孫雪花， 強(qiáng) 瑜， 田 銳， 張錦婷， 高樓軍

(陜西省化學(xué)反應(yīng)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，延安大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西延安 716000)

卡馬西平(Carbamazepine，CAMP)主治癲癇病，也可用于驚厥、狂躁、神經(jīng)性疼痛等的治療，但在臨床中濃度過(guò)低治療無(wú)效，濃度過(guò)高則有毒副作用。目前卡馬西平的檢測(cè)，多用毛細(xì)管電泳[1]、反相液相色譜[2]、免疫法[3]、拉曼光譜法[4]等。琥乙紅霉素(Erythromycin Ethylsuccinate，EMES)屬于大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，是青霉素過(guò)敏患者治療時(shí)的替代用藥，臨床上出現(xiàn)不良反應(yīng)的幾率低，毒性小，抗菌譜廣，療效確切。近年來(lái)對(duì)其檢測(cè)的方法有：高效液相色譜法[5]、近紅外光譜法[6]、荷移分光光度法[7]、電化學(xué)法[8]。然而，這兩種藥物的檢測(cè)方法有的過(guò)程繁瑣，有的成本較高。熒光分析法因其簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高等特點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用。碳點(diǎn)(Carbon Dots，CDs)作為一種新型的以碳為骨架結(jié)構(gòu)的熒光納米材料，因其毒性低、生物安全性強(qiáng)、化學(xué)穩(wěn)定性高、無(wú)光眨眼和光漂白現(xiàn)象的優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。目前，已廣泛用于環(huán)境監(jiān)測(cè)[9]、生物成像[10,11]以及光電器件[12]等諸多領(lǐng)域。

本文通過(guò)色氨酸對(duì)CDs表面進(jìn)行氮摻雜，大大提高了氮摻雜碳點(diǎn)(NCDs)的熒光量子產(chǎn)率。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)藥物CAMP和EMES對(duì)NCDs的熒光具有一定的猝滅作用，以此建立了檢測(cè)CAMP和EMES的熒光分析新方法。方法用于實(shí)際藥物的檢測(cè)，結(jié)果較好。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

LS-55熒光分光光度計(jì)(美國(guó)，PE公司)；UV-2550型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本，島津公司)；IR Prestige-21傅里葉變換紅外(FTIR)光譜儀(日本，島津公司)；ESCALAB 250XI型X射線光電子能譜(XPS)儀(美國(guó)，賽默飛世爾科技公司)；XRD-7000 X粉末衍射(XRD)儀(日本，島津公司)；Tecnai G2 F20 S -Twin型高分辨透射電子顯微鏡(HRTEM)(美國(guó)，F(xiàn)EI公司)。

EMES標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.002 mol/L)：準(zhǔn)確稱取100 mg EMES標(biāo)準(zhǔn)品(上海哈靈生物科技有限公司)，加入適量無(wú)水乙醇超聲溶解，并用無(wú)水乙醇定容于50 mL容量瓶中，用時(shí)逐級(jí)稀釋。CAMP標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.006 mol/L)：準(zhǔn)確稱取CAMP標(biāo)準(zhǔn)品(上海哈靈生物科技有限公司)0.1404 g，加入適量無(wú)水乙醇超聲溶解，并用無(wú)水乙醇定容于50 mL容量瓶中，用時(shí)逐級(jí)稀釋。

KH2PO4-NaOH緩沖溶液(pH=6.0)、D-麥芽糖(成都市科龍化工試劑廠)、L-色氨酸(上海藍(lán)季生物)。所有試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

琥乙紅霉素片1(批號(hào)：1611483-1，規(guī)格：0.125 g，西安利君制藥有限責(zé)任公司)，琥乙紅霉素片2(批號(hào)：1612483-1，規(guī)格：0.125 g，西安利君制藥有限責(zé)任公司)?？R西平片(批號(hào)：X1091，規(guī)格：200 mg，北京諾華制藥有限公司)。

1.2 NCDs的制備

取3.0 g D-麥芽糖與1.5 g色氨酸，置于50 mL燒杯中，加超純水至25 mL，超聲攪拌溶解，將該溶液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，在200 ℃下反應(yīng)2 h，得到深褐色的NCDs粗溶液。待NCDs溶液冷卻至室溫后，將其在10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，除去大顆粒雜質(zhì)，再用微孔濾膜(0.22 μm)過(guò)濾，即得NCDs原液。

