靳皓然，魯建軍，余 安，何 杰，張紫緹，盤(pán)鑫海，袁德義，范曉明

（1. 中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)試驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2. 長(zhǎng)沙市林木種苗管理站，湖南 長(zhǎng)沙 410399）

油茶Camellia oleifera為山茶科Theaceae 山茶屬Camellia植物，被譽(yù)為“東方的橄欖樹(shù)”，是我國(guó)南方地區(qū)重要的木本食用油料樹(shù)種之一，和油棕、椰子、油橄欖并稱(chēng)為世界四大木本油料樹(shù)種[1-3]。油茶種植利用歷史悠久，廣泛分布于中國(guó)中南部的低山丘陵地區(qū)，在東南亞北部如泰國(guó)等地也有種植[4-6]。然而，低產(chǎn)低效長(zhǎng)期制約著油茶產(chǎn)業(yè)的健康高效發(fā)展[7]。其主要原因是優(yōu)良品種短缺，而傳統(tǒng)的無(wú)性系選育和雜交育種方法均存在育種周期長(zhǎng)、性狀不穩(wěn)定等問(wèn)題[8]。利用單倍體誘導(dǎo)可以加快育種進(jìn)程，獲得所需性狀的純合體，加快優(yōu)良品種的選育。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)是人工獲得單倍體的重要途徑之一，包括通過(guò)離體培養(yǎng)花藥或花粉誘導(dǎo)小孢子發(fā)育和通過(guò)離體培養(yǎng)未授粉子房或胚珠誘導(dǎo)卵細(xì)胞發(fā)育[9]。子房的離體培養(yǎng)研究可以追溯到1979 年，Noeum 首次通過(guò)培養(yǎng)大麥未授粉子房獲得單倍體植株，并提出將這一過(guò)程定義為“雌核發(fā)育”[10]。經(jīng)過(guò)近半個(gè)世紀(jì)的發(fā)展，未授粉子房培養(yǎng)已經(jīng)被證明是一種有效縮短育種年限的方法，可快速篩選純合子材料的優(yōu)勢(shì)使之受到廣泛關(guān)注[11]。目前，通過(guò)培養(yǎng)未授粉的雌核，已獲得許多植物的單倍體，如洋蔥、黃瓜、非洲菊、柑橘等[12-15]。

前人對(duì)油茶花藥進(jìn)行了30 多年的離體培養(yǎng)，但未能獲得再生植株[8,16-18]，說(shuō)明該方法具有較大的挑戰(zhàn)性。關(guān)于油茶未授粉子房的離體培養(yǎng)研究鮮見(jiàn)報(bào)道。愈傷組織是由散亂細(xì)胞組成的無(wú)定形去分化組織，影響其誘導(dǎo)、離體培養(yǎng)和發(fā)育的因素包括外植體類(lèi)型、激素、培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基pH 等[19]。在未授粉子房培養(yǎng)中，單倍體再生植株的獲得取決于預(yù)處理方式、雌配子體發(fā)育時(shí)期和培養(yǎng)基組成等因素。本研究中探討了油茶未授粉子房愈傷組織誘導(dǎo)的影響因素，包括子房消毒滅菌方法、切割方式、發(fā)育時(shí)期、預(yù)處理方式和激素配比，以期為以油茶未授粉子房誘導(dǎo)再生單倍體植株提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料取自中南林業(yè)科技大學(xué)油茶種質(zhì)資源圃無(wú)病蟲(chóng)害的‘華碩’健康植株。2020 年11—12 月晴朗天氣的上午9:00—11:00，采集不同發(fā)育時(shí)期的未授粉花蕾，放在冰盒中帶回試驗(yàn)室。除預(yù)處理對(duì)照組所需花蕾外，其余花蕾均在使用前采集。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將外植體使用75%乙醇溶液消毒30 或60 s，使用0.1%升汞溶液或10%次氯酸鈉溶液消毒5、10 或15 min，放入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)1、7 d 后，觀察其染菌率和褐化情況，篩選最佳消毒方式；選擇0.3 mg/L 生長(zhǎng)素（NAA、IAA、IBA、2,4-D）和3 mg/L 細(xì)胞分裂素（6-BA、KT、TDZ）兩兩組合添加在培養(yǎng)基中，篩選適宜的激素種類(lèi)；選擇橫切、縱切、切喙和不切4 種方式處理子房外植體，探索切割方式對(duì)子房愈傷組織誘導(dǎo)率的影響[20-21]；分別以開(kāi)花前倒數(shù)第7 天、倒數(shù)第3 天、倒數(shù)第1 天和開(kāi)花當(dāng)天的花蕾子房為外植體，篩選適宜的子房發(fā)育時(shí)期[22-24]；將未授粉花蕾在4、35 ℃黑暗條件下，持續(xù)處理1 或2 d，研究預(yù)處理對(duì)子房愈傷組織誘導(dǎo)的影響。每次試驗(yàn)均采用前一次試驗(yàn)的最佳處理。

