王浩楠 林 濤 王雪青 張安龍 羅 清，*

（1.陜西科技大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，輕化工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，陜西西安，710021；2.陜西科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安，710021）

苯酚及其衍生物是制漿造紙[1]、紡織加工、煤氣化、石油精煉等工業(yè)廢水中常見(jiàn)的主要有機(jī)污染物。其中造紙廢水生化出水中含有27 種有機(jī)污染物，包括2,4-二叔丁基苯酚、2,2'-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、雙酚A、2,4,6-三氯苯酚等苯酚類(lèi)特征污染物[2]。而單體苯酚是苯酚類(lèi)污染物最簡(jiǎn)單的中間體，單體苯酚由于其難降解性和普遍存在性，常被認(rèn)定為具有酚類(lèi)代表性的難降解化學(xué)污染物[3-4]。在各種去除苯酚的方法中，生物降解法具有成本低、無(wú)二次污染、可循環(huán)使用等優(yōu)點(diǎn)，在含酚廢水處理中具有良好的應(yīng)用前景[5]。

然而，用于生物降解的游離微生物在細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞分離再利用過(guò)程中，容易受到環(huán)境因素（如培養(yǎng)液pH值和污染物濃度）敏感性的限制[6]。對(duì)游離細(xì)菌進(jìn)行固定化處理可增強(qiáng)微生物抵抗極端環(huán)境毒性的能力，同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)微生物的快速高效分離。許多有機(jī)材料和無(wú)機(jī)材料都可以作為細(xì)菌固定化基質(zhì)。瓊脂作為一種天然高分子聚合物，由于其膠凝能力強(qiáng)、耐酸，有較高的生物相容性，常被用作有機(jī)固定化基質(zhì)，因此許多研究中使用瓊脂來(lái)固定微生物和酶[7]。海藻酸鈉在溫和條件下可與鈣離子交聯(lián)，和游離細(xì)菌具有較高的相容性，是一種廣泛使用的無(wú)毒固定細(xì)菌材料[8]。近年來(lái)，蒙脫土、高嶺土等黏土礦物作為生物成分的載體和固定基質(zhì)，因其對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害作用和親水性而備受關(guān)注[9]。Fang 等人[10]用瓊脂卡拉膠復(fù)合納米Fe3O4固定化細(xì)菌，研究了材料對(duì)細(xì)菌的吸附性能和各因素的影響程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)固定化后可明顯提高降酚速率，且能實(shí)現(xiàn)高達(dá)50 次的循環(huán)利用率。Mandal 等人[11]研究發(fā)現(xiàn)膨潤(rùn)土固定化的分枝桿菌VF1 對(duì)酚降解速率有明顯提高，黏土復(fù)合材料可以減緩環(huán)境對(duì)細(xì)菌的毒性，從而為細(xì)菌的生存創(chuàng)造一個(gè)合適的微環(huán)境。

本研究利用蒙脫土作為有機(jī)復(fù)合固定化材料海藻酸鈉-瓊脂凝膠的支持基質(zhì)，制備海藻酸鈉-瓊脂-蒙脫土固定化微球。研究?jī)?yōu)化了固定化微球的最佳耦合條件和不同苯酚初始濃度下細(xì)菌的降解規(guī)律和降解動(dòng)力學(xué)模型，以確定苯酚降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)；探究了極端pH 條件下固定化微球的苯酚降解效果和固定化微球的循環(huán)利用性能及存儲(chǔ)穩(wěn)定性。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株、培養(yǎng)條件和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

實(shí)驗(yàn)使用的苯酚降解菌株為革蘭氏陰性短粗桿菌Klebsiella pneumoniaeZS01，來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室（-80℃超低溫冷凍儲(chǔ)存冰箱）。

1.1.2 培養(yǎng)條件

（1）菌株在pH 值為7 的MPYE 培養(yǎng)基中進(jìn)行富集，每升培養(yǎng)基中含有3 g 魚(yú)粉蛋白胨，3 g 酵母膏，1 g CaCl2·2H2O，1.6 g MgCl2，在恒溫?fù)u床中以150 r/min的轉(zhuǎn)速在35℃下進(jìn)行培養(yǎng)。菌株生長(zhǎng)24 h 后，在4℃下以8000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min 去除上清液來(lái)收集細(xì)菌。用無(wú)菌水通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在600 nm下將細(xì)菌濃度調(diào)整到0.8，用于細(xì)菌固定化。

