羅紅梅 楊中州 單叢佳

1.廣東醫(yī)科大學(xué)生理科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東東莞 523808；2.南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，江蘇南京 210028

磷酸肌醇依賴(lài)性蛋白激酶-1（phosphoinositidedependent protein kinase-1，PDK1）為63 kD 的蛋白分子，是體內(nèi)重要的激酶，調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路蛋白磷酸化， 參與諸多細(xì)胞因子信號(hào)由細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。PDK1結(jié)構(gòu)包括C-端的PH 結(jié)構(gòu)和N-端的催化結(jié)構(gòu)，其第241 位的蛋白分子可自身磷酸化，其他位點(diǎn)例如第9、373/376 位點(diǎn)的蛋白分子也可以被磷酸化，磷酸化后的PDK1被激活[1-2]。PDK1被證明參與心臟發(fā)育和結(jié)構(gòu)功能維持的調(diào)控， 生殖細(xì)胞水平敲除PDK1導(dǎo)致由神經(jīng)脊細(xì)胞來(lái)源的組織發(fā)育缺陷， 例如沒(méi)有前腦、鰓弓和心臟等的發(fā)育[3]。 用不同的cre 條件性地敲除小鼠心臟中的PDK1， 心臟發(fā)育表現(xiàn)出不同的時(shí)空差異， 也就是說(shuō)在不同的時(shí)間和不同的心臟部位敲除PDK1，小鼠心臟發(fā)育出現(xiàn)不同的表型。 例如用Tie2-cre 敲除內(nèi)皮細(xì)胞中的PDK1，小鼠在胚胎期第11.5 天死亡，小鼠心臟房室軸（artrioventricular canal，AVC）明顯發(fā)育不良[4]。 用Mef2c-cre 敲除心臟中第二心場(chǎng)（second heart field，SHF） 的PDK1， 小鼠在胚胎期第14.5 天死亡，心臟表現(xiàn)為右心室很小，室間隔缺損和流出道不分割[5-6]。 同源盒轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5是調(diào)控心臟發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，研究表明Nkx2.5可通過(guò)調(diào)控MLC2V、N-myc、Tgfb-2、Fulin 等下游基因或者協(xié)同其他心臟轉(zhuǎn)錄因子GATA4，TBX1等調(diào)控心臟的生長(zhǎng)發(fā)育和功能維持[7-8]，PDK1是否受Nkx2.5的調(diào)控以及該調(diào)控在心臟發(fā)育中是否起作用， 目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。 本研究用Nkx2.5-cre 條件性敲除小鼠心臟中的PDK1，探索研究Nkx2.5對(duì)PDK1調(diào)控的時(shí)空差異，以及與先天性心臟病的關(guān)系。

小鼠心臟（outflow tract，OFT）、AVC 以及瓣膜的形成大致經(jīng)歷三個(gè)階段，心膠組織的形成，心內(nèi)膜墊的形成和瓣膜成熟[7]，小鼠心膠組織從胚胎第9.5 天開(kāi)始生長(zhǎng)發(fā)育，由心管（也稱(chēng)第一心腸，first heart field，F(xiàn)HF）內(nèi)、外兩層之間的心內(nèi)膜細(xì)胞分泌的含有豐富糖蛋白的物質(zhì)形成[9-10]。 接著心膠組織內(nèi)遷入大量的細(xì)胞形成心內(nèi)膜墊，遷入的細(xì)胞有第二心場(chǎng)來(lái)源的心內(nèi)膜細(xì)胞（endocardium cell，ECC）、內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell，EC）和神經(jīng)脊細(xì)胞（neural crest cell, NCC）來(lái)源的上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）細(xì)胞[11]。最后，心內(nèi)膜墊進(jìn)一步地重塑發(fā)育形成AVC、OFT， 在AVC 中形成二尖瓣和三尖瓣，在OFT 中形成半月瓣，這些組織的形成保證了血液在心臟中的正確流動(dòng)方向。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器和試劑 體視學(xué)顯微鏡（Nikon），組織切片機(jī)（Laica），石蠟包埋機(jī)（Laica），PCR 儀（Eppendorf），高速離心機(jī)（Eppendorf），無(wú)水乙醇（上?；瘜W(xué)試劑廠），95%酒精（上海化學(xué)試劑廠）。

1.1.2 小鼠基因型背景 PDK1flox 小鼠，由英國(guó)Dundee大學(xué)的Alessi 實(shí)驗(yàn)室提供，Nkx2.5-cre 小鼠， 由美國(guó)Moses 實(shí)驗(yàn)室提供。