1.3 NCDs熒光量子產(chǎn)率的測(cè)量

取溶于0.050 mol/L的稀H2SO4的硫酸奎寧(Quinine Sulphate，QS)溶液，通過(guò)測(cè)量QS溶液和NCDs稀溶液在同一激發(fā)波長(zhǎng)365 nm下的積分熒光強(qiáng)度和對(duì)該波長(zhǎng)激發(fā)光的吸光度(吸光度相近且均不大于0.05)，文獻(xiàn)報(bào)道方法[13]計(jì)算NCDs熒光量子產(chǎn)率為30.42%。

1.4 CAMP和EMES熒光探針的建立

于10 mL比色管中，加入稀釋104倍的NCDs溶液1.50 mL，K2HPO4-NaOH緩沖溶液(pH=6.0)在測(cè)定CAMP時(shí)加入1.00 mL，測(cè)定EMES時(shí)加入0.50 mL，再加入適量CAMP標(biāo)準(zhǔn)溶液或者EMES標(biāo)準(zhǔn)溶液，用超純水稀釋至刻度，搖勻。在室溫下靜置10 min后，于λex=365 nm，λem=440 nm處測(cè)定體系熒光強(qiáng)度F和空白試劑的熒光強(qiáng)度F0。體系熒光猝滅強(qiáng)度ΔF=F0-F與藥物CAMP和EMES之間存在線性關(guān)系。

2 結(jié)果與討論

2.1 NCDs的形貌與結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 透射電鏡和X射線衍射圖1A為NCDs的透射電子顯微鏡(TEM)的照片，可以看出NCDs呈球形顆粒，分散性良好，無(wú)團(tuán)聚現(xiàn)象。圖1A中的插圖顯示NCDs晶格間距為0.32 nm，對(duì)應(yīng)于石墨碳的(002)晶面，說(shuō)明所得NCDs具有石墨碳的結(jié)構(gòu)[13]。由圖1B看出NCDs的平均粒徑約為3.0 nm，尺寸較小。圖1C X射線衍射(XRD)顯示，NCDs在2θ=22.4°處出現(xiàn)了一個(gè)寬的衍射峰，晶面間距較大，可歸屬為石墨碳的(002)晶面[14]，與TEM圖一致。相比于CDs，衍射峰位置偏差不大，但晶格間距明顯增大，說(shuō)明摻雜后的CDs顆粒粒徑較小，這可能是由于含氧和含氮基團(tuán)的存在導(dǎo)致了晶格間距的增大。

圖1 NCDs的透射電鏡(TEM)和X射線衍射(XRD)圖Fig.1 The TEM and XRD diagram of the NCDs

2.1.2 X射線光電子能譜采用X射線光電子能譜(XPS)對(duì)NCDs的元素及其官能團(tuán)進(jìn)行分析，從圖2A發(fā)現(xiàn)，有對(duì)應(yīng)C、N和O元素的特征峰283 eV、399 eV、530 eV出現(xiàn)。圖2B中顯示283.93 eV、287.73 eV、291.58 eV譜峰應(yīng)為C 1s的C=O、C=C特征峰；圖2C的530.78 eV譜峰是O 1s的C=O[15]；圖2D的399.43 eV譜峰是N 1s光譜的C-N。證明NCDs表面存在大量含O和含N官能團(tuán)。

圖2 NCDs的XPS總譜(A)及高分辨C1s譜(B)、O1s譜(C)和N1s譜(D)Fig.2 (A)The full scan XPS of NCDs.high resolution XPS of C 1s(B),O1s(C) and N1s(D)

2.1.3 紅外光譜、熒光光譜和紫外光譜NCDs的紅外光譜圖3A顯示，在3 421 cm-1處對(duì)應(yīng)為O-H和N-H的伸縮振動(dòng)峰，2 933 cm-1可能為亞甲基的C-H的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰，1 654 cm-1是強(qiáng)烈的C=O伸縮振動(dòng)和N-H的彎曲振動(dòng)吸收峰，1 045 cm-1為C-O的振動(dòng)伸縮，此外1 458 cm-1為C-H的彎曲振動(dòng)和C-N伸縮振動(dòng)吸收峰，說(shuō)明CDs已成功實(shí)現(xiàn)氮摻雜。NCDs表面富含氨基、羥基和羧基，這些親水基團(tuán)使得NCDs具有很好的水溶性。這與XPS推斷一致。圖3B是NCDs在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光發(fā)射光譜，可看出NCDs的發(fā)射峰并未隨激發(fā)波長(zhǎng)的變化而改變，說(shuō)明此NCDs不具有激發(fā)依賴性。

