張 潤， 司士輝*， 陳金華， 扶 梅， 馮浪霞

(1.中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南長沙 410083；2.化學(xué)生物傳感與計量學(xué)國家重點實驗室(湖南大學(xué))，湖南長沙 410082)

石英晶體微天平(Quartz Crystal Microbalance，QCM)是一種以AT切型剪切振動的壓電石英晶振作為傳感元件的檢測技術(shù)，該技術(shù)可直接精確測量納克級甚至皮克級物質(zhì)的質(zhì)量[1]。QCM具有價格便宜，生物傳感無需標(biāo)記、可在線實時監(jiān)測生化反應(yīng)等優(yōu)點[2]，被廣泛地應(yīng)用于疾病診斷、藥物檢測、環(huán)境檢測等多個領(lǐng)域的研究[3]。

目前QCM傳感技術(shù)通常以晶體表面質(zhì)量增加使頻率信號下降的方式來進(jìn)行檢測，為獲得晶體表面結(jié)合的傳感信號，需要在結(jié)合前測定一個頻率，反復(fù)洗滌，結(jié)合后再測定頻率，從而得到頻率變化，過程復(fù)雜繁瑣且耗時。Klenerman等[4]通過壓電體電噪聲監(jiān)測了抗原抗體的鍵裂過程，得出了不同分子間相互作用會隨著電壓幅值升高依次斷裂的結(jié)論。Cooper等[5]提出鍵裂掃描(Rupture Event Scanning，REVS)的概念，檢測了單純皰疹病毒與抗體的相互作用，得到鍵裂力為3 nN。Kurus等[6]通過鍵裂掃描法得到雙鏈DNA解繞的熱力學(xué)焓為90±15 kcal/mol。Kolosovsky等[7]通過鍵裂時施加的電壓確定雙螺旋DNA分子與金電極的脫附力在30～40 pN。本文基于DDS數(shù)字信號發(fā)生器設(shè)計開發(fā)了一種基于調(diào)幅調(diào)頻壓電石英晶體的頻率檢測系統(tǒng)。與文獻(xiàn)中采用電噪聲信號的方式不同，采用了差頻即頻率信號的方法得到鍵裂分離特性，實時監(jiān)測諧振調(diào)幅后的信號變化，通過頻率信號和激勵電壓得到晶體表面的負(fù)載質(zhì)量和鍵裂力信息。同時，將檢測系統(tǒng)設(shè)計制作成了分析儀器，通過數(shù)控技術(shù)調(diào)節(jié)激勵電壓和參考頻率，實現(xiàn)壓電石英晶體的諧振調(diào)幅，由諧振調(diào)幅引起分子鍵裂從而得到頻率響應(yīng)變化，以檢測晶體表面的負(fù)載質(zhì)量和分子鍵裂過程。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

AD9854(美國，Analog Devices公司)；PID控溫系統(tǒng)(日本，株式會社)；流動注射泵(南京潤澤流體控制設(shè)備有限公司)；超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

Fe3O4納米磁珠為分析純，購于上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 分子鍵裂型壓電石英晶體傳感儀的原理及構(gòu)造

1.2.1 儀器原理諧振調(diào)幅石英晶體傳感儀的工作原理是通過單片機控制數(shù)字信號發(fā)生器DDS 9854產(chǎn)生頻率可調(diào)的正弦波，以脈沖信號激勵9.98 MHz鍍金的壓電石英晶體。采用了石英晶體自主諧振電路法和被動激勵振蕩法兩種方式。以諧振電路法在低振幅即電壓2 V下測定晶體諧振頻率。當(dāng)諧振調(diào)幅時，停止自主諧振測定頻率，通過高速繼電器切換到被動調(diào)幅激勵電路中，通過數(shù)控放大器調(diào)節(jié)不同激勵電壓實現(xiàn)諧振調(diào)幅，增大石英晶振表面的剪切動量，從而實現(xiàn)分子鍵裂。當(dāng)諧振調(diào)幅結(jié)束后，再由繼電器切換至自主諧振電路中，檢測諧振調(diào)幅后的頻率變化，通過頻率變化判斷是否發(fā)生了分子鍵裂。原理圖如圖1所示。

