高建萍，張 揚，邢芳毓，王俊杰，徐 軍，孔英俊，羅 希，張貴鋒

(1.中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室，北京 100190；2.中國科學院大學化學工程學院，北京 100049)

膠原蛋白是由3條鏈形成的右手螺旋結構，是動物組織細胞外基質中的主要結構蛋白，約占蛋白總量的25%～30%[1]，廣泛存在于皮膚、骨骼、跟腱及結締組織中[2-4]，是肝、肺、腎等內臟的重要組成部分[5-7]。目前，文獻[8-9]報道的膠原蛋白有28種，不同組織中的蛋白類型及含量各不相同，不同類型膠原蛋白的含量變化與年齡、疾病及其生物機能息息相關。肝硬化組織中膠原蛋白含量是正常肝組織的4～7倍，最高可達近10倍。Ⅰ型和Ⅲ型膠原是肝包膜、門靜脈間質、竇周間隙和纖維隔膜中最豐富的膠原。在正常新鮮的肝臟組織中，Ⅰ型/Ⅲ型膠原蛋白的比例小于1，而在肝硬化組織中的比例顯著增大[10-11]；Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白約占肺膠原蛋白總量的90%，肺纖維化組織中Ⅰ型膠原蛋白含量及Ⅰ型/Ⅲ型膠原蛋白比例顯著增大[9,12]；有研究表明[13]，在腎炎和腎小球硬化的過程中，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的沉積均顯著增加。因此，建立組織中不同類型膠原蛋白的定量檢測方法可為相關疾病的診斷提供理論基礎。

不同來源、不同類型的膠原蛋白結構及理化性質無明顯差異，難以實現不同類型膠原蛋白的定量分析[14-15]。傳統(tǒng)的羥脯氨酸法是測定膠原蛋白水解液中羥脯氨酸的含量，再換算為膠原蛋白含量，但僅用于測定膠原蛋白總量，無法定量分析不同類型的膠原蛋白，且羥脯氨酸在膠原蛋白中的比例受物種、年齡和組織部位的影響[16]。目前，常用的膠原蛋白定量檢測方法有天狼星紅染色法[17]、酶聯免疫(ELISA)法[18]、高效液相色譜-質譜(HPLC-MS)法[19]等。其中，天狼星紅染色法通過酸性染料與膠原纖維反應使其產生雙折光現象，從而通過偏振光區(qū)分不同類型的膠原纖維，通過顏色深淺和面積大小進行定量，該方法屬于相對定量，而且膠原纖維的雙折光會隨時間的推移而減弱，容易出現假陽性結果；ELISA法利用抗原和抗體特異性結合顯色檢測不同類型的膠原，此方法操作繁瑣，存在非特異性吸附，難以定量組織中的膠原；孫坤等[20]利用HPLC-MS法定量檢測牛Ⅰ型膠原蛋白，該方法特異性強，但應用選擇離子監(jiān)測進行外標法定量不適用于分析基質復雜的樣品。

本研究擬利用高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)法測定小鼠肝、肺、腎組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量，考察Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量及比例隨年齡的變化情況，并驗證HPLC-MS/MS法的專一性、準確性及可靠性，以期為動物組織中不同類型膠原蛋白含量的分析提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與裝置

Orbitrap(Exploris 480)和TSQ Quantum ACCESS MAX三重四極桿質譜儀：美國Thermo Fisher科技有限公司產品，配備采集軟件Xcalibur 4.4和數據處理軟件Protein Discoverer 2.4；LGJ-100F 真空冷凍干燥機：北京松源華興科技發(fā)展有限公司產品；HC-2518R 高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司產品；MYP19-2磁力攪拌器：上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司產品。

1.2 材料與試劑

小鼠(C57BL/6N，雄性)：購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

乙腈、甲酸：色譜純，德國Merck公司產品；胰蛋白酶(V5111)：序列純，美國Promega公司產品；特征多肽和內標肽：純度>98%，由上海強耀公司合成；其他試劑均為分析純。

1.3 樣品前處理

1.3.1雜蛋白去除 分別取0、1、3、6、9、12、15、18周齡的小鼠，每個周齡10只，將小鼠脫臼處死后，取各周齡小鼠的肝、肺、腎，稱重；將新鮮的肝、肺、腎組織按質量比1∶10加入Tris-HCl 緩沖液(0.1 mol/L，pH 8.2，含5%曲拉通-100)中，于4 ℃低速攪拌24 h，期間換液2次，水洗除去殘留的Tris-HCl溶液，凍干、稱重、待用。