PDK1flox 小鼠在PDK1第2 個(gè)外顯子后面和第5個(gè)外顯子前面分別插入了一個(gè)flox 片段，野生型PDK1+/+和雜合型PDK1+/F小鼠，PDK1活性較高， 而PDK1F/F型小鼠，PDK1活性明顯降低，只有野生型的10%，全敲型PDK1-/-小鼠，PDK1活性幾乎為零[3]。 PDK1F/F小 鼠PDK1活性雖然較低， 但仍然能正常生長(zhǎng)發(fā)育和存活（圖1A）。 Nkx2.5-cre 小鼠在Nkx2.5的一個(gè)等位基因（Allele）的第二個(gè)外顯子中敲入了一個(gè)cre 基因，因此該等位基因結(jié)構(gòu)被破壞[12]（圖1B），此基因型小鼠也能正常生長(zhǎng)發(fā)育和長(zhǎng)期健康存活。

圖1 PDK1、Nkx2.5-cre 小鼠基因背景示意圖

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠配繁過(guò)程 將1 只PDK1flox 雌性小鼠和1只Nkx2.5-cre 雄性小鼠進(jìn)行交配，獲得第一代子鼠，在小鼠出生后第7 天，剪取一段尾巴進(jìn)行基因型鑒定。 等第一代子鼠長(zhǎng)大性成熟后，用第一代PDK1F/+雌性子鼠與PDK1F/+，Nkx2.5-cre 雄性子鼠進(jìn)行交配，獲得第二代子鼠，對(duì)第二代子鼠進(jìn)行基因型鑒定和心臟表型分析。用PCR 對(duì)PDK1flox 和Nkx2.5-cre 的基因型進(jìn)行鑒定，PDK1正向引物：5′-TGTGCTTGGTGGATATTGAT-3′，反向引物：3′-AAGGAGGAGAGGAGGAATGT-5′。Nkx2.5-cre用cre 通用引物進(jìn)行鑒定。

1.2.2 第二代子鼠心臟表型分析過(guò)程 在小鼠出生第1天，用斷頭的方式處死小鼠，并在顯微鏡下打開(kāi)胸腔取出心臟， 取心臟操作在4℃的PBS 溶液中進(jìn)行，心臟取出后將血清洗干凈，在1.7 倍的顯微鏡下觀察心臟的形態(tài)并拍照。同時(shí)剪取一段小鼠尾巴放入組織消化液中進(jìn)行消化，提取消化液中的總DNA，用PCR 對(duì)小鼠進(jìn)行基因型鑒定。 將拍照后的心臟放入4℃的4%多聚甲醛中固定24 h，第2 天用75%，85%，95%，100%的酒精進(jìn)行梯度脫水，每個(gè)濃度各1 h，然后用酒精二甲苯混合液（1∶1）浸透30 min 2 次，最后進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE 染色，染色后在2.5 倍顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察指標(biāo)包括兩個(gè)方面，①各代小鼠的基因型和例數(shù)，②第二代子鼠的心臟表型，心臟表型重點(diǎn)觀察了心臟OFT、AVC 和四個(gè)腔室的結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠基因型、各基因型小鼠數(shù)量及表型

第一代子鼠分娩1 窩，共獲得7 只小鼠，基因型有PDK1F/+；PDK1F/+，Nkx2.5-cre 兩種。 第二代子鼠分娩4窩，共獲得了35 只小鼠，基因型有PDK1F/F；PDK1F/F，Nkx2.5-cre；PDK1F/+；PDK1F/+，Nkx2.5-cre；PDK1+/+；PDK1+/+，Nkx2.5-cre 六種，小鼠存活到出生，具體基因型和只數(shù)情況見(jiàn)表1， 心臟表型分析顯示3 只PDK1F/F，Nkx2.5-cre 小鼠均觀察到肺動(dòng)脈狹窄。 另外，1 只PDK1F/+，Nkx2.5-cre 小鼠觀察到心臟無(wú)AVC 軸發(fā)育，OFT 只有一條永存動(dòng)脈干，1 只PDK1+/+小鼠也觀察到心臟無(wú)AVC 軸發(fā)育，且只有一個(gè)心室。

表1 各代小鼠的基因型和獲取例數(shù)情況表（只）

2.2 小鼠心臟表型

2.2.1 PDK1全敲小鼠心臟表型 PDK1F/F對(duì)照鼠心臟表型正常，OFT 和AVC 軸發(fā)育正常，主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈管徑大小基本相同，有四個(gè)完整發(fā)育的腔室，兩心房和兩心室（圖2A～C）。PDK1全敲小鼠PDK1F/F，Nkx2.5-cre，心臟表現(xiàn)為明顯的肺動(dòng)脈狹窄，主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈管徑比大約為3∶1（圖2D～F、G～I(xiàn)），肺動(dòng)脈瓣沒(méi)有分割（圖2I）， 以及出現(xiàn)肺動(dòng)脈瘤 （圖2J～M）。 雖然PDK1F/F，Nkx2.5-cre 小鼠的OFT 發(fā)育明顯異常， 但是四個(gè)腔室卻發(fā)育正常。