采用愈傷組織誘導(dǎo)率最高的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素組合，并在培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度（40、50、60 g/L）的蔗糖，進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)，探索誘導(dǎo)子房愈傷組織的該激素組合及蔗糖的最佳濃度。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 外植體處理

將花蕾用流水沖洗20 min，在無(wú)菌條件下剝離花瓣、萼片和花柱等部分，僅剩子房。先用無(wú)菌水沖洗子房3 ～5 次，再用75%乙醇溶液消毒，無(wú)菌水沖洗3 ～5 次，然后用0.1%升汞溶液或10%次氯酸鈉溶液消毒，其間不斷振蕩，最后用無(wú)菌水沖洗3 ～5 次。將子房放在濾紙上晾干水分，進(jìn)行切割處理后接種在培養(yǎng)基上。

1.3.2 培養(yǎng)基配制

以MS 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用7 g/L 瓊脂固化，用1 mol/L 稀HCl 或NaOH 溶 液 將pH 調(diào) 至5.4 ～5.6。將培養(yǎng)液分成每份30 ～40 mL，置于121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌20 min。

1.3.3 培養(yǎng)條件

每瓶接種2 個(gè)子房，每組處理接種4 個(gè)培養(yǎng)瓶，重復(fù)3 次。置于(26±2) ℃光照培養(yǎng)室中，在一定光周期（光照16 h，黑暗8 h）下培養(yǎng)，使用冷白光LED 燈管，光照強(qiáng)度為2 000 lx。

1.4 數(shù)據(jù)分析

30 d后統(tǒng)計(jì)子房的愈傷組織誘導(dǎo)率和褐化率。愈傷組織誘導(dǎo)率為誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)量占接種外植體數(shù)量的百分比；褐化率為褐變子房或愈傷組織數(shù)量占接種子房數(shù)量的百分比。

使用Photoshop 軟件處理照片，使用Microsoft Excel 軟件制作圖片，使用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行差異性檢驗(yàn)和LSD 多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒處理對(duì)油茶子房褐化和染菌的影響

采用不同的消毒劑處理不同時(shí)長(zhǎng)后，子房產(chǎn)生了不同程度的褐化反應(yīng)。將子房的褐化程度分為4 個(gè)等級(jí)，分別為正常、輕度褐化、中度褐化和重度褐化，若褐化程度在2 個(gè)等級(jí)之間，則歸入較嚴(yán)重的褐化等級(jí)，消毒7 d 后不同褐化程度的子房如圖1 所示。不同消毒方式處理下油茶子房的褐化率和染菌率見(jiàn)表1。

圖1 不同褐化程度的子房Fig. 1 Different degrees of browning of ovary

表1 不同消毒方式處理中油茶子房的褐化率和染菌率Table 1 Browning rate and infection rate of ovaries of C. oleifera treated by different disinfection methods

從表1 可以看出，D 處理的效果最好，即用75%乙醇溶液消毒60 s 和0.1%升汞溶液消毒5 min。D 組處理中，消毒1 d 后正常子房和輕度褐化子房的比例為80.0%，感染率為0；消毒7 d 后正常子房和輕度褐化子房的比例為70.0%，感染率仍為0。用其他消毒方式處理的子房的褐化程度較嚴(yán)重，少部分出現(xiàn)染菌情況。因此，75%乙醇溶液消毒60 s 和0.1%升汞溶液消毒5 min 的組合為最合適的消毒滅菌方式。

2.2 激素對(duì)油茶子房愈傷組織誘導(dǎo)的影響

不同激素組合處理下油茶子房的愈傷組織誘導(dǎo)情況見(jiàn)表2。由表2 可以看出，各激素組合對(duì)子房愈傷組織誘導(dǎo)的影響顯著。在12 組處理中，C組處理（NAA 和TDZ 組合）的子房愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為63.89%。

表2 不同激素組合處理下油茶子房的愈傷組織誘導(dǎo)情況?Table 2 Callus induction of C. oleifera ovary under different hormone combinations