圖3 (A)NCDs的FTIR光譜圖，(B)不同激發(fā)下的NCDs的熒光光譜圖Fig.3 FTIR spectrum of the NCDs (A) and fluorescence spectra of the NCDs under different excitations(B)

2.2 測(cè)定CAMP和EMES的NCDs熒光探針的構(gòu)建

圖4A是NCDs在365 nm處激發(fā)時(shí)不同體系的熒光光譜。體系中藥物CAMP和EMES本身無(wú)熒光，無(wú)背景影響，但二者都會(huì)不同程度的對(duì)NCDs的熒光強(qiáng)度產(chǎn)生猝滅現(xiàn)象(圖4A中曲線c、曲線b)?？赡苁撬幬锓肿优cNCDs表面的-COOH、-OH、-NH等基團(tuán)之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移所致。通過(guò)紫外吸收光譜圖4B、4C分析，發(fā)現(xiàn)NCDs在218 nm處有強(qiáng)吸收，而278 nm處有中等強(qiáng)度的吸收帶，推斷是芳香碳核心C=C鍵的π-π*躍遷，說(shuō)明NCDs具有碳碳共軛結(jié)構(gòu)。而藥物EMES在紫外區(qū)僅有弱的吸收(圖4B曲線b)，CAMP在210 nm和286 nm處有兩個(gè)吸收峰(圖4C曲線b)，當(dāng)藥物EMES和CAMP加入體系作用后，發(fā)現(xiàn)NCDs的吸收峰位置并沒(méi)有發(fā)生改變，而只是218 nm和278 nm處的吸光度有所增加(圖4B曲線c、圖4C曲線c)，恰為藥物分子和NCDs二者的吸光強(qiáng)度之和，由此說(shuō)明藥物分子EMES和CAMP影響了NCDs的激發(fā)態(tài)，產(chǎn)生了動(dòng)態(tài)猝滅作用[16]。再依據(jù)Stern-Volmer方程[17]：F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]，式中KSV為猝滅常數(shù)，Kq是由擴(kuò)散過(guò)程控制的雙分子猝滅速率常數(shù)，[Q]是猝滅劑的濃度，τ0為熒光分子平均壽命。通過(guò)改變溫度，繪制了EMES和CAMP猝滅NCDs的F0/F～[Q]線性曲線，發(fā)現(xiàn)KSV隨溫度升高逐漸增大，推斷藥物分子EMES和CAMP對(duì)NCDs的猝滅機(jī)理是動(dòng)態(tài)猝滅。以此構(gòu)建測(cè)定CAMP和EMES的NCDs熒光探針是可行的。

圖4 體系的熒光光譜(A)和紫外光譜(B，C)Fig.4 Fluorescence spectra(A) and UV Spectra(B,C) of the system

2.3 測(cè)定條件的優(yōu)化

2.3.1 pH的影響不同pH值的緩沖溶液對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響如圖5。結(jié)果表明，藥物對(duì)體系NCDs的猝滅能力在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿性條件下較差，在弱酸性pH=5.80～6.40范圍內(nèi)熒光猝滅程度較強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)探討了pH=6.00的檸檬酸-Na2HPO4、KH2PO4-NaOH、NaAc-HAc、NaH2PO4-Na2HPO4等緩沖溶液對(duì)體系的熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果藥物EMES和CAMP均在pH=6.00的KH2PO4-NaOH緩沖溶液體系中對(duì)NCDs有強(qiáng)的熒光猝滅作用。但測(cè)定EMES時(shí)僅需此緩沖溶液0.50 mL，測(cè)定CAMP時(shí)則需緩沖溶液1.00 mL。