圖2 Nkx2.5-cre 敲除小鼠心臟PDK1 的心臟表型

2.2.2 PDK1敲除協(xié)同Nkx2.5損傷小鼠心臟表型 PDK1F/F對(duì)照鼠心臟發(fā)育正常（圖3A、B)。 PDK1F/+，Nkx2.5-cre 小鼠中觀察到心臟發(fā)育成兩個(gè)心房和兩個(gè)心室四個(gè)腔室，但沒(méi)有AVC 軸發(fā)育將其分割開(kāi)，OFT 是一條永存動(dòng)脈干，沒(méi)有分離成主動(dòng)脈干和肺動(dòng)脈干（圖3C、D)。 在PDK1+/+小鼠中，觀察到心臟發(fā)育成兩個(gè)心房和一個(gè)心室，也沒(méi)有AVC 軸發(fā)育將三個(gè)腔室分隔開(kāi)（圖3E、F）。

圖3 PDK1 敲除協(xié)同Nkx2.5 損傷的心臟表型

3 討論

PDK1在心臟組織中高度表達(dá)， 對(duì)心臟的胚胎發(fā)育和出生后心臟結(jié)構(gòu)功能的維持起重要作用，如在小鼠胚胎期將其敲除，PDK1-/-基因型小鼠心臟發(fā)育異常，而PDK1+/-、PDK1+/+基因型小鼠心臟發(fā)育正常，說(shuō)明只有將兩個(gè)等位基因全部敲除或者破壞，心臟表型才出現(xiàn)異常。本實(shí)驗(yàn)用PDK1flox 小鼠與Nkx2.5-cre 小鼠配繁， 在第二代子代中獲得PDK1F/+；PDK1F/+，Nkx2.5-cre；PDK1+/+；PDK1+/+，Nkx2.5-cre；PDK1F/F；PDK1F/F，Nkx2.5-cre 六種基因型小鼠。 其中PDK1F/F，Nkx2.5-cre 小鼠心臟的PDK1全部被敲除， 實(shí)驗(yàn)中獲得的三只PDK1F/F，Nkx2.5-cre 小鼠均觀察到肺動(dòng)脈狹窄的表型， 表現(xiàn)為肺動(dòng)脈管腔狹小，肺動(dòng)脈瓣不分割，還出現(xiàn)肺動(dòng)脈瘤。PDK1是一個(gè)關(guān)鍵性的激酶， 調(diào)控PI3K-PDK1-AKT，GSK3-CATENIN，S6K-S6 等信號(hào)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[13-14]，PDK1敲除導(dǎo)致這些通路中的某些因子蛋白表達(dá)水平和磷酸化水平發(fā)生變化，從而影響細(xì)胞的增殖、分化、生長(zhǎng)和遷移，導(dǎo)致心臟的胚胎發(fā)育和出生后生長(zhǎng)受到影響。Feng 等[4]證明PDK1敲除可使AKT308、GSK3β9的磷酸化水平明顯降低， 這是導(dǎo)致細(xì)胞EMT 能力降低的主要因素，是導(dǎo)致心臟AVC、OFT 發(fā)育受阻的主要原因。 PDK1敲除也明顯降低S6K389，S6235/236 的磷酸化水平，這是導(dǎo)致心臟細(xì)胞體積變小的原因[15-16]，因此在出生后小鼠中敲除PDK1，小鼠心臟體積變小，心臟壁變薄[17]。 用Nkx2.5-cre 敲除PDK1，小鼠心臟主要表現(xiàn)為OFT 和AVC 軸發(fā)育畸形， 表明Nkx2.5對(duì)PDK1的調(diào)控主要發(fā)生在OFT、AVC，對(duì)心房、心室的發(fā)育無(wú)影響。用Nkx2.5-cre 敲除PDK1只表現(xiàn)為肺動(dòng)脈狹窄，主動(dòng)脈發(fā)育正常，應(yīng)該與它們的形成成熟時(shí)間有關(guān)，主動(dòng)脈形成成熟較早，在胚胎第12.5 天已經(jīng)基本發(fā)育成熟，而肺動(dòng)脈形成成熟較晚，到胚胎第16 天才完全成熟，Nkx2.5介導(dǎo)的PDK1敲除發(fā)揮作用時(shí)，主動(dòng)脈已經(jīng)發(fā)育成熟，而肺動(dòng)脈正處在發(fā)育階段，所以只表現(xiàn)為肺動(dòng)脈發(fā)育缺陷[5]。