（2）在苯酚降解過(guò)程中，富集菌株在35℃的Me?dA 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，每升培養(yǎng)基中含有：2 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%天冬氨酸、20 mL pH 值為6.8 的Solution C 溶液（10 g 氮川三乙酸，3.33 g CaCl2，29.5 g MgSO4·7H2O，93 mg (NH4)6Mo7O24·4H2O，99 mg FeSO4·7H2O，50 mL微量元素溶液）、1.25 g L-谷氨酸、10 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% NaCl。培養(yǎng)基用1 mol/L KOH 和1 mol/L HCl 溶液將其pH 值調(diào)至7.0～7.3 后120℃高溫滅菌30 min，然后用微孔濾膜加入10 mL 維生素溶液、20 mL 磷酸鹽緩沖溶液（將KH2PO4溶液加入到K2HPO4溶液中至pH值為6.8）。

（3）苯酚原液的配制：取一定量的苯酚將其配制成6 g/100 mL的苯酚原液并置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑

蒙脫土（240 m2/g）、海藻酸鈉、瓊脂和苯酚試劑均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技有限公司；其他化學(xué)品均為分析純或色譜純；所有培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)材料均預(yù)先在120℃下高壓滅菌。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

立式蒸汽壓力滅菌鍋，型號(hào)SN510C，重慶雅瑪拓科技有限公司；生物安全柜，型號(hào)AC2-4S1，新加坡ESCO 科技有限公司；雙層恒溫?fù)u床，型號(hào)QYC-210C，江蘇盛藍(lán)儀器制造有限公司；離心機(jī)，型號(hào)3k15，上海斯信生物科技有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，型號(hào)UV759，上海佑科儀器儀表有限公司；環(huán)境掃描電子顯微鏡（ESEM），型號(hào)S4800，日本理學(xué)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 固定化微球的制備

將蒙脫土和瓊脂溶解在去離子水中，混合分散加熱至100℃后，加入海藻酸鈉，不斷加熱攪拌30 min，至水凝膠混合均勻，并且確保水凝膠不含氣泡。混合均勻的水凝膠溶液在121℃的高壓滅菌鍋中滅菌30 min，將富集菌株加入至滅菌后冷卻的水凝膠溶液（約40℃）中并充分混合均勻。通過(guò)注射器將均質(zhì)水凝膠溶液滴入滅菌的CaCl2（4% 質(zhì)量/體積）中，制備直徑約3 mm、質(zhì)量約50 mg 的水凝膠珠，于4℃冰箱中固定化12 h。固定的水凝膠珠用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值=7.2）至少洗滌3次以去除微球上殘留的鈣離子，制得海藻酸鈉-蒙脫土-瓊脂固定化微球。制備的固定化微球儲(chǔ)存在4℃中以備后用。

1.3.2 苯酚降解實(shí)驗(yàn)

為更好地研究固定化微球的降解效果，首先探究了影響固定化微球生物降解苯酚性能的4個(gè)因素。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，對(duì)不同影響因素采用一定遞增比例的濃度進(jìn)行批量實(shí)驗(yàn)。將不同濃度的固定化微球和滅菌苯酚加入裝有100 mL 滅菌MedA培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，使苯酚濃度達(dá)到1000 mg/L。將所有燒瓶用滅菌封口膜密封以防止苯酚氧化，然后置于35℃、150 r/min的恒溫培養(yǎng)箱中降解。定期收集樣品，并測(cè)量殘留苯酚濃度。

在上述最佳條件下，還研究了固定化微球在苯酚作為唯一碳源時(shí)，苯酚降解性能最優(yōu)時(shí)的苯酚初始濃度。在不同苯酚初始濃度（200、400、600、800、1000 mg/L）條件下，接種相同濃度的游離細(xì)菌作為對(duì)比實(shí)驗(yàn)，將它們與固定化微球的降酚性能進(jìn)行比較。定期收集樣品測(cè)量苯酚的殘留濃度。苯酚降解數(shù)據(jù)用于計(jì)算苯酚降解的比降解速率和降解動(dòng)力學(xué)分析。