1.3.2酶解 稱取5 mg凍干樣品，加入5 mL NH4HCO3緩沖液(0.05 mol/L，pH 8.0)，于60 ℃水浴變性反應30 min，取出冷卻；取1 mL冷卻后的樣品與胰蛋白酶混合(100 μL，20 μg)，于37 ℃恒溫反應器中酶解18 h，以10 000 r/min離心10 min，待用。

1.4 特征多肽識別

1.4.1實驗條件 色譜條件：Peptide BEH C18柱(2.1 mm×150 mm×1.7 μm)；流動相A為水(含0.1%脂肪酸)，B為60%乙腈(含0.1%脂肪酸)；梯度洗脫為0～60 min(5%～40%B)，60～85 min(40%～90%B)，85～98 min(90%B)，98～100 min(90%～5%B)，100～110 min(5%B)；流速0.2 mL/min。

質譜條件：離子源噴霧電壓3.5 kV；毛細管溫度320 ℃；鞘氣流速19.8 mL/min；輔助氣流速34 kPa；正離子掃描模式；掃描事件1為全掃描，質量掃描范圍m/z400～2 000，分辨率60 000，射頻透鏡電壓為最大值的45%，歸一化的最大增益電壓300%，最大離子注入時間100 ms；掃描事件2為data dependent MS/MS，分辨率為15 000，隔離窗口為m/z1.6，最大離子注入時間200 ms，歸一化的最大增益電壓100%，碰撞能量30%，循環(huán)時間2 s。

1.4.2數據處理 采用Protein Discoverer 2.4 軟件對數據進行搜庫，并通過Blast序列比對的方法確定小鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白特征多肽。

1.5 定量分析

1.5.1標準樣品配制 分別準確稱取10.0 mg Ⅰ、Ⅲ型膠原特征多肽，混合后用NH4HCO3緩沖液(0.05 mol/L，pH 8.0)配制成不同濃度的標準溶液。以相同方法配制內標肽溶液，其信號響應與樣品相當。將內標肽分別與Ⅰ、Ⅲ型膠原特征多肽混合溶液、樣品酶解液混合(1∶1，V/V)，以10 000 r/min離心10 min，待用。

1.5.2實驗條件 色譜條件：Zorbax C18柱(2.1 mm × 150 mm×5 μm) ; 流動相A為水(0.1% 甲酸)，B 為60%乙腈水溶液(0.1%甲酸)；梯度洗脫為0～3 min(5%～25%B)，3～7 min(25%～100%B)，7～8 min(100%B)，8～8.1 min(100%～5%B)，8.1～10 min(5%B)；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；上樣量5.0 μL。

質譜條件：離子源噴霧電壓3.5 kV，毛細管溫度320 ℃，蒸發(fā)溫度350 ℃，鞘氣流速19.8 mL/min，輔助氣流速55 kPa，正離子掃描模式，選擇反應監(jiān)測(SRM)模式：m/z310.67>466.34(多肽GPSGFR)、m/z443.76>613.29(多肽GSEGPQGVR)、m/z288.66>406.18(內標肽GLAGMK)。

1.5.3數據處理 按式(1)計算試樣中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量：

(1)

式中，Xi表示試樣中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量；Ci表示質譜法測得的小鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白特征多肽濃度；V表示樣品最終定容體積；M1表示Ⅰ型或Ⅲ型膠原蛋白的分子質量；M2表示Ⅰ型或Ⅲ型膠原蛋白特征多肽的分子質量；m表示最終樣液代表的試樣質量；X表示酶解后樣品稀釋倍數；n表示Ⅰ型或Ⅲ型膠原換算系數，列于表1。

表1 Ⅰ、Ⅲ型膠原換算系數Table 1 Conversion coefficients of type Ⅰ and Ⅲ collagen

根據式(2)、(3)計算Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白比例：

(2)

Ⅲ型膠原蛋白比例=1-Ⅰ型膠原蛋白比例

(3)

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SAS 9.3統(tǒng)計軟件處理數據，并用X±S(標準偏差)表示，對各組數據進行單因素方差分析，組間比較采用 SNK-q 檢驗，P≤0.05 表示差異統(tǒng)計學意義。

