，會導致分析測試時進樣量也較低。此外，某些化學結構相似的化合物在色譜柱上的保留時間接近，即使優(yōu)化色譜條件也可能無法使相鄰色譜峰間實現(xiàn)完全的基線分離，峰-峰交互干擾會影響測定結果的準確性。為實現(xiàn)完全的基線分離，樣品進樣量或由其轉(zhuǎn)化的CO2或N2信號強度應盡量低。

GC-C-IRMS對微量化合物檢測的不確定性限制了特定化合物同位素分析技術的應用。咖啡因(C8H10N4O2)是一種黃嘌呤生物堿有機化合物，因其化學成分和結構簡單，在GC-C-IRMS中可以完全地氣化、洗脫和燃燒轉(zhuǎn)化，可作為大多數(shù)特定化合物C、N同位素質(zhì)譜測定的公認標準[18]。氨基酸(RCHNH2COOH)是構成蛋白質(zhì)的基本單元，也是聯(lián)系生物界和非生物界的重要樞紐物質(zhì)，利用特定氨基酸C、N同位素技術可以精準識別生態(tài)系統(tǒng)中不同生物的營養(yǎng)級位置[19-20]。生物體內(nèi)氨基酸種類繁雜、濃度差異大，過高進樣量會導致出峰時間接近的氨基酸化合物無法實現(xiàn)峰-峰完全分離，過低進樣量會降低信噪比而影響δ13C和δ15N測量的精準度。

基于此，迫切需要綜合評價進樣量和信號強度對GC-C-IRMS測定δ13C和δ15N的影響。本工作擬以咖啡因化合物為研究對象，在保證δ13C和δ15N測定精準度的前提下，探討GC-C-IRMS對進樣量和信號強度變化的響應特征，并結合多種氨基酸衍生物測定，揭示GC-C-IRMS測定復雜體系內(nèi)特定化合物δ13C和δ15N的性能表現(xiàn)。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

GC-C-IRMS聯(lián)機系統(tǒng)：美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品，主要由TriPlus RSH自動進樣器、Trace 1310 GC氣相色譜儀、GC IsoLink Ⅱ燃燒轉(zhuǎn)化單元、ConFlo IV連續(xù)流通用接口和DELTA V Advantage同位素比值質(zhì)譜儀5部分組成。特定化合物通過TriPlus RSH自動進樣器自動注入Trace 1310 GC，色譜分離后進入GC IsoLink II燃燒轉(zhuǎn)化單元，經(jīng)過填裝Ni和Cu的微型氧化管燃燒轉(zhuǎn)化為CO2或N2氣體后進入ConFlo Ⅳ連續(xù)流通用接口，再經(jīng)開口分流器引入DELTA V Advantage同位素比值質(zhì)譜儀。DELTA V Advantage可將CO2氣體電離為[12C16O2]+、[13C16O2]+和[12C16O18O]+，或?qū)2氣體電離為[14N2]+、[14N15N]+和[15N2]+，經(jīng)由通用三杯接收器采集和不同電阻值的放大器轉(zhuǎn)化為電壓信號后實現(xiàn)δ13C或δ15N的測定。

1.2 材料與試劑

將IAEA-600咖啡因標準物質(zhì)(國際原子能機構產(chǎn)品)溶解于丙酮溶劑待測；丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、α-氨基丁酸(α-ABA)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)、蛋氨酸(Met)、谷氨酸(Glu)和苯丙氨酸(Phe)共12種氨基酸及其混合物：純度≥ 99.9%，均為美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。氨基酸衍生化過程：首先將上述氨基酸混合物充分干燥后溶解于1 mL亞硫酰氯-異丙醇溶液(1∶4，V/V)中，于110 ℃酯化2 h；經(jīng)氮氣吹干后，再加入1 mL新戊酰氯-二氯甲烷溶液(1∶4，V/V)，于110 ℃酰化2 h；氮吹儀去除多余的衍生化試劑，最后將生成的O-異丙醇酯(NPP)衍生物溶解于0.5 mL二氯甲烷溶劑中待測[17,20]。使用USGS-40和USGS-41標準物質(zhì)(美國地質(zhì)調(diào)查局產(chǎn)品)對CO2(純度99.995%)和N2(純度99.999%)工作標氣(液化空氣上海有限公司產(chǎn)品)進行標定。標準物質(zhì)信息列于表1。