1.4 分析方法

殘留苯酚濃度采用4-氨基安替比林法測(cè)定[12]。采用比濁法對(duì)培養(yǎng)液中的生物量進(jìn)行測(cè)定（OD600）。

1.5 苯酚降解動(dòng)力學(xué)

一階動(dòng)力學(xué)通常用于描述不同污染物的生物降解?；?.4 研究結(jié)果，使用偽一級(jí)模型評(píng)估苯酚降解過(guò)程的降解動(dòng)力學(xué)。一階動(dòng)力學(xué)速率方程見(jiàn)式(1)和式(2)。

式中，St為t時(shí)刻苯酚濃度，mg/L，S0為苯酚初始濃度，mg/L，μ為比降解速率，h-1。生物降解率（dS/dt）由生物量指數(shù)生長(zhǎng)階段苯酚濃度隨時(shí)間的斜率決定。

Haldane 模型[13]被擬合到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中，以表示本研究中游離細(xì)菌和固定化微球?qū)Ρ椒拥慕到鈩?dòng)力學(xué)，見(jiàn)式(3)。

式中，μmax為最大比降解速率，h-1，S0為苯酚初始濃度，mg/L，Ks為底物親和常數(shù)，mg/L，Ki為底物抑制常數(shù)，mg/L。Ki值較大表示微生物對(duì)底物抑制的敏感性較低。通過(guò)使用非線性回歸[14]計(jì)算相應(yīng)的苯酚初始濃度和μ，獲得動(dòng)力學(xué)參數(shù)和擬合曲線。

1.6 重復(fù)使用性和貯存穩(wěn)定性

將固定化微球加入到含有1000 mg/L 苯酚的100 mL MedA 培養(yǎng)基中，每次循環(huán)時(shí)間一直持續(xù)到苯酚降解完成。每次生物降解過(guò)程結(jié)束后，棄去之前的培養(yǎng)基，用無(wú)菌水徹底清洗固定化微球3次，然后將其轉(zhuǎn)移到含有1000 mg/L 苯酚的100 mL MedA 新鮮培養(yǎng)基中，進(jìn)行循環(huán)降解實(shí)驗(yàn)。

為了評(píng)估固定化微球的貯存穩(wěn)定性，將固定化微球和含有相同濃度的游離細(xì)菌同時(shí)在4℃的冰箱中儲(chǔ)存5～30 天，然后在苯酚濃度為1000 mg/L 進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 游離細(xì)菌和固定化微球的表面形態(tài)及ESEM 形貌特征

2.1.1 表面形態(tài)

圖1(a)為海藻酸鈉微球的表面直觀圖，由圖1(a)可以看出，海藻酸鈉具有很好的成球性，呈透明白色狀。圖1(b)為固定化微球的表面直觀圖，復(fù)合瓊脂和蒙脫土后，微球變?yōu)椴煌该魅榘咨?，形狀?guī)則，球體大小均勻。圖1(c)為固定化微球重復(fù)使用5 次后的外觀圖，經(jīng)5次循環(huán)后，微球外觀已變成黃色，這是因?yàn)槲⑶騼?nèi)部繁殖生長(zhǎng)出大量的細(xì)菌細(xì)胞，且實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌為黃色，因此固定化微球也變成黃色。

2.1.2 ESEM分析

圖2(a)～圖2(d)為游離細(xì)菌、不同固定材料及固定化微球的橫截面形貌圖。由圖2(a)可以看出，海藻酸鈉微球內(nèi)部包含不規(guī)則的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)類(lèi)似于先前研究得出的結(jié)論[15]。由圖2(b)可以看出，此時(shí)海藻酸鈉-瓊脂-蒙脫土微球內(nèi)部變成了更為緊湊的片狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)?？梢?jiàn)瓊脂和蒙脫土與海藻酸鈉交聯(lián)后，微球內(nèi)部孔隙增多，一方面為細(xì)菌的附著和固定提供了更大的比表面積，另一方面也增加了底物的傳質(zhì)效率，也有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳輸和新陳代謝產(chǎn)物的排出。對(duì)比游離細(xì)菌（圖2(c)）的形貌圖，說(shuō)明固定化微球（圖2(d)）內(nèi)部有大量細(xì)菌成功附著。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)