2 結果與討論

2.1 小鼠肝、肺、腎中特征多肽識別

小鼠肝、肺、腎中膠原蛋白酶解產物的總離子流圖示于圖1。小鼠Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白存在大量的局部相同序列和部分差異序列，其中差異序列可作為Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的特征多肽。利用Protein Discoverer軟件檢索得到的質譜圖，并對小鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的氨基酸序列進行比對。小鼠腎臟中m/z443.722的一級和二級質譜圖示于圖2，其二級碎片離子與多肽GSEGPQGVR的理論碎片一致(Xcorr 2.956)。通過Blast多序列比對，多肽GSEGPQGVR只存在于小鼠的Ⅰ型膠原蛋白α1鏈中，因此，其可作為小鼠Ⅰ型膠原蛋白的特征多肽。采用同樣方法鑒定到5種Ⅰ型和2種Ⅲ型膠原特征多肽，列于表2。

表2 小鼠肝、肺、腎中識別的特征多肽Table 2 Identified marker peptides of the liver, lung and kidney in mouse

圖1 小鼠肝(a)、肺(b)、腎(c)酶解產物的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of the digestion from liver (a), lung (b) and kidney (c) in mouse

圖2 小鼠腎臟中m/z 443.722的一級(a)和二級(b)質譜圖Fig.2 MS (a) and MS/MS (b) spectra of ion m/z 443.722 detected in mouse kidney

用于Ⅰ、Ⅲ型膠原定量分析的特征多肽應滿足以下條件：1) 在所有樣本中均能檢測到；2) 屬于膠原蛋白三螺旋結構的一部分；3) 屬于胰蛋白酶特異性酶切肽段，不存在漏切位點；4) 特征多肽的HPLC-MS/MS色譜峰重復性符合要求；5) 所選特征多肽必須為特定膠原類型特有，即在SwissProt/NCBInr數據庫中不存在任何其他蛋白質[19-21]。根據以上條件，本研究分別選擇GSEGPQGVR、GPSGFR作為小鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白定量分析的特征多肽。小鼠肝、肺、腎組織基質較復雜，為排除基質對定量結果的影響，采用內標法分析膠原蛋白含量，設計符合膠原蛋白氨基酸序列特征G(甘氨酸)-X-Y的內標肽GLAGMK；通過SwissProt/NCBInr數據庫檢索，多肽GLAGMK不存在于小鼠體內；此多肽與目標肽的保留時間接近，且在HPLC-MS/MS譜圖中信號穩(wěn)定。因此，選擇多肽GLAGMK作為小鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白定量分析的內標肽。

2.2 分析方法驗證

2.2.1標準曲線、線性范圍、定量限、檢出限利用內標法定量分析小鼠肝、肺、腎中的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白，并考察多肽GSEGPQGVR和GPSGFR的線性范圍、檢出限、定量限。

用0.05 mol/L NH4HCO3溶液配制1、5、10、50、100、250、500 mg/L的特征多肽GSEGPQGVR和GPSGFR混標溶液，并與內標肽GLAGMK按體積比1∶1混合，按照1.5節(jié)方法進行定量分析。多肽GSEGPQGVR、GPSGFR和內標肽GLAGMK的色譜圖示于圖3，保留時間分別為5.21、5.74、6.45 min。多肽GSEGPQGVR和GPSGFR的最小檢出濃度分別為8、5 μg/L。以特征多肽峰面積與內標肽峰面積比值為橫坐標，特征多肽濃度為縱坐標，得到線性回歸方程，列于表3。特征多肽GSEGPQGVR和GPSGFR在1～500 mg/L濃度范圍內的線性關系良好。

圖3 特征多肽GSEGPQGVR(a)、GPSGFR(b)、內標肽GLAGMK(c)的色譜圖Fig.3 Chromatograms of marker peptide GSEGPQGVR (a), GPSGFR (b) and internal peptide GLAGMK (c)

表3 Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白特征多肽的定量標準曲線Table 3 Standard curves of the type Ⅰ and Ⅲ collagen marker peptide

2.2.2回收率、精密度和穩(wěn)定性 向已知濃度的肝、肺、腎基質樣品中添加相應濃度的特征多肽，GSEGPQGVR和GPSGFR的添加量分別為500、300 ng，每個樣品重復3次，計算平均添加回收率和相對標準偏差，列于表4。結果表明，2種特征多肽的添加回收率在86%～118%之間，相對標準偏差小于4%。其中，肝、肺、腎樣品的回收率分別為112%～118%、93%～109%、86%～87%。

表4 Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白特征多肽的加標回收率及相對標準偏差Fig.4 Standard addition recovery and relative standard deviation of type Ⅰ and Ⅲ collagen marker peptide

分別取50 μg/L特征多肽GSEGPQGVR和GPSGFR，按1.5節(jié)方法進行6次重復實驗。特征多肽GSEGPQGVR和GPSGFR的峰面積標準偏差分別為2.24%、3.62%，表明本方法的精密度良好，能夠滿足檢測要求。