表1 標準物質(zhì)的同位素信息Table 1 Isotopic information of the standards

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件 咖啡因和氨基酸混合物均采用TG-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)進行分離，以高純氦氣(99.999%)為載氣。

咖啡因分析的色譜參數(shù)：載氣流速1.2 mL/min；進樣口溫度260 ℃；程序升溫：起始溫度50 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升溫至260 ℃，保持3 min，總時長25 min。

氨基酸分析的色譜參數(shù)：載氣流速2 mL/min；進樣口溫度250 ℃；程序升溫：起始溫度60 ℃，保持2.5 min，以15 ℃/min升溫至110 ℃后，立即以3 ℃/min升溫至150 ℃，再立即以6 ℃/min升溫至230 ℃，保持6 min，最后以25 ℃/min升溫至300 ℃，保持1 min，總時長42.3 min。為保證不同氨基酸的色譜分離效果，每隔24 h進行200～300 ℃梯度升溫烘烤約2 h以活化色譜柱。

1.3.2燃燒轉(zhuǎn)化單元 燃燒轉(zhuǎn)化溫度為1 000 ℃。為確保待測化合物充分燃燒轉(zhuǎn)化，分析咖啡因時，每隔7～10天注入O2約1 h以活化氧化管；分析氨基酸混合物時，每隔24 h注入O2約1 h以活化氧化管。測定δ15N時，須使用液態(tài)氮冷凍去除樣品燃燒產(chǎn)生的CO2氣體，防止[CO]+碎片離子對相同質(zhì)荷比的[N2]+分子離子造成干擾。

1.3.3質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源(EI)；加速電壓2.98 kV；發(fā)射電流1.50 mA；電子能量123.95 eV；引出電壓大于80%；質(zhì)譜真空度1.6×10-4Pa；識別起、止色譜峰的斜率0.2、0.4 mV/s；最小檢出信號20 mV；咖啡因δ13C和δ15N分析的本底值扣除方法采用Calc Mean BGD，即取出峰前5 s內(nèi)所有本底值(BGD)信號數(shù)據(jù)點的平均值；氨基酸δ13C和δ15N分析的本底值扣除方法采用Individual BGD，即取出峰前5 s內(nèi)最小的連續(xù)5個BGD信號數(shù)據(jù)點的移動平均值。

1.4 實驗方法

1.4.1咖啡因測定 稱取IAEA-600咖啡因標準物質(zhì)，配制成14種濃度(0.5～150 mg/L)的咖啡因-丙酮溶液，用于測定δ13C。采用不分流進樣模式，進樣體積1 μL?？Х纫?C8H10N4O2)C含量為49.44%，可以實現(xiàn)不同C質(zhì)量(0.25～74.16 ng)的柱上進樣量。用同樣方法配制14種濃度(5～350 mg/L)的咖啡因-丙酮溶液用于δ15N測定，咖啡因N含量為28.86%，可以實現(xiàn)不同N質(zhì)量(1.44～101.01 ng)的柱上進樣量?？Х纫驑藴饰镔|(zhì)濃度梯度信息列于表2。

表2 咖啡因標準物質(zhì)濃度梯度信息Table 2 Concentration gradient of the caffeine standards

1.4.2氨基酸測定 為檢驗信號強度對混合體系內(nèi)特定化合物δ13C測定的影響，以12種氨基酸混合物為研究對象，采用5種模式進樣，即進樣體積1 μL，不分流；進樣體積0.2 μL，不分流；進樣體積0.1 μL，不分流；進樣體積0.5 μL，分流比10∶1；進樣體積0.1 μL，分流比10∶1。前3種模式測試1次，后2種模式測試2次。