圖1 不同材料的形態(tài)Fig.1 Appearance of different materials

圖2 不同固定材料及其固定化微球的ESEM圖Fig.2 ESEM images of different immobilized materials and immobilized microphere

本研究將海藻酸鈉滴入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%CaCl2溶液中形成凝膠微球，研究了不同海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)苯酚降解的影響。圖3(a)為海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)苯酚降解速率的影響。由圖3(a)可知，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的固定化微球苯酚達(dá)到最大降解速率（18.18 mg/（L·h））。隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)增多，固定化微球內(nèi)部比表面積增大，為微生物提供了足夠的吸附、生長(zhǎng)、繁殖的空間，從而提高了微生物傳質(zhì)效率。海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至1.5%時(shí)，導(dǎo)致固定化微球的苯酚降解速率下降（15.87 mg/（L·h）），說(shuō)明高質(zhì)量分?jǐn)?shù)海藻酸鈉會(huì)使固定化微球內(nèi)部過(guò)飽和，阻礙底物分子通過(guò)微球內(nèi)部擴(kuò)散，降低細(xì)菌對(duì)苯酚的降解速率[16]。綜上，制備固定化微球海藻酸鈉的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%。

2.2.2 蒙脫土質(zhì)量分?jǐn)?shù)

不同蒙脫土質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)苯酚降解的影響結(jié)果見(jiàn)圖3(b)。由圖3(b)可知，當(dāng)蒙脫土質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0 增加到1.0%時(shí)，苯酚降解速率緩慢增加。當(dāng)蒙脫土質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%時(shí)，苯酚降解速率達(dá)最大值17.85 mg/（L·h）。這是因?yàn)槊擅撏量梢晕丈倭勘椒?，減輕苯酚對(duì)細(xì)胞的毒性，為細(xì)菌生存創(chuàng)造良好的微環(huán)境。在固定化微球中加入蒙脫土可以提高其機(jī)械強(qiáng)度、滲透性[15]。但當(dāng)蒙脫土質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至2.0%時(shí)，苯酚降解速率與低質(zhì)量分?jǐn)?shù)蒙脫土苯酚降解速率相當(dāng)，約（16 mg/（L·h）），這可能是由于固定化微球中高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蒙脫土堵塞了微球的內(nèi)部孔隙，阻礙了細(xì)菌的生長(zhǎng)和底物的擴(kuò)散，從而抑制了降解細(xì)菌的活性。綜合考慮，固定化微球中蒙脫土的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%。

2.2.3 瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)

瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化微球降解苯酚性能的影響如圖3(c)所示。由于瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)增高（0.5%、1.0%），固定化微球的片狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)增加，固定化微球內(nèi)部平均孔徑增加，機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性也隨之增加，固定化細(xì)菌的數(shù)量也隨之增加，細(xì)菌降解苯酚的速率進(jìn)一步提高，這一結(jié)果在Rehman 等人[17]的研究中也有體現(xiàn)。當(dāng)瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)（2.0%），固定化微球內(nèi)部變得更為致密，導(dǎo)致內(nèi)部孔徑減小，也影響了底物擴(kuò)散到固定化微球內(nèi)部的速度，從而降低了苯酚的降解效率。因此，制備固定化微球的最佳瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。

2.2.4 細(xì)菌接種量

不同包埋細(xì)菌濃度（體積分?jǐn)?shù)10%～30%）(OD600為0.8)對(duì)苯酚降解速率的影響結(jié)果如圖3(d)所示。由圖3(d)可知，隨著細(xì)菌接種量的增加，苯酚的降解速率逐漸增加。細(xì)菌接種量從20%增加至25%時(shí)，苯酚降解速率迅速增加到18 mg/（L·h），這是因?yàn)榧?xì)菌細(xì)胞對(duì)高濃度苯酚的適應(yīng)性逐漸增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞增殖更快，生物降解效率更高。當(dāng)接種量升高至30%時(shí)，降解速率并未顯著提高，大量細(xì)菌在微球內(nèi)部迅速繁殖導(dǎo)致微球過(guò)飽和，此時(shí)不僅影響微球的機(jī)械穩(wěn)定性，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌從微球泄露到溶液中，影響后續(xù)循環(huán)降解實(shí)驗(yàn)[18]。綜合上述因素，制備固定化微球的最佳細(xì)菌接種量為25%。