2.3.2 NCDs的濃度實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著NCDs濃度的增加，體系的熒光猝滅強(qiáng)度不斷增大，但當(dāng)NCDs濃度太大時(shí)，體系熒光猝滅強(qiáng)度的增大趨勢(shì)反而減緩，這可能是NCDs自猝滅的原因?？紤]到對(duì)體系靈敏度的影響，實(shí)驗(yàn)選擇用稀釋104倍的NCDs溶液1.50 mL。

2.3.3 表面活性劑對(duì)體系的影響為確定表面活性劑對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，實(shí)驗(yàn)考察了溴代十六烷基吡啶、曲拉通X-100、十二烷基苯磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉、乳化劑OP-10、十六烷基三甲基溴化銨等表面活性劑對(duì)實(shí)驗(yàn)體系的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述幾種表面活性劑都對(duì)實(shí)驗(yàn)體系均無(wú)增敏作用，因此實(shí)驗(yàn)確定不添加任何表面活性劑。

2.3.4 溫度、反應(yīng)時(shí)間及穩(wěn)定性在實(shí)驗(yàn)最佳條件下，30 min內(nèi)每隔5 min測(cè)定一次，之后每隔1 h測(cè)定一次，發(fā)現(xiàn)藥物EMES和CAMP對(duì)NCDs的熒光猝滅作用迅速，加入時(shí)刻瞬間猝滅且至少可以穩(wěn)定4 h。但發(fā)現(xiàn)體系的熒光猝滅強(qiáng)度受溫度的影響，隨溫度的升高反而下降。因此實(shí)驗(yàn)選擇在室溫下體系反應(yīng)穩(wěn)定10 min后進(jìn)行測(cè)定。

2.3.5 共存物質(zhì)的影響在室溫下，按照實(shí)驗(yàn)最佳條件，分別研究了濃度為2.1×10-4mol/L的EMES標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為6.0×10-4mol/L的CAMP標(biāo)準(zhǔn)溶液，體系熒光強(qiáng)度在相對(duì)誤差≤±5%范圍內(nèi)時(shí)，藥物輔料對(duì)體系的熒光強(qiáng)度的干擾。結(jié)果表明，500倍的葡萄糖、糊精、淀粉、乳糖、果糖、蔗糖等均不干擾。

2.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線按照實(shí)驗(yàn)方法，當(dāng)EMES標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.01～1.7 μg/mL范圍內(nèi)，CAMP標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.01～1.1 μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，分別與體系ΔF呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。藥物EMES的回歸方程為：ΔF1=249.65c+13.288，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9989；CAMP的回歸方程為：ΔF2=288.01c+14.137，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9972。同時(shí)對(duì)EMES和CAMP的測(cè)定體系的空白溶液平行測(cè)定了11次，根據(jù)IUPAC規(guī)定，用3S0/S計(jì)算實(shí)驗(yàn)方法的檢出限分別為8.0 ng/mL和5.0 ng/mL。

表1為不同檢測(cè)EMES和CAMP的方法比較，本法對(duì)兩種藥物的檢測(cè)的線性范圍較其他方法較窄，但此方法是對(duì)低濃度范圍內(nèi)的藥物進(jìn)行分析測(cè)定，檢出限也較低，具有一定的靈敏度。

2.4 樣品測(cè)定

隨機(jī)抽取EMES片1、片2和CAMP片各10片，分別研磨均勻后，各準(zhǔn)確稱取相當(dāng)于一片的量，用40 mL無(wú)水乙醇溶解并超聲5 min后，于100 mL的容量瓶中用超純水定容，然后靜置10 min后，過(guò)濾，按照所確定好的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。EMES片1的回收率為96.67%～102.2%，EMES片2的回收率為97.78%～103.3%，CAMP片的回收率為94.74%～101.7%。

表2 EMES和CAMP的測(cè)定及其回收率(n=5)

3 結(jié)論

以D -麥芽糖為碳源、L-色氨酸為氮源，采用一步水熱法合成了高熒光效率的NCDs。合成的NCDs具有尺寸小、分散均勻以及良好的水溶性等特性。在KH2PO4-NaOH緩沖介質(zhì)(pH=6.00)中，基于NCDs的高熒光性能，構(gòu)建了測(cè)定卡馬西平和琥乙紅霉素的熒光分析新方法，為碳點(diǎn)的發(fā)展和藥物的測(cè)定都提供了一定的信息。