同時(shí)，激素種類(lèi)對(duì)愈傷組織的形態(tài)和生長(zhǎng)速率也有影響，不同激素組合處理下油茶子房愈傷組織的形態(tài)如圖2 所示。由圖2 可以看出：C 組處理的愈傷組織呈淺綠色，質(zhì)地緊密，生長(zhǎng)速度中等；I 組處理的愈傷組織誘導(dǎo)率雖然低于C 組，但愈傷組織同樣呈淺綠色，質(zhì)地緊密。由于C 組和I 組處理均使用了TDZ，因此推測(cè)TDZ 對(duì)形成良好的愈傷組織有一定的促進(jìn)作用。綜合來(lái)看，NAA和TDZ 組合更適合油茶子房愈傷組織的誘導(dǎo)。

圖2 不同激素組合處理下油茶子房愈傷組織的形態(tài)Fig. 2 Morphology of C. oleifera ovary callus treated with different hormone combinations

2.3 切割方式對(duì)油茶子房愈傷組織誘導(dǎo)的影響

不同切割方式處理下油茶子房的愈傷組織誘導(dǎo)情況見(jiàn)表3。由表3 可以看出，橫切、縱切、切喙和不切割對(duì)子房愈傷組織誘導(dǎo)率影響的差異顯著。在4 種切割方式處理中：縱切處理的子房愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為64.58%；切喙處理的效果最差，誘導(dǎo)率僅為8.33%。其原因可能是切喙處理未能使胚珠暴露出來(lái)，愈傷組織的誘導(dǎo)受限，縱切子房時(shí)產(chǎn)生的創(chuàng)面較大，可以使胚珠充分暴露出來(lái)，刺激了愈傷組織的發(fā)生。由此可知，縱切子房可有效提高油茶子房的愈傷組織誘導(dǎo)率。

表3 不同切割方式處理下油茶子房愈傷組織的誘導(dǎo)情況?Table 3 Induction of C. oleifera ovary callus under different cutting methods %

2.4 發(fā)育時(shí)期對(duì)油茶子房愈傷組織誘導(dǎo)的影響

所選取4 個(gè)發(fā)育時(shí)期的油茶花蕾的外部形態(tài)如圖3 所示，開(kāi)花前隨時(shí)間推移逐漸露白，開(kāi)花當(dāng)天花瓣打開(kāi)。

圖3 不同發(fā)育時(shí)期油茶花蕾的外部形態(tài)Fig. 3 External morphology of C. oleifera bud at different development stages

不同發(fā)育時(shí)期采樣處理下子房愈傷組織的誘導(dǎo)情況見(jiàn)表4。由表4 可以看出，子房的發(fā)育時(shí)期對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響有顯著差異。其中：采集開(kāi)花當(dāng)天花蕾處理中，子房愈傷組織誘導(dǎo)率最高，可達(dá)66.67%；采集開(kāi)花前倒數(shù)第7 天、倒數(shù)第1 天的花蕾處理中誘導(dǎo)率次之，分別為47.92%和45.04%。開(kāi)花當(dāng)天，子房發(fā)育為7 細(xì)胞8 核的成熟胚囊結(jié)構(gòu)，更容易誘導(dǎo)成功。因此，以開(kāi)花當(dāng)天的子房為外植體時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率更高。

表4 不同發(fā)育時(shí)期采樣處理下子房愈傷組織的誘導(dǎo)情況?Table 4 Induction of ovary callus under sampling treatments at different developmental stages %

2.5 預(yù)處理對(duì)油茶子房愈傷組織誘導(dǎo)的影響

不同預(yù)處理下（2 組冷處理和2 組熱處理，以不進(jìn)行預(yù)處理為空白對(duì)照組）油茶子房愈傷組織的誘導(dǎo)情況見(jiàn)表5。由表5 可以看出，預(yù)處理對(duì)油茶子房愈傷組織的誘導(dǎo)有顯著影響。其中：將花蕾在35 ℃熱處理1 d 后，子房的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)到70.83%；其次為空白對(duì)照組，誘導(dǎo)率為64.58%。將花蕾在35 ℃處理2 d 后，子房干枯死亡，無(wú)法產(chǎn)生愈傷組織。將花蕾在4℃預(yù)處理1 d后，子房的褐化率最低，可能是低溫抑制了酚類(lèi)物質(zhì)的合成，減緩了褐化。因此，在35 ℃條件下預(yù)處理花蕾1 d 可以提高子房愈傷組織的誘導(dǎo)率。

表5 不同預(yù)處理下油茶子房愈傷組織的誘導(dǎo)情況?Table 5 Induction of C. oleifera ovary callus under different pretreatments %