2.2.5 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用正交實(shí)驗(yàn)考察影響固定化微球各因素之間的交互作用，從而確定最優(yōu)的細(xì)菌固定化條件，正交因素水平如表1所示。

表1 固定化微球降解苯酚正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment on degradation rate of phenol by immobilized microspheres

圖3 影響苯酚降解速率的因素Fig.3 Factors affecting the degradation rate of phenol

Ki值表示該列因素水平為i時(shí)所對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果總和，可以判斷某個(gè)因素的最優(yōu)水平和最優(yōu)組合；R值表示某個(gè)因素水平的極差，反應(yīng)某個(gè)因素水平波動(dòng)時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的變動(dòng)幅度，R值越大，該因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響越大，可以判斷因素的主次順序。以固定化微球?qū)Ρ椒拥慕到馑俾蕿榭疾熘笜?biāo)，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。由表2 可知，影響固定化微球?qū)Ρ椒咏到馑俾室蛩氐闹鞔雾樞驗(yàn)椋汉Ｔ逅徕c質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞細(xì)菌接種量＞瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞蒙脫土質(zhì)量分?jǐn)?shù)。正交實(shí)驗(yàn)得出制備固定化微球的最優(yōu)組合為：海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%，蒙脫土質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%，細(xì)菌接種量25%。在最優(yōu)固定化條件下制備固定化微球，固定化微球可在60 h內(nèi)完全降解1000 mg/L的苯酚，苯酚降解速率為16.67 mg/(L·h)。

表2 固定化微球降解苯酚正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results and analysis of degradation rate of phenol by immobilized microspheres

2.3 苯酚初始濃度的影響

在最優(yōu)海藻酸鈉-瓊脂-蒙脫土固定化條件下制備固定化微球后，固定化微球在不同苯酚初始濃度下的苯酚降解過(guò)程如圖4 所示。由圖4 可知，固定化微球在60 h 內(nèi)對(duì)不同初始濃度下的苯酚可以全部有效降解，而游離細(xì)菌降解完成則需要72 h（降解速率為13.89 mg/（L·h））。首先，固定化微球?qū)Ρ椒佑幸欢ǖ奈阶饔?，所以固定化微球在? h，苯酚濃度均有明顯下降。不同的是在低苯酚初始濃度（0～400 mg/L）的條件下，苯酚濃度的降低實(shí)際上與時(shí)間呈線性關(guān)系，因此，在線性范圍內(nèi)對(duì)于給定的苯酚初始濃度，降解速率是恒定的。但在高濃度條件下（400～1000 mg/L），固定化微球的降解存在一定的滯后期（大概12 h左右），這是由于高濃度苯酚對(duì)細(xì)菌降解的抑制作用，因此苯酚濃度隨時(shí)間的下降呈非線性。游離細(xì)菌的降解規(guī)律與固定化微球有很大的相似性，但不同的是游離細(xì)菌有長(zhǎng)達(dá)24 h滯后期。對(duì)細(xì)菌進(jìn)行固定化處理在一定程度上可以降低高濃度苯酚直接接觸對(duì)細(xì)菌降解產(chǎn)生的抑制作用，因此固定化后明顯降低了細(xì)菌降解苯酚的遲滯期。

2.4 苯酚降解動(dòng)力學(xué)

在指數(shù)生長(zhǎng)階段測(cè)定了200～1000 mg/L 苯酚初始濃度的一級(jí)生物降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如表3 所示。由表3可知，隨著苯酚初始濃度的增加，固定化微球在400 mg/L時(shí)比降解速率達(dá)到最大值。

圖4 苯酚初始濃度對(duì)固定化微球和游離細(xì)菌降解苯酚的影響Fig.4 Effect of the initial concentration of phenol on the degradation of phenol by immobilized micropheres and free bacteria

表3 游離細(xì)菌和固定化微球?qū)Ρ椒拥囊患?jí)降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 3 Parameters of first-order biodegradation kinetics of phenol by free bacteria and immobilized micropheres

