張翼華， 張志凌

(武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

新型冠狀病毒于2019年12月首次發(fā)現(xiàn)，國際病毒分類委員會(ICTV)將其命名為SARS-CoV-2。該病毒感染人體后會導(dǎo)致致命急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)，以及心臟病、多器官功能障礙和突然死亡[1]。新冠病毒的組成主要包括結(jié)構(gòu)蛋白和遺傳物質(zhì)單鏈RNA和其他非結(jié)構(gòu)蛋白以及附屬蛋白[2]。結(jié)構(gòu)蛋白包括刺突(S)蛋白、包膜(E)蛋白、基質(zhì)(M)蛋白和核衣殼(N)蛋白四種[3]。目前的檢測方法主要有核酸檢測、抗原檢測和抗體檢測以及病毒粒子檢測四大類[4]。核酸檢測一般是對病毒遺傳物質(zhì)RNA的全基因組或基因片段進(jìn)行檢測。實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)特異性強，靈敏度高，是冠狀病毒檢測的常規(guī)方法[5-7]，也是新冠病毒檢測的金標(biāo)準(zhǔn)[8]。新冠病毒不斷變異，且該方法樣品前處理步驟繁瑣，增大樣品污染機會，導(dǎo)致產(chǎn)生假陰性和假陽性結(jié)果[9]。特異性抗體一般在患者感染病毒一周之后才能檢測出來[10]，且抗體并非僅在感染者體內(nèi)出現(xiàn)，治愈者和疫苗接種者體內(nèi)也會出現(xiàn)。抗體檢測不能單獨作為確診依據(jù)。

抗原檢測是對病毒特異性蛋白，包括S蛋白和N蛋白的檢測。S蛋白檢測常會涉及病毒粒子的直接暴露[11]，具有一定危險性。N蛋白是新冠病毒最豐富的結(jié)構(gòu)蛋白，參與病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，并在宿主細(xì)胞內(nèi)幫助病毒顆粒的產(chǎn)生和釋放[12,13]。N蛋白具有免疫原性[14]，在感染過程中大量表達(dá)，抗原性好[15]。目前已有多種N蛋白的檢測方法報道。N蛋白適配體[16]和單域抗體[17]都被用于N蛋白的檢測。微流控技術(shù)[18]和CRASPR/Cas12a技術(shù)[19]也被用于N蛋白檢測中的信號放大。本文合成了一種比色熒光納米球，結(jié)合側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)實現(xiàn)了N蛋白比色定性檢測及熒光定量檢測。單個納米球含有多個金納米粒子和量子點，可實現(xiàn)檢測信號放大。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

紫外光譜儀(UV-2550,Shimadzu)；熒光光譜儀(Fluorolog -3,Horiba Jobin Yvon)；粒度儀(ZS -ZEN 3600,Malvern)；熒光倒置顯微鏡(TE2000-U,Nikon)；凝膠成像儀(EN61010,Alpha Innotech)；透射電子顯微鏡(JEM-2100F，Hitachi)；分析天平(AT20,Mettler-Toledo)。

新冠病毒重組N蛋白(2.2 mg/mL)、小鼠抗新冠病毒IgG -A(6.2 mg/mL)和小鼠抗新冠病毒IgG -H(6.0 mg/mL)均購自杭州索萊爾博奧生物技術(shù)有限公司。羊抗鼠IgG(10 mg/mL)購自北京索萊寶科技有限公司。525 nm綠色熒光球(5 mg/mL)購自武漢珈源量子點有限公司。牛血清白蛋白(BSA)購自德國Biofroxx公司。胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、聚乙烯亞胺(PEI)、Tween 20、硅酸四乙酯(TEOS)和3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)購自Sigma-Aldrich公司。N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)購自Thermo公司。實驗用水為超純水。

1.2 比色熒光納米球的制備

金納米粒子由Frens法[20]制備。取100 μL熒光納米球(FNs)，加入100 μL的EDC(10 mmol/L)、100 μL NHS(10 mmol/L)和100 μL PEI(40 mg/mL)。搖床反應(yīng)12 h。將產(chǎn)物用0.5 mol/L NaCl溶液和超純水各洗滌4次(13 000 r/min、15 min)，分散于超純水得到FNs@PEI。將金納米粒子緩慢分次滴加至FNs@PEI中，滴加完用超純水洗滌2次，再分散于200 μL超純水，得FNs@PEI@AuNPs。按文獻(xiàn)方法[21]硅烷化,得FNs@PEI@AuNPs@TEOS@APTES。將該材料用DMF洗滌3次后，分散到3 mL DMF中，加入1 mL的SA的DMF溶液(0.02 g/mL)，搖床室溫反應(yīng)3 h，用乙醇和超純水各洗滌3次，分散于200 μL超純水中，即得羧基化的比色熒光納米球(FNs@PEI@AuNPs@TEOS@APTES@SA)。

1.3 比色熒光納米球抗體偶聯(lián)