將肝、肺、腎3種組織酶解產物于-20 ℃保存，分別于1、7、14天對Ⅰ、Ⅲ型膠原特征多肽GSEGPQGVR和GPSGFR進行檢測，結果列于表5?？梢?，不同組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白特征多肽的峰面積RSD均低于4%，表明該方法較穩(wěn)定。

表5 肝、肺、腎組織酶解產物放置不同天數后，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白特征多肽峰面積相對標準偏差Table 5 Relative standard deviation of type Ⅰ and Ⅲ collagen marker peptide after the hydrolysates of liver, lung and kidney with different days

2.3 小鼠生長過程中，肝、肺、腎中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白比例的變化

取新鮮的小鼠肝、肺、腎組織，按照1.3節(jié)方法除雜，取5.0 mg凍干后的組織樣品，酶解，利用1.5節(jié)方法對0～18周小鼠肝、肺、腎組織樣品中的Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白特征多肽含量進行分析，并根據式(1)計算Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量，根據式(2)計算Ⅰ型膠原蛋白的比例，結果示于圖4?？梢?，肝中Ⅰ型膠原蛋白的比例在0～1周呈迅速增加，1～3周基本不變，3～15周快速增加，15～18周略有下降；肺中Ⅰ型膠原蛋白的比例在0～6周內呈快速增加的趨勢，6～12周基本平穩(wěn)，12～18周緩慢增加；腎中Ⅰ型膠原蛋白的比例在0～1周呈迅速增加的趨勢，1～6周增加速度緩慢，6～15周基本平穩(wěn)，15～18周開始增加。

圖4 小鼠生長過程中，肝、肺、腎中Ⅰ型膠原蛋白比例的變化Fig.4 Ratio changes of type Ⅰ collagen in liver, lung and kidney during growth of mouse

綜上所述，小鼠生長過程中，肝、肺、腎中Ⅰ型膠原蛋白的比例均呈增加趨勢，即第0～1周呈快速增加趨勢，第6～12周呈平穩(wěn)趨勢。3種臟器中Ⅰ型膠原蛋白的比例由高到低大致為腎>肝>肺。相反，肝、肺、腎中Ⅲ型膠原蛋白的比例均呈下降趨勢，即第0～1周快速下降，第1～6周緩慢下降，第6～12周呈平穩(wěn)趨勢，第12～18周緩慢下降。3種臟器中Ⅲ型膠原蛋白的比例由高到低依次為肺>肝>腎。

2.4 小鼠生長過程中，肝、肺、腎中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白總量的變化

根據2.3節(jié)得到的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白含量，分析小鼠生長過程肝、肺、腎中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白總量的變化，示于圖5。結果表明，在0～9周內，肝中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白總量隨周齡的增加而顯著增加(p<0.01)，第9周達到最高值8.07 mg/g，9周之后開始緩慢下降，第18周的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白總量為5.38 mg/g；在0～6周內，肺中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白總量隨周齡的增加而顯著增加(p<0.01)，第6周達到最高值37.62 mg/g，6周之后開始下降，第18周的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白總量為25.71 mg/g，6～18周下降顯著(p<0.01)；在0～9周內，腎中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白總量隨周齡的增加而增加，其中0～1周和1～3周之間均呈顯著增加趨勢(p<0.01)，3～9周緩慢增加，第9周達到最高值43.10 mg/g，9周之后開始迅速下降，其中第9～12周下降顯著(p<0.01)，第18周的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白總量為25.01 mg/g，低于第1周的膠原蛋白含量。

圖5 小鼠生長過程中，肝、肺、腎中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白總量的變化Fig.5 Total contents of type Ⅰ and type Ⅲ collagen in liver, lung and kidney during growth of mouse

綜上所述，小鼠生長過程中，肝、肺、腎中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白總量均呈先增加后降低的趨勢，與羥脯氨酸法測得的變化趨勢一致[22]。3種臟器中，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白總量由高到低的順序為腎>肺>肝。

3 結論

本研究建立了HPLC-MS/MS法測定小鼠肝、肺、腎中的Ⅰ、Ⅲ型膠原特征多肽含量，并考察了方法的添加回收率、精密度、穩(wěn)定性等。結果表明，該方法靈敏度高、準確度高、穩(wěn)定性好，可用于組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白特征多肽含量的測定。隨著小鼠周齡的增加，肝、肺、腎中Ⅰ型膠原蛋白比例呈增加趨勢，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白總量呈先增加后降低的趨勢。該研究可為與膠原蛋白有關的疾病診斷提供輔助方法。