2.6 激素和蔗糖組合處理對(duì)油茶子房愈傷組織誘導(dǎo)的影響

在L9(33)正交試驗(yàn)中，激素和蔗糖組合處理下油茶子房愈傷組織的誘導(dǎo)情況見(jiàn)表6。由表6 可以看出，激素配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)有顯著影響。在9 組處理中，子房愈傷組織的誘導(dǎo)率為13.89%～72.34%。其中，D 組處理（NAA 0.3 mg/L+TDZ 2 mg/L）的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為72.34%。

表6 激素和蔗糖組合L9(33)正交試驗(yàn)中油茶子房愈傷組織的誘導(dǎo)情況?Table 6 Induction rate of C. oleifera ovary callus in the L9 (33)orthogonal test of hormone and sucrose combination

對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率進(jìn)行極差分析，結(jié)果見(jiàn)表7。由表7 可以看出，在3 個(gè)試驗(yàn)因子中，TDZ 對(duì)誘導(dǎo)率極差的影響最大，誘導(dǎo)率極差為24.88%，其次為NAA，誘導(dǎo)率極差為22.41%，蔗糖對(duì)誘導(dǎo)率的影響最小，誘導(dǎo)率極差僅為8.99%。最優(yōu)處理組合為A2B1C3，即NAA 0.3 mg/L，TDZ 2 mg/L，蔗糖60 g/L。

表7 正交試驗(yàn)中油茶子房愈傷組織誘導(dǎo)率的極差分析結(jié)果Table 7 Result of range analysis of callus induction rate of C. oleifera ovary in orthogonal experiment

對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率進(jìn)一步進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表8。由表8可以看出，2種激素NAA（F=8.232，P＜0.05）和TDZ（F=10.054，P＜0.05）對(duì) 誘導(dǎo)率的影響顯著，蔗糖對(duì)誘導(dǎo)率的影響不顯著（F=1.299，P＞0.05）。因此，油茶子房愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+60 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂+0.3 mg/L NAA+2 mg/L TDZ。

表8 正交試驗(yàn)中油茶子房愈傷組織誘導(dǎo)率的方差分析結(jié)果Table 8 Result of variance analysis of callus induction rate of C. oleifera ovary in orthogonal experiment

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明：油茶未授粉子房和胚珠離體培養(yǎng)的影響因子有激素的種類(lèi)和濃度、子房發(fā)育時(shí)期、切割方式、預(yù)處理方式等。其中激素種類(lèi)和濃度對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)有顯著影響，誘導(dǎo)率最高的激素組合為NAA 和TDZ；縱切子房的創(chuàng)傷面暴露更大，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為64.58%；開(kāi)花當(dāng)天花蕾的胚囊發(fā)育成熟，較開(kāi)花前花蕾的子房愈傷組織誘導(dǎo)率更高，為66.67%；冷（4 ℃）預(yù)處理雖然降低了褐化率，但誘導(dǎo)率不如熱激（35 ℃）預(yù)處理的效果好，最佳預(yù)處理方式是熱激（35 ℃）預(yù)處理1 d；對(duì)NAA、TDZ、蔗糖進(jìn)行正交試驗(yàn)的結(jié)果表明，TDZ 對(duì)誘導(dǎo)率的影響高于NAA，蔗糖影響最小，NAA 0.3 mg/L、TDZ 2 mg/L和蔗糖60 g/L 組合處理的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為72.34%。因此，在本試驗(yàn)中愈傷組織誘導(dǎo)效果最好的處理是選擇開(kāi)花當(dāng)天的花蕾，熱激（35 ℃）預(yù)處理1 d 后，無(wú)菌條件下剝出子房，并使用乙醇（60 s）和升汞（5 min）消毒，縱切后接種到MS+60 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂+0.3 mg/L NAA+2 mg/L TDZ 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30 d 后子房的愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)72.34%。

3.1 未授粉油茶子房消毒處理的最佳方式

子房消毒是誘導(dǎo)愈傷組織的前提，合適的消毒方式需要在抗褐化和殺菌之間保持平衡。消毒過(guò)度可能導(dǎo)致外植體發(fā)生褐變，但消毒不足可能導(dǎo)致外植體染菌。常見(jiàn)的消毒劑包括乙醇溶液、升汞溶液和次氯酸鈉溶液，其適宜濃度因植物種類(lèi)的不同而有異。Zhang 等[25]采用75%乙醇溶液消毒50 s 和10%次氯酸鈉溶液消毒15 ～20 min 的方法處理油茶種子，誘導(dǎo)率較高；Zou 等[20]以西瓜子房為材料，首先用75%乙醇溶液消毒1 min，切片后再用2%次氯酸鈉溶液消毒2 min，效果較好。本試驗(yàn)中使用75%乙醇溶液與10%次氯酸鈉溶液或0.1%升汞溶液進(jìn)行組合消毒，結(jié)果顯示，使用乙醇溶液消毒60 s 和0.1%升汞溶液消毒5 min 的處理中，子房的褐化率和感菌率均最低。說(shuō)明此消毒方法不但殺菌效果好，且較少造成外植體褐變。