實(shí)驗(yàn)中觀察到兩個(gè)個(gè)案小鼠，其中一只PDK1+/+小鼠心臟沒(méi)有AVC 軸發(fā)育，有兩個(gè)心房和一個(gè)心室。另外一只PDK1F/+，Nkx2.5-cre 小鼠也沒(méi)有AVC 軸發(fā)育，但有兩個(gè)心房和兩個(gè)心室，OFT 沒(méi)有分離。 分析其原因，可能與Nkx2.5-cre 小鼠有關(guān)，因?yàn)樵撔∈笠粭l染色體上的Nkx2.5基因的外顯子2 中敲入了cre，cre 基因的敲入破壞了Nkx2.5，使Nkx2.5活性受到了影響，從而導(dǎo)致心臟發(fā)育畸形。 如前所述，如果只是其中一個(gè)等位基因被破壞（雜合突變狀態(tài)），小鼠能正常發(fā)育和長(zhǎng)期生存（實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保留有該小鼠），但如果兩個(gè)等位基因都被破壞（純合突變狀態(tài)），心臟發(fā)育可能出現(xiàn)畸形。 Lyons 等[18]報(bào)道Nkx2.5突變小鼠有兩個(gè)心房，只有一個(gè)心室，且沒(méi)有AVC 軸的發(fā)育，與本研究觀察到的表型相同，因此PDK1+/+個(gè)案中有可能是Nkx2.5兩個(gè)等位都被破壞了。PDK1F/+，Nkx2.5-cre 個(gè)案小鼠，其心臟表型與PDK1+/+個(gè)案小鼠不一樣，在這例小鼠中PDK1、Nkx2.5可能都是雜合突變狀態(tài)，當(dāng)它們都被部分敲降后AVC 軸和OFT 不能正常發(fā)育，PDK1可能協(xié)同Nkx2.5調(diào)節(jié)心臟AVC 軸的發(fā)育。這是從小鼠的基因背景和心臟表型推斷得出的可能原因， 探究其根本原因還需要進(jìn)行全基因組系列測(cè)定才能確定。鑒于以上原因，為了在第二子代中能高效穩(wěn)定地獲得PDK1全敲小鼠，第一子代的正確配繁方法是，用純正的非Nkx2.5-cre 子代PDK1F/F雌性小鼠與PDK1F/+,Nkx2.5-cre雄性小鼠交配。

Nkx2.5是心臟發(fā)育中的重要調(diào)控因子，Nkx2.5通過(guò)調(diào)節(jié)下游基因的程序性表達(dá)或者協(xié)同其他轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)與DNA 的結(jié)合， 調(diào)控心臟的生長(zhǎng)發(fā)育和結(jié)構(gòu)功能的維持。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明Nkx2.5的突變?cè)谙忍煨孕呐K病發(fā)病中起重要的作用，Nkx2.5突變對(duì)心臟發(fā)育的影響在小鼠實(shí)驗(yàn)和人類(lèi)病例報(bào)告存在差異，通過(guò)基因突變手段得到的突變小鼠，Nkx2.5+/-雜合狀態(tài)下小鼠心臟的表型是正常的，只有在Nkx2.5-/-純合突變狀態(tài)下心臟表型才出現(xiàn)異常，且一種突變表型基本一致[18-19]。 但是在人類(lèi)中，Benson 等[20]報(bào)道Nkx2.5突變導(dǎo)致的心臟病屬于常染色體顯性遺傳，在雜合狀態(tài)下也出現(xiàn)表型，在被調(diào)查的四個(gè)家族心臟病患者中，Nkx2.5基因突變形式多樣，心臟的表型也各不相同。 國(guó)內(nèi)臨床病例報(bào)道，有的報(bào)道Nkx2.5突變與先天性心臟病有關(guān)聯(lián)[21-22]，有的報(bào)道與先天性心臟病無(wú)明確相關(guān)[23-25]，綜合國(guó)內(nèi)外病例報(bào)道，Nkx2.5突變與人類(lèi)先天性心臟病應(yīng)該存在關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果推斷，Nkx2.5功能的缺失可導(dǎo)致心臟發(fā)育畸形，PDK1可能是Nkx2.5的下游基因，Nkx2.5對(duì)PDK1的調(diào)控參與了心臟的生長(zhǎng)發(fā)育。

綜上所述，PDK1是調(diào)控小鼠心臟OFT 發(fā)育的重要因子， 參與了調(diào)控心臟流出道的胚胎發(fā)育成熟，也可能協(xié)同Nkx2.5調(diào)節(jié)心臟AVC 軸的發(fā)育。