圖1 儀器原理示意圖Fig.1 Principle diagram of instrument

1.2.2 DDS信號發(fā)生器采用直接數(shù)字頻率合成(Direct Digital Synthesis,DDS)技術(shù)以數(shù)控振蕩的方式產(chǎn)生頻率和相位可控的正弦波激勵壓電石英晶體，通過D/A轉(zhuǎn)換器將數(shù)字信號直接轉(zhuǎn)變?yōu)槟M信號，產(chǎn)生高精度、高分辨率、低噪聲的頻率信號。原理如圖2所示。

圖2 DDS信號發(fā)生器原理圖Fig.2 Principle of direct synthesizer(DDS) signal generator

采用美國ADI公司的AD 9854高度集成芯片，由Arduino控制產(chǎn)生頻率和相位都非常穩(wěn)定、幅度編程可調(diào)的正弦信號。AD 9854內(nèi)部集成了300 MHz的DDS核、速高性能雙路正交DAC、雙路14位相位寄存器、調(diào)幅模塊、兩個12位ADC等，AD 9854信號發(fā)生器的相位分辨率為0.022°，其頻率分辨率為1.07×10-6Hz。

1.2.3 差頻方法采用了差頻的方法獲得諧振頻率，以減小溫度、晶體老化等因素的影響，以DDS信號發(fā)生器產(chǎn)生可調(diào)的頻率信號作為基準(zhǔn)頻率源，并不斷調(diào)節(jié)使其與測量晶體頻率值在一定范圍內(nèi)。通過差頻電路得到測量晶體頻率值與基準(zhǔn)頻率源之間的差值即差頻信號，從而提高測量精度。

1.2.4 傳感儀構(gòu)造諧振調(diào)幅壓電石英晶體分子鍵裂生物傳感儀包括軟件部分和硬件部分，實物如圖3所示。軟件部分包括數(shù)據(jù)處理模塊、信號放大模塊、頻率存儲模塊。硬件部分包括調(diào)幅電路板、差頻電路板、7英寸液晶顯示觸摸屏、易拆卸檢測池(9.98 MHz晶振)、SD卡存儲器、PID控溫模塊、流動注射泵、USB電腦串口。儀器長40 cm，寬39 cm，高16 cm?？刂泼姘灏ㄓ|摸屏選項和面板按鈕，五個按鈕依次是程序開始鍵、中斷鍵、流動注射泵開關(guān)鍵、流向控制鍵、閥控鍵，旋鈕為流速調(diào)節(jié)鍵。本設(shè)計使用C++軟件對單片機Arduino、PID控溫系統(tǒng)、流動注射系統(tǒng)進(jìn)行編譯，打開儀器后，根據(jù)實驗要求在選擇界面選擇等幅(2 V)模式和調(diào)幅電壓模式，選擇調(diào)幅電壓，設(shè)置溫度及流速，采集數(shù)據(jù)并自動存儲。

圖3 儀器實物圖Fig.3 Picture of QCM instrument

1.2.5 儀器參數(shù)分子鍵裂型壓電石英晶體傳感系統(tǒng)參數(shù)列入表2。

表1 分子鍵裂型壓電石英晶體傳感系統(tǒng)參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器的穩(wěn)定性

參考頻率默認(rèn)為10.00 MHz，使用9.98 MHz的壓電石英晶振作為檢測晶體，開機進(jìn)行自主等幅(振蕩電壓2 V)諧振頻率檢測。待頻率波動不超過±1 Hz時，選擇5.00～12.00 V的電壓調(diào)幅，首先以3 min 的等幅模式開始，3 min后暫停頻率測定，自動調(diào)至5.00 V的激勵模式，調(diào)幅時間為30 s，摁中斷鍵后切換至諧振頻率測定，記錄數(shù)據(jù)3 min。同上以12.00 V的調(diào)幅模式激勵30 s，以3 min的等幅模式記錄傳感儀在氣相中調(diào)幅后的頻率變化值。