3.2 未授粉油茶子房誘導(dǎo)愈傷組織的影響因素

激素種類(lèi)和濃度是影響愈傷組織誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素。Fehér 等[26]的研究結(jié)果表明，生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是參與調(diào)節(jié)植物細(xì)胞分裂和分化的主要激素。Deng 等[13]認(rèn)為，離體雌核培養(yǎng)的目的是使雌配子體細(xì)胞從配子體發(fā)育途徑向孢子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)變，添加激素可以有效地促進(jìn)雌核發(fā)育。在本試驗(yàn)中，TDZ 濃度對(duì)子房愈傷組織的誘導(dǎo)率有顯著影響，正交試驗(yàn)中添加2 mg/L TDZ 的D組和G 組處理的愈傷組織誘導(dǎo)率較高。據(jù)報(bào)道，用TDZ 誘導(dǎo)子房培養(yǎng)胚時(shí)，黃瓜植株再生頻率最高[27-28]。因此TDZ 在離體雌核培養(yǎng)中有一定的積極作用。

子房切割方式、子房發(fā)育時(shí)期、預(yù)處理方式等因素對(duì)油茶子房和胚珠愈傷組織的誘導(dǎo)也有顯著影響。本試驗(yàn)所選用的4 種子房切割方式中，縱切子房的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為64.58%，切喙子房的愈傷組織誘導(dǎo)率最低，僅為8.33%。陳學(xué)軍等[21]認(rèn)為：一方面，可能是切喙未能使胚珠外露，影響愈傷組織的產(chǎn)生；另一方面，縱切面處創(chuàng)面較大，胚珠外露能夠更好地吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，易刺激愈傷組織形成。子房發(fā)育時(shí)期對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織也有重要影響，開(kāi)花當(dāng)天的子房是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳材料，此時(shí)油茶子房發(fā)育處于7 細(xì)胞8 核成熟胚囊階段[29-30]。Sorntip 等[31]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，選用開(kāi)花當(dāng)天的黃瓜子房進(jìn)行離體培養(yǎng)，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。對(duì)外植體進(jìn)行預(yù)處理是單倍體育種中經(jīng)常使用的方法，預(yù)處理可改變外植體細(xì)胞的生理生化狀態(tài)、細(xì)胞分裂方式或細(xì)胞發(fā)育狀態(tài)，從而影響愈傷組織的誘導(dǎo)率[32]。王文英等[33]的研究結(jié)果表明，低溫通過(guò)改變雌配子體的發(fā)育途徑，促進(jìn)單倍體胚的形成，熱激處理也會(huì)促進(jìn)愈傷組織和胚狀體的形成。Golabadi 等[34]認(rèn)為熱激預(yù)處理顯著提高了愈傷組織的誘導(dǎo)率。在試驗(yàn)中，經(jīng)熱激（35 ℃）預(yù)處理1 d 的油茶子房的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，但與空白對(duì)照組無(wú)顯著差異。低溫預(yù)處理雖顯著降低了子房褐化率，但也降低了愈傷組織誘導(dǎo)率，這可能是由于油茶花期在10 月下旬—12 月初[35]，適宜的溫度為10 ～15 ℃，冷處理抑制了酚類(lèi)物質(zhì)的生成，降低了褐化率。而熱激預(yù)處理破壞了其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，不能顯著提高愈傷組織的誘導(dǎo)率。

通過(guò)對(duì)油茶未授粉子房的消毒方式和愈傷組織誘導(dǎo)的影響因素進(jìn)行探索分析，初步得出子房最佳消毒方式，發(fā)現(xiàn)激素是影響愈傷組織誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素且TDZ 的影響大于NAA，另外篩選出了愈傷組織誘導(dǎo)率較高的子房發(fā)育時(shí)期、切割方式、預(yù)處理方式等培養(yǎng)條件。但本研究中涉及的影響因素不夠全面，后續(xù)將選取更多可能影響愈傷組織誘導(dǎo)率的因素進(jìn)行試驗(yàn)，并探索因素間的相互作用，篩選子房愈傷組織誘導(dǎo)的最適條件，為建立油茶離體雌核單倍體誘導(dǎo)體系提供參考。