圖5 游離細(xì)菌和固定化微球比生長(zhǎng)率擬合曲線Fig.5 Fitting curve of specific growth rate of free bacteria and immobilized micropheres

將上述比降解速率與其對(duì)應(yīng)的苯酚初始濃度通過(guò)非線性曲線擬合，確定游離細(xì)菌和固定化微球的比生長(zhǎng)率擬合曲線圖以及模型預(yù)測(cè)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)圖5。由圖5 可知，游離細(xì)菌（R2=0.944）和固定化微球（R2=0.953）的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和模型預(yù)測(cè)均具有較高的相關(guān)系數(shù)。數(shù)據(jù)擬合Haldane 模型得到的動(dòng)力學(xué)參數(shù)值表明固定化微球獲得的預(yù)測(cè)μmax值（0.257 h-1）顯著高于游離細(xì)菌μmax（0.198 h-1），表明固定化微球具有更高的苯酚降解性能。游離細(xì)菌苯酚比降解速率在苯酚初始濃度約100～200 mg/L 時(shí)達(dá)到最大值，而固定化微球的比降解速率在苯酚初始濃度200～300 mg/L時(shí)達(dá)到最高；苯酚的進(jìn)一步增加導(dǎo)致μ的減少，表明高濃度苯酚對(duì)生物降解能力有相當(dāng)大的抑制作用。固定化微球可以耐受高濃度的苯酚，在1000 mg/L 時(shí)固定化微球μ約為0.07 h-1，而游離細(xì)菌μ為0.04 h-1。模型參數(shù)顯示固定化微球的底物抑制常數(shù)Ki（402.5）大于游離細(xì)菌Ki（233.1），說(shuō)明固定化微球?qū)Ρ椒右种频拿舾行缘陀谟坞x細(xì)菌。這是因?yàn)楣潭ɑ⑶騼?nèi)部由有機(jī)-無(wú)機(jī)耦合形成的交叉網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可以作為苯酚對(duì)細(xì)胞毒性的有益物理屏障，從而降低底物對(duì)細(xì)菌抑制作用的敏感性，增強(qiáng)細(xì)菌在高苯酚初始濃度下的降酚能力[19]。

2.5 苯酚在強(qiáng)酸性和強(qiáng)堿性條件下降解

培養(yǎng)液的pH 值影響細(xì)菌的酶活性，進(jìn)而影響微生物的生長(zhǎng)速度，以及降酚菌對(duì)苯酚的降解效率。極端pH 環(huán)境下對(duì)固定化微球降解苯酚初始濃度為1000 mg/L 的影響見(jiàn)圖6。圖6(a)顯示當(dāng)pH 值為1 時(shí)，游離細(xì)菌完全不能降解苯酚，這是由于強(qiáng)酸性容易導(dǎo)致酶失活，相同條件下固定化微球則可以完成降解，但降解所需時(shí)間長(zhǎng)達(dá)78 h；pH值為3時(shí)固定化微球完成降解時(shí)間也需68 h。以上結(jié)果表明，復(fù)合固定化材料有效地保護(hù)了細(xì)菌的活性。圖6(b)顯示當(dāng)pH 值提高到10 和12，游離細(xì)菌對(duì)苯酚有一定程度的降解，同時(shí)固定化微球也能在相同條件下保持較高的降解效率（pH 值為10和12時(shí)，完成降解時(shí)間分別為60 h和68 h）。固定化微球在pH值為10的降解效率最高，這可能是由于苯酚降解過(guò)程中的酸性代謝物與培養(yǎng)基中的堿性化合物發(fā)生中和反應(yīng)，從而自動(dòng)調(diào)整了反應(yīng)系統(tǒng)中的pH[20]。結(jié)果表明，固定化微球作為屏障，可以保護(hù)內(nèi)部細(xì)菌免受極端環(huán)境的侵害，固定化后細(xì)菌對(duì)酸性和堿性環(huán)境均具有較好的適應(yīng)性。

2.6 固定化微球的重復(fù)使用性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性

2.6.1 重復(fù)使用性

圖6 極端pH值對(duì)游離細(xì)菌和固定化微球降解苯酚的影響Fig.6 Effect of extreme pH on the degradation of phenol by free bacteria and immobilized micropheres