在氣相中，儀器在等幅模式的差頻響應(yīng)值見圖4(A)，頻率波動大致為一條直線。在檢測的50 min內(nèi)，頻率變化的相對偏差為0.981 Hz，波動不超過±1 Hz，頻率平均變化為0.08 Hz/min。在調(diào)幅模式下頻率響應(yīng)見圖4(B)，5.00 V和12.00 V電壓激勵30 s后，頻率迅速升高，在10 s內(nèi)迅速恢復(fù)穩(wěn)定。尖峰的出現(xiàn)主要是由于高振幅振蕩下切換至諧振電路時石英晶體表面的振蕩波未衰減完，故出現(xiàn)較大的頻率變化，但在短時間內(nèi)可恢復(fù)基頻。不同調(diào)幅電壓激勵后的頻率變化見圖4(C)，總的頻率變化為11 Hz，平均變化為0.65 Hz/V，說明在氣相環(huán)境中儀器在不同調(diào)幅電壓下頻率響應(yīng)稍有波動，但在一定范圍內(nèi)信號穩(wěn)定。

圖4 (A)等幅模式下氣相中的穩(wěn)定性；(B)5.00 V～12.00 V電壓調(diào)幅下氣相中的穩(wěn)定性；(C)不同調(diào)幅電壓氣相中的穩(wěn)定性Fig.4 (A) Instrument stability under gas phase conditions;(B) Stability in gas phase at 5.00V - 12.00 V voltage amplitude Modulation;(C) Vapor phase stability of different amplitude modulation voltages

2.2 鍵裂實驗

2.2.2 納米磁珠的鍵裂響應(yīng)通過諧振調(diào)幅激勵壓電石英晶體以其產(chǎn)生的頻率變化來區(qū)分不同強度的分子鍵，其機理如圖5所示。圖5(A)中QCM的表面發(fā)生反應(yīng)后，頻率變化是由不同強度的分子間作用共同產(chǎn)生的，無法區(qū)別且影響目標(biāo)物質(zhì)的檢測。當(dāng)施加低交變電壓時弱結(jié)合鍵斷裂如圖5B所示。當(dāng)施加高交變電壓時，發(fā)生部分或全部強結(jié)合鍵斷裂如圖5C所示，因此可通過不同調(diào)幅電壓測定不同鍵的強弱。

圖5 諧振調(diào)幅分子鍵裂方法原理Fig.5 Principle of resonant amplitude modulated molecular bond rupture method

在基本頻率下，設(shè)置不同的調(diào)幅電壓，對表面覆蓋了納米磁珠的QCM晶體進(jìn)行分子鍵裂實驗并記錄激勵后的頻率曲線。圖6(A)和6(B)為納米磁珠涂布干燥后以500 mL/min流速流動注射PBS下的頻率響應(yīng)。200～300 nm納米磁珠在5 V和12 V調(diào)幅30 s后的頻率測定見圖6(C)，圖6(D)為500～600 nm納米磁珠在8 V和12 V調(diào)幅30 s后的頻率響應(yīng)。圖6(E)和6(F)為不同粒徑納米磁珠在不同調(diào)幅電壓下的頻率響應(yīng)。