由于氨基酸N含量較低，且IRMS對N2的離子化效率較低[21]，若進樣體積小于1 μL或采用分流模式，將導致N2信號強度過低而無法檢出。因此，本研究僅采用進樣體積為1 μL且不分流模式，每隔12 h測試1次上述氨基酸δ15N，共測試8次，以評價GC-C-IRMS對混合體系內(nèi)特定氨基酸δ15N測定的時間穩(wěn)定性。每種氨基酸的分子結構由氣相色譜-同位素比值質(zhì)譜(GC-IRMS)[22]分析得到。

EA-IRMS是目前精準測定樣品總體同位素最重要的系統(tǒng)之一，其測定結果常被作為公認結果。EA-IRMS對δ15N的測定基于快速燃燒原理，將樣品在1 000 ℃高溫和過氧環(huán)境下瞬間燃燒，經(jīng)Cu還原形成N2等氣體，并通過除鹵除硫劑及H2O和CO2吸附劑，純化后的N2進入IRMS測定。作為對比，基于EA-IRMS[15]對12種氨基酸δ15N進行單獨測定，主要參數(shù)設定參考文獻[15,21]，每種氨基酸重復測定6次，交叉驗證GC-C-IRMS與EA-IRMS對混合體系內(nèi)特定氨基酸δ15N測定結果的一致性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用GC-C-IRMS和EA-IRMS測量δ13C和δ15N時，需要使用CO2和N2工作標氣進行標定，溯源至國際標準，計算公式如下：

δSpl-ST(‰)=δSpl-WG+δWG-ST+

δSpl-WG×δWG-ST× 10-3

式中，Spl表示咖啡因或氨基酸；WG表示工作標氣；ST表示國際標準，如VPDB或Air-N2。工作標氣δWG-ST采用兩點線性內(nèi)插法進行校準：使用USGS-40和USGS-41同位素標準物質(zhì)，通過EA-IRMS測量后建立標準值與測量值的線性方程，將工作標氣初始值代入該方程后得到校準后的δWG-ST，其δ13C和δ15N校準值分別為(-30.36 ± 0.03)‰和(-1.27 ± 0.05)‰(n=5)。以上數(shù)據(jù)處理通過同位素比值質(zhì)譜儀專用軟件Isodat 3.0(美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品)完成。

2 結果與討論

2.1 GC-C-IRMS測定咖啡因δ13C和δ15N

GC-C-IRMS測定IAEA-600咖啡因標準物質(zhì)δ13C的進樣量和信號強度響應特征示于圖1。隨著進樣C質(zhì)量從0.25 ng增加到74.16 ng時，CO2的信號強度由23 mV逐漸增大到7 706 mV。較低且穩(wěn)定的CO2本底值是保證小樣品量樣品δ13C測定精度和準確度的重要前提[7]。本研究中，咖啡因δ13C產(chǎn)生的CO2本底值(BGD 44)平均為(3.8 ± 0.4) mV。測定結果表明，當C質(zhì)量< 1 ng或m/z44信號<100 mV時，能夠?qū)崿F(xiàn)對樣品的檢測，但是過低的信噪比會導致咖啡因δ13C測定值精度較差；當C質(zhì)量≥1 ng或m/z44信號≥100 mV時，咖啡因δ13C的測定精度和準確度可達到實驗室分析要求[5,12-13]，其平均精度為0.16‰，平均分析誤差為0.09‰。值得注意的是，即使C質(zhì)量高達70 ng或m/z44信號高達7 800 mV以上，該系統(tǒng)仍能保證δ13C的測定精準度，表明在進樣量較大時，GC-C-IRMS仍可將目標化合物完全燃燒轉(zhuǎn)化。

圖1 GC-C-IRMS測定咖啡因δ13C的進樣量(a)和信號強度(b)響應特征Fig.1 Response of GC-C-IRMS on caffeine δ13C measurement to sample size (a) and signal intensity (b)