將比色熒光納米球用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=6.8)離心洗滌2次后，分散于200 μL PBS中，依次加入100 μL EDC(10 mmol/L)和100 μL NHS(10 mmol/L)溶液，室溫?fù)u床(150 r/min)活化20 min。離心(13 000 r/min、15 min)去掉上清，并用PBS(0.01 mol/L，pH=7.2)離心洗滌1次。將沉淀用400 μL PBS重懸，加入10 μL小鼠抗新冠病毒IgG -A，室溫?fù)u床(150 r/min)反應(yīng)12 h。離心(13 000 r/min、15 min)去掉上清，用200 μL PBS離心洗滌3次。產(chǎn)物用200 μL PBS重懸，即得比色熒光免疫納米球(FNs@PEI@AuNPs@TEOS@APTES@SA@Antibody)。用一定濃度的BSA封閉免疫納米球后，存于4 ℃冰箱，待用。

1.4 側(cè)向?qū)游龇z測新冠病毒重組N蛋白

將10 μL 0.32 mg/mL比色熒光免疫納米球、10 μL重組N蛋白和80 μL(20 mmol/L Na3PO4，5%BSA，0.25%Tween 20，10%蔗糖)加至96孔板混合后，滴加到試紙條樣品墊上，層析25 min后，讀取信號。

2 結(jié)果與討論

2.1 新冠病毒N蛋白側(cè)向?qū)游鰴z測原理

如圖1所示，層析試紙條T線為小鼠抗新冠病毒IgG -H。IgG -A、IgG -H可通過親和作用識別N蛋白的不同位點。C線羊抗鼠IgG能結(jié)合未與N蛋白結(jié)合的比色熒光免疫納米球。層析之后，若存在目標(biāo)物，T/C線處會同時出現(xiàn)金納米粒子的比色信號和量子點的熒光信號，可分別用于定性和定量檢測。

圖1 新冠病毒N蛋白側(cè)向?qū)游鰴z測原理Fig.1 Design of lateral chromatography for the detection of novel coronavirus recombinant N protein

2.2 比色熒光免疫納米球的表征

如圖2所示，熒光納米球表面偶聯(lián)帶正電荷的PEI后，通過靜電作用吸附帶負(fù)電荷金納米粒子，加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30)反應(yīng)過夜，超純水洗滌后，加入氨水和TEOS水解，再加入APTES形成Si-O-Si鍵，使納米球表面帶-NH2。再加入丁二酸酐與氨基反應(yīng)實現(xiàn)納米球表面羧基化。最后加入EDC和NHS使羧基與抗體的氨基偶聯(lián)制備得到比色熒光免疫納米球。

圖2 比色熒光免疫納米球的制備過程Fig.2 Diagram of preparation process of colorimetric fluorescent immunonanospheres

采用紫外-可見吸收光譜、熒光光譜和動態(tài)光散射對納米球進(jìn)行監(jiān)測。如圖3A所示，F(xiàn)Ns無明顯吸收峰，而組裝上金納米粒子后，在530 nm處出現(xiàn)吸收峰，相較于AuNPs(520 nm)有一定紅移。圖3B表面組裝過程中FNs的熒光峰位置沒有變化，強度僅有小幅降低。如圖3C和3D所示,FNs表面偶聯(lián)上PEI后，水合粒徑由109 nm增大至121 nm，表面電勢也由-30 mV變?yōu)?42 mV，利用靜電作用可吸附納米金。FNs@PEI@AuNPs的表面電勢負(fù)移為-16 mV，水合粒徑增大至179 nm。電鏡結(jié)果(圖3E)顯示每個熒光球可偶聯(lián)約20～50顆納米金。TEOS硅烷化后，納米球的水合粒徑增大至188 nm，表面電勢降低至-42 mV。進(jìn)一步APTES硅烷化后，因APTES氨基帶正電荷,電勢正移至+39 mV，水合粒徑為187 nm幾乎不變。納米球與丁二酸酐(SA)反應(yīng)后，納米球(FNs@PEI@AuNPs@TEOS@APTES@SA)表面的羧基化使表面電勢負(fù)移至-24 mV，水合粒徑進(jìn)一步增大至230 nm，其形貌如圖3F所示。最后通過氨基和羧基偶聯(lián)抗體得到FNs@PEI@AuNPs@TEOS@APTES@SA@Antibody，水合粒徑和表面電勢仍保持在230 nm和-24 mV。

圖3 比色熒光免疫納米球合成過程中的紫外-可見吸收光譜(A)、熒光光譜(B)、水合粒徑(C)和表面zeta電勢(D)。FNs@PEI@AuNPs(E)和FNs@PEI@AuNPs@TEOS@APTES@SA(F)的電鏡圖。Fig.3 UV-Vis absorption spectra(A),fluorescence spectra(B),hydrated particle sizes(C) and zeta potentials(D) of nanospheres during the synthesis of colorimetric fluorescence immunonanospheres.Transmission electron microscopy images of FNs@PEI@AuNPs(E) and FNs@PEI@AuNPs@TEOS@APTES@SA(F).(C)and(D):a.FNs;b.FNs@PEI;c.FNs@PEI@AuNPs;d.FNs@PEI@AuNPs@TEOS;e.FNs@PEI@AuNPs@TEOS@APTES;f.FNs@PEI@AuNPs@TEOS@APTES@SA;g.FNs@PEI@AuNPs@TEOS@APTES@SA@Antibody.

