劉曉曉，潘玉朋，劉 策，丁圓圓，王曦奧，程智慧，孟煥文

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

黃瓜(CucumissativusL.，2n=2x=14)是葫蘆科1年生蔓性草本植物，起源于印度西北部喜馬拉雅山脈南麓[1]，在我國(guó)已有2 000多年的栽培史[2]。黃瓜是世界十大蔬菜之一[3]，不僅在我國(guó)蔬菜產(chǎn)業(yè)中占據(jù)重要地位，在全球范圍的消費(fèi)需求和栽培面積也位居前列。黃瓜果型包括果實(shí)大小和形狀，由于消費(fèi)習(xí)慣或加工需求的不同，不同果型的黃瓜被不同的消費(fèi)市場(chǎng)所青睞，故果型是黃瓜遺傳改良育種的重要品質(zhì)和產(chǎn)量性狀。

黃瓜果型在其子房期即表現(xiàn)出豐富的多樣性，不同黃瓜種質(zhì)間的果型差異極大，如果實(shí)小且呈卵圓形的野生種質(zhì)、果實(shí)形態(tài)各異的半野生種質(zhì)，以及適于不同消費(fèi)類型的栽培品種。果型由細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞大小共同決定[4]。每個(gè)細(xì)胞都是激素活動(dòng)的產(chǎn)物，所有的活細(xì)胞都對(duì)激素的作用有響應(yīng)[5]，已有研究表明，植物內(nèi)源激素參與了細(xì)胞分裂和細(xì)胞膨大的調(diào)控，與果實(shí)發(fā)育有著密切的關(guān)系[6]。然而，對(duì)黃瓜果型在組織以及內(nèi)源激素水平上的差異內(nèi)因尚不明了。有研究指出，子房期的黃瓜果實(shí)長(zhǎng)度和果形指數(shù)分別與成熟果實(shí)的長(zhǎng)度和果形指數(shù)有極顯著正相關(guān)性，即可用子房期的黃瓜果型來(lái)預(yù)測(cè)黃瓜最終的果型[7]。因此，本研究擬對(duì)不同果型黃瓜的子房進(jìn)行組織學(xué)觀察和內(nèi)源激素含量測(cè)定，從而在組織學(xué)水平和激素水平上揭示黃瓜果型差異的機(jī)制，以期為后續(xù)深入闡明黃瓜果型建成的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以12個(gè)果實(shí)大小和形狀差異較大的黃瓜自交系作為試驗(yàn)材料(表1，圖1)，材料均由威斯康辛大學(xué)Weng Yiqun教授提供。

表1 供試黃瓜材料信息Table 1 Information of tested cucumbers

于2019年春季種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝場(chǎng)的塑料拱棚中，生長(zhǎng)期間進(jìn)行常規(guī)管理。進(jìn)入開(kāi)花期后，于每天上午09:00-11:00，在主蔓10～15節(jié)取開(kāi)花當(dāng)天(開(kāi)花的第1天)的雌花子房用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖中各材料信息與表1同。下圖同The material information is the same as Table 1,the same below圖1 不同果型黃瓜開(kāi)花當(dāng)天的子房Fig.1 Cucumber ovaries with different fruit sizes and shapes at anthesis

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 子房形態(tài)學(xué)指標(biāo)測(cè)定 采集開(kāi)花當(dāng)天的子房，測(cè)量子房長(zhǎng)度、子房橫徑和種腔橫徑，計(jì)算子房形狀指數(shù)(子房形狀指數(shù)=子房長(zhǎng)度/子房橫徑)，測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)參照李錫香[8]的方法，每個(gè)自交系測(cè)量6個(gè)子房，結(jié)果取平均值。

1.2.2 子房細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞面積測(cè)定 采集開(kāi)花當(dāng)天的子房，每個(gè)自交系采集6個(gè)子房，其中3個(gè)用作縱切面觀察，另外3個(gè)用作橫切面觀察，用銳刀切取子房中部并立即放入FAA固定液(V(體積分?jǐn)?shù)70%酒精)∶V(甲醛)∶V(乙酸)=90∶5∶5)。石蠟切片的制作參照李正理[9]的方法，通過(guò)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、旋轉(zhuǎn)切片機(jī)切片(Leica RT2235)、脫蠟、甲苯胺藍(lán)染色等步驟，于Olympus BX51顯微鏡下觀察并拍照。每個(gè)樣本隨機(jī)選擇3個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)視野中所有細(xì)胞數(shù)目N和細(xì)胞總面積S，子房橫切面面積S′=總橫切面面積-橫切面種腔面積(以圓的面積公式計(jì)算)，子房縱切面面積S′=總縱切面面積-縱切面種腔面積(以長(zhǎng)方形的面積公式計(jì)算)，子房縱、橫切面的細(xì)胞數(shù)目N′計(jì)算公式為：N′=NS′/S，平均細(xì)胞面積為：A=S/N，最后取平均值。在每樣本的中果皮部位選取500 μm×500 μm區(qū)域，對(duì)該區(qū)域的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，即為細(xì)胞密度，最后取平均值。細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞面積統(tǒng)計(jì)應(yīng)用Fiji軟件(https://imagej.net/Fiji)完成。

1.2.3 子房?jī)?nèi)源激素含量測(cè)定 采集開(kāi)花當(dāng)天的子房，摘取3～5個(gè)子房作為1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)自交系設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，采摘后立即放入液氮速凍并放置于-80 ℃冰箱保存。內(nèi)源激素生長(zhǎng)素(IAA)、玉米素(ZT)、反式玉米素核苷(tZR)、赤霉素(GA3)、脫落酸(ABA)和茉莉酸(JA)的提取參照Pan等[10]的方法，將3～5個(gè)子房混合，全部用液氮研磨后稱取2 g樣品，然后加入20 mL提取劑(V(異丙醇)∶V(水)∶V(濃鹽酸)=2∶1∶0.002)，-20 ℃預(yù)冷，樣品與提取劑保持比例為1∶10(g/mL))，-20 ℃避光保存16 h；離心(4 ℃，10 000 r/min，15 min)后取全部上清，向裝有上清的離心管中加入30 mL二氯甲烷(V(提取劑)∶V(二氯甲烷)=1∶1.5)，搖床振蕩1 h(4 ℃，130 r/min)，離心(4 ℃，10 000 r/min，15 min)取出全部下相倒入蒸餾瓶中；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮(38 ℃，55 r/min)，樣品蒸干后，用1 mL色譜級(jí)甲醇溶解瓶?jī)?nèi)物質(zhì)，0.22 μm有機(jī)過(guò)濾頭過(guò)濾，最后用液質(zhì)聯(lián)用儀LC-MS/MS(QTRAP 5500,AB Sciex)測