GC-C-IRMS測定IAEA-600咖啡因標準物質(zhì)δ15N的進樣量和信號強度響應特征示于圖2。隨著進樣N質(zhì)量從1.44 ng 增加到101.01 ng，N2信號強度由18 mV逐漸增大到1 926 mV。本研究測定δ15N時，本底值(BGD 28)平均為(38±4) mV。由于本底效應的影響較大，而且IRMS對N2的離子化效率較低[21,23]，GC-C-IRMS在小樣品量條件下測定咖啡因δ15N時的精準度相對δ13C略低。測定結果表明，只有當N質(zhì)量≥ 5 ng或m/z28信號≥ 100 mV時，該系統(tǒng)對咖啡因δ15N的測定精度和準確度才能滿足實驗室測試要求[7,14-15]，其平均精度為0.27‰，平均分析誤差為0.13‰。當進樣量較大(N質(zhì)量≥100 ng)時，該系統(tǒng)仍然可以將目標化合物中的N完全轉(zhuǎn)化為N2，并能夠保證δ15N的精準度。

圖2 GC-C-IRMS測定咖啡因δ15N的進樣量(a)和信號強度(b)響應特征Fig.2 Response of GC-C-IRMS on caffeine δ15N measurement to sample size (a) and signal intensity (b)

2.2 GC-C-IRMS測定氨基酸混合體系δ13C

GC-C-IRMS測定12種氨基酸混合體系中δ13C的色譜圖示于圖3。由于氨基酸極性強、不易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性差，在進行GC-C-IRMS分析之前需要將其衍生化為弱極性、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性好的氨基酸衍生物。測定結果表明，12種氨基酸的出峰時間在750～1 700 s之間，峰寬一般在10～15 s之間。每種特定氨基酸重復測量的出峰時間漂移一般不超過1 s，每種氨基酸m/z44的信號強度在100～1 000 mV之間，根據(jù)2.1節(jié)分析結果，上述12種氨基酸δ13C的測定精度和準確度均可達到實驗室分析要求。增加進樣量有助于提高單一體系氨基酸δ13C的測定精準度，但進樣量過高會導致混合體系內(nèi)色譜保留時間相近的氨基酸不能實現(xiàn)完全的峰-峰分離。為確保每個特定化合物的色譜峰能夠完全基線分離，在滿足GC-C-IRMS實驗室測試精準度要求的前提下，由待測化合物轉(zhuǎn)化的CO2信號強度應盡量低[5,10]。

注：1～4為CO2參比峰，5～16分別為丙氨酸、甘氨酸、α-氨基丁酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、谷氨酸和苯丙氨酸的CO2樣品峰圖3 GC-C-IRMS測定混合體系中特定氨基酸δ13C的色譜圖Fig.3 Chromatogram of specific amino acid δ13C by GC-C-IRMS

GC-C-IRMS測定12種氨基酸混合體系中δ13C的信號強度依賴性特征示于圖4。氨基酸δ13C測定過程中CO2本底(BGD 44)值較低，其平均值為(7.0±7.5) mV。在不同進樣模式下，12種氨基酸的m/z44信號強度主要在50～5 000 mV范圍內(nèi)呈梯度變化。其中，甘氨酸、蘇氨酸和絲氨酸的m/z44信號強度出現(xiàn)低于50 mV的情況，α-氨基丁酸、天冬氨酸、谷氨酸和苯丙氨酸的m/z44信號強度可達3 000 mV以上。當m/z44信號強度≥ 100 mV，上述12種氨基酸δ13C的測定值依次為(-22.73 ± 0.85)‰、(-29.56 ± 0.85)‰、(-25.44 ± 0.99)‰、(-21.37 ± 0.32)‰、(-21.44 ± 0.73)‰、(-21.96 ± 0.31)‰、(-24.28 ± 0.35)‰、(-24.14 ± 0.62)‰、(-23.80 ± 0.58)‰、(-27.56 ± 0.50)‰、(-6.89 ± 0.21)‰和(-18.94 ± 0.44)‰，δ13C測定結果的平均精度為0.56‰，且未表現(xiàn)出對m/z44信號強度的依賴性(斜率接近0)?？梢?，GC-C-IRMS可以實現(xiàn)對混合體系中特定氨基酸δ13C的有效測定。需要注意的是，氨基酸衍生化過程中會引入新的碳源，GC-C-IRMS測定氨基酸衍生物δ13C后，可依據(jù)同位素質(zhì)量守恒原理扣除外源碳δ13C所占權重，得到氨基酸δ13C校準值[22]。