2.3 比色熒光納米球抗體偶聯(lián)的表征

如圖4所示，與Cy3標(biāo)記的羊抗鼠IgG孵育后，在綠色通道可見量子點的熒光信號(圖4A)，且紅色通道有明顯的Cy3熒光(圖4B)。表明兩者有很好的熒光共定位。用Image J計算的曼德斯共定位系數(shù)為0.805，共定位效果良好，說明IgG -A抗體成功偶聯(lián)到比色熒光球上。而當(dāng)納米球表面沒有偶聯(lián)IgG -A抗體時，僅有量子點綠色熒光(圖4D)，而沒有紅色熒光(圖4E、4F)。

圖4 與Cy3標(biāo)記羊抗鼠IgG孵育的比色熒光納米球熒光成像圖Fig.4 Fluorescence images of nanospheres incubated with Cy3 labelled goat antimouse IgG

2.4 實驗條件的優(yōu)化

由圖5A可見，隨著封閉劑濃度增加，陽性信號隨之減弱，陰性信號先增加后減小。綜合考慮選擇10%BSA作為封閉劑。比色熒光免疫納米球的濃度也對層析檢測有影響。結(jié)果表明，納米球濃度為0.32 mg/mL時，信背比最大，且陽性信號強(圖5B)，因此確定納米球的最佳濃度為0.32 mg/mL。如圖5C所示，在優(yōu)化的封閉劑和納米球濃度下，25 min時陽性信號最大且信背比較大。

圖5 側(cè)向?qū)游鰲l件優(yōu)化。(A)封閉劑BSA濃度，(B)納米球濃度，(C)層析時間。Fig.5 Optimization of lateral chromatographic conditions.(A) Concentration of BSA,(B) Concentration of nanospheres,(C) Testing time.

2.5 方法的分析性能

2.5.1 線性范圍和檢測限在0.01 mol/L的PBS(pH=7.2)中，考察了方法的線性范圍和檢測限。由圖6A可見，隨著N蛋白濃度降低，T線的熒光強度依次降低。同樣T線比色信號(圖6B)也不斷降低。N蛋白濃度在8.9～1.8×102nmol/L范圍內(nèi)，均出現(xiàn)量子點熒光信號和金納米粒子比色信號，并且熒光信號強度的對數(shù)和N蛋白濃度的對數(shù)呈線性關(guān)系(圖6C)，檢測限為2.1 nmol/L。

圖6 不同N蛋白濃度時的試紙條熒光圖(A)、比色圖(B)和熒光檢測線性關(guān)系(C)Fig.6 Fluorescence images(A) and colorimetric images (B) of testing strips with different concentrations of N protein;Logarithmic relationship between fluorescence intensity and concentration of N protein(C)

2.5.2 特異性禽流感病毒H5N1(1.0 mg/mL)、H7N9(3.1 mg/mL)和日本腦炎病毒(JEV,3.5 mg/mL)的信號遠(yuǎn)低于新冠病毒N蛋白(0.055 mg/mL)的信號。結(jié)果說明方法具有很好的特異性。如圖7所示。

2.5.3 重現(xiàn)性分析利用同一批次和不同批次的比色熒光免疫納米球，考察了方法的組內(nèi)和組間重現(xiàn)性。組內(nèi)重現(xiàn)性測定選擇三種線性范圍內(nèi)的N蛋白濃度，平行三次測量，計算平均熒光強度、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)和變異系數(shù)(CV)。組間重現(xiàn)性采用三個批次的比色熒光免疫納米球測定。由表1可見，組內(nèi)變異系數(shù)為4.7%(由三次組內(nèi)變異系數(shù)平均值得到)，組間變異系數(shù)為7.5%(由組間變異系數(shù)平均值得到)，說明方法具有較好重現(xiàn)性。

表1 方法重現(xiàn)性分析

2.5.4 血清體系檢測由圖8A和8B所示，T線熒光信號隨著血清中N蛋白濃度減少而降低，金納米粒子顏色也不斷變淺。由圖8C圖可見，在8.9～1.8×102nmol/L范圍內(nèi)，N蛋白濃度與熒光強度呈雙對數(shù)關(guān)系，檢測限為3.1 nmol/L。以上結(jié)果說明，方法具有較好的抗干擾能力，具有在復(fù)雜體系中應(yīng)用的潛力。

圖8 胎牛血清中不同N蛋白濃度時的試紙條熒光圖(A)、比色圖(B)和熒光檢測線性關(guān)系(C)Fig.8 Fluorescence images(A) and colorimetric images (B) of testing strips with different concentrations of N protein infetal bovine serum;Logarithmic relationship between fluorescence intensity and concentration of N protein in fetal bovine serum(C)

3 結(jié)論

建立了一種基于比色熒光納米球的新冠病毒N蛋白免疫層析檢測新方法。該方法具有很好的重現(xiàn)性和特異性，抗干擾能力強，在8.9～1.8×102nmol/L范圍具有良好線性關(guān)系，檢測限為2.1 nmol/L。該方法有望用于新冠病毒的快速檢測。