圖7 循環(huán)周期中固定化微球的苯酚降解速率與細(xì)菌活性Fig.7 Degradation rate and cell viability of immobilized micropheres in the cycle

重復(fù)使用性是固定化微球的一個(gè)重要考察指標(biāo)，循環(huán)周期中固定化微球苯酚降解速率和細(xì)胞活性見(jiàn)圖7。如圖7(a)所示，在前6 個(gè)循環(huán)中苯酚降解速率迅速增加，苯酚降解速率從16.67 mg/（L·h）增加到45.45 mg/（L·h），此時(shí)固定化微球降酚效率處于穩(wěn)定期，降解時(shí)間維持在22 h。由圖7(b)可知，設(shè)定初始細(xì)菌活性為100%，相對(duì)活性以其初始活性的百分比表示，循環(huán)周期中固定化微球的相對(duì)活性與苯酚降解速率的趨勢(shì)是一致的，重復(fù)培養(yǎng)時(shí)細(xì)菌分泌大量胞外聚合物，形成了生物膜，為重復(fù)苯酚降解提供適當(dāng)?shù)沫h(huán)境[19]。后期降解效率略微下降，這可能是因?yàn)楣潭ɑ⑶蛑屑?xì)菌生物質(zhì)的最大量，限制了底物轉(zhuǎn)移到微球內(nèi)部中。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察發(fā)現(xiàn)，珠粒的形態(tài)基本保持完整的形態(tài)，直到32 次循環(huán)結(jié)束，珠子結(jié)構(gòu)完全被破壞，循環(huán)終止。

2.6.2 儲(chǔ)存穩(wěn)定性

固定化微球的儲(chǔ)存穩(wěn)定性是其是否能被工業(yè)化大規(guī)模應(yīng)用的重要考量因素之一。圖8為固定化微球和游離細(xì)菌的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。如圖8所示，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，固定化微球保持穩(wěn)定的苯酚降解率，在4℃下儲(chǔ)存30 天后依然可以去除99%的苯酚。微球內(nèi)的細(xì)菌保持生理穩(wěn)定性且微球具有較高的機(jī)械強(qiáng)度。相比之下，游離細(xì)菌的苯酚降解率在超過(guò)15 天后急劇下降，甚至在30 天后失去活性。以上結(jié)果表明固定化微球具有很強(qiáng)的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，可以重復(fù)使用，在實(shí)際應(yīng)用中具有巨大的潛力。

圖8 固定化微球和游離細(xì)菌的儲(chǔ)存穩(wěn)定性Fig.8 Storage stability of immobilized micropheres and free bacteria

3 結(jié) 論

本研究制備了海藻酸鈉-瓊脂-蒙脫土固定化微球苯酚降解菌，以苯酚降解速率為考察指標(biāo)，探究了最佳固定化條件及各因素對(duì)苯酚降解速率的影響。

3.1 以海藻酸鈉-瓊脂-蒙脫土凝膠微球?yàn)檩d體制備固定化微球的最佳條件為：1.0%海藻酸鈉、1.5%蒙脫土、1.0%瓊脂和25%細(xì)菌接種量。與游離細(xì)菌苯酚降解速率（13.89 mg/(L·h)）相比，固定化微球的苯酚降解速率（16.67 mg/(L·h)）顯著提高。

3.2 細(xì)菌的生物降解能力受苯酚初始濃度影響較大。較高的苯酚初始濃度會(huì)抑制生物量，降低生物降解率。固定化微球在60 h 內(nèi)對(duì)1000 mg/L 的苯酚有較好的降解效果，而在相同條件下游離細(xì)菌降解則需要72 h。Haldane 抑制模型顯示，固定化可以顯著降低細(xì)菌對(duì)苯酚抑制的敏感性。

3.3 極端酸堿性條件下，固定化微球的降酚性能體現(xiàn)了顯著的優(yōu)越性，可以承受更廣泛的酸性變化，并在堿性條件下保持較高的降解效率。

3.4 固定化微球可重復(fù)使用32 次，在4℃保存30 天后，依舊可以去除99%的苯酚。