圖4 GC-C-IRMS測定混合體系中特定氨基酸δ13C的信號強度依賴性特征Fig.4 Signal intensity dependence of specific amino acid δ13C by GC-C-IRMS

2.3 GC-C-IRMS測定氨基酸混合體系δ15N

GC-C-IRMS測定12種氨基酸混合體系中δ15N的色譜圖示于圖5。12種氨基酸的出峰時間在750～1 700 s之間，峰寬一般在15～25 s之間。每種特定氨基酸重復測量的出峰時間漂移為3 s左右，每種氨基酸樣品峰對應的本底值(BGD 28)約為50 mV。僅絲氨酸產(chǎn)生的m/z28信號強度略低于100 mV，其余11種氨基酸的m/z28信號強度均在100～400 mV之間，能夠保證氨基酸δ15N的分析精準度。為實現(xiàn)氨基酸峰-峰之間的最佳基線分離，由樣品轉(zhuǎn)化的N2信號強度同樣不應過高。需要指出的是，氨基酸δ15N測定過程中，m/z28信號強度會受到GC-C-IRMS使用年限以及衍生化方式等因素影響[9-10,16,20]。

注：1～4為N2參比峰，5～16分別為丙氨酸、甘氨酸、α-氨基丁酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、蛋氨酸、谷氨酸和苯丙氨酸的N2樣品峰圖5 GC-C-IRMS測定混合體系中特定氨基酸δ15N的色譜圖Fig.5 Chromatogram of amino acid δ15N by GC-C-IRMS

GC-C-IRMS測定12種氨基酸混合體系中δ15N與EA-IRMS單獨測定的一致性特征示于圖6。GC-C-IRMS在較低檢測信號(即較低柱上進樣量)條件下對特定氨基酸δ15N測定結果表明，12種氨基酸δ15N連續(xù)4天(間隔12 h)的測定值依次為(40.52±1.04)‰、(-25.51±1.05)‰、(8.17±0.57)‰、(0.46±0.91)‰、(1.90±0.89)‰、(-1.99±0.97)‰、(-0.92±1.13)‰、(1.86±1.50)‰、(4.31±1.33)‰、(-2.48±0.92)‰、(43.63±0.63)‰和(3.15±0.57)‰，平均精度為0.96‰。GC-C-IRMS對混合體系內(nèi)12種氨基酸δ15N測定結果與EA-IRMS單獨測定結果相當，平均偏差僅為(0.77±0.34)‰，2種方法的氨基酸δ15N測定值具有較高的一致性(R2=0.997)，驗證了GC-C-IRMS測定混合體系中氨基酸δ15N的可信性。GC-C-IRMS具有高靈敏度、寬檢測范圍和極低耗樣量等優(yōu)勢[5,9,12]，將為特定化合物同位素技術在地球化學和生命科學等領域的應用發(fā)揮重要作用。

圖6 GC-C-IRMS與EA-IRMS測定氨基酸δ15N的對比Fig.6 Comparison of amino acid δ15N by GC-C-IRMS and EA-IRMS

3 結論

本研究基于GC-C-IRMS系統(tǒng)測定了咖啡因化合物和氨基酸混合體系中δ13C和δ15N。結果表明，在極小進樣量和極低信號強度的情況下，該系統(tǒng)對于測定δ13C和δ15N具有良好的精準度。在對氨基酸混合體系δ13C和δ15N的測定過程中，GC-C-IRMS可保證m/z44和m/z28具有足夠的信號強度并避免了峰-峰交互干擾現(xiàn)象。在不同進樣模式下，12種特定氨基酸δ13C測定值為-29.56‰～-6.89‰，平均測定精度為0.56‰。在較低檢測信號條件下，GC-C-IRMS可以保證氨基酸δ15N測定結果具有良好的時間重現(xiàn)性，與EA-IRMS測定結果的平均偏差為0.77‰。

致謝：感謝中國科學技術大學張忠義博士對本研究中氨基酸樣品前處理及其同位素測定提供的幫助。