圖6 (A)200～300 nm納米磁珠調(diào)幅后流動注射下的頻率響應(yīng)；(B)500～600 nm納米磁珠調(diào)幅后流動注射下的頻率響應(yīng)；(C)200～300 nm納米磁珠在5～12 V調(diào)幅下的頻率響應(yīng)；(D)500～600 nm納米磁珠在8～12 V調(diào)幅下的頻率響應(yīng)；(E)200～300 nm納米磁珠在不同調(diào)幅電壓下的頻率響應(yīng)；(F)500～600 nm納米磁珠在不同調(diào)幅電壓下的頻率響應(yīng)Fig.6 (A) Frequency response of 200 - 300 nm nano-magnetic beads under flow injection;(B) Frequency response of 500 - 600 nm nano-magnetic beads under flow injection;(C) Frequency response of 200 - 300 nm nano-magnetic beads diagram at 5 - 12 V;(D) Frequency response of 500 - 600 nm nano-magnetic beads diagram at 8 - 12V;(E) Frequency response diagram of 200 - 300 nm nano-magnetic beads under different amplitude modulation voltages;(F) Frequency response diagram of 500 - 600 nm nano-magnetic beads under different amplitude modulation voltages

如圖6(A)和6(B)所示，兩種粒徑的納米磁珠在流動注射PBS的條件下頻率稍有波動但大致成一條直線，說明在磁珠流動注射條件下不脫落。如圖6(C)所示，在低電壓激勵后儀器頻率幾乎無變化，12 V激勵后頻率明顯升高，平均升高了92 Hz，振掉了80.96 ng的200～300 nm納米磁珠。如圖6(E)所示，在20 V電壓激勵后頻率上升為123 Hz，根據(jù)Sauerbrey方程，表面振掉108.24 ng(即5.5%)200～300 nm的結(jié)合磁珠。由圖6(D)可得500～600 nm納米磁珠在8V電壓激勵后儀器頻率上升97 Hz，12 V電壓激勵后頻率升高243 Hz，表面振掉213.84 ng 的500～600 nm納米磁珠。由圖6(F)可得在8 V電壓激勵后傳感儀頻率升高并隨電壓升高小幅增加。20 V后頻率變化為329 Hz，根據(jù)表面振掉289.52 ng 的500～600 nm納米磁珠。

圖7 粒子在晶體表面的運動模型Fig.7 The movement model of particleson crystal surface

表2 調(diào)幅諧振QCM傳感儀檢測不同粒徑納米磁珠的實驗結(jié)果

其中f0為晶體空載時諧振頻率和參考頻率的差值，即基本頻率。f1為滴加納米磁珠晾干沖洗后晶體的頻率差值。Δf為晶體負(fù)載納米磁珠后的頻率變化值。fup為鍵裂發(fā)生后的頻率上升值。F為計算得到的鍵裂力。根據(jù)鍵裂力公式，不同粒徑的納米磁珠，沉積的質(zhì)量相同，計算得到的鍵裂力相似，即不同粒徑的納米粒子檢測出的氨基與金原子鍵裂力一致。氨基與金原子的相互作用與硫金鍵相似，本儀器測出的鍵力值與文獻(xiàn)中原子力顯微鏡測得的Au-S鍵力值2±0.5 nN相近[8]。納米磁珠沉積于晶體表面得到的頻率值數(shù)據(jù)無規(guī)律主要是因為旋轉(zhuǎn)涂布后形成的結(jié)合層表面不均勻，因此存在一定的誤差。由表數(shù)據(jù)可得，納米磁珠未被全部甩脫，其主要原因是帶氨基修飾的納米磁珠具有與硫醇相似的性質(zhì)，當(dāng)磁珠滴在晶體表面，與金電極接觸，氨基脫氫，氮原子與金結(jié)合。當(dāng)大量氨基與金原子結(jié)合時，產(chǎn)生較大的結(jié)合力，調(diào)幅電壓激勵產(chǎn)生的振幅能量無法打開全部的結(jié)合鍵，因此僅是部分頻率升高。

3 結(jié)論

本文研制的諧振調(diào)幅壓電石英晶體傳感系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)晶體表面分子鍵裂的傳感，在短時間內(nèi)可獲得結(jié)合在金電極表面上物質(zhì)分子鍵裂前后的頻率信號，從而區(qū)分分子間相互作用的強弱，縮短檢測時間，簡化檢測過程，易于構(gòu)建多陣列傳感，可應(yīng)用于表面固定化親和性檢測技術(shù)領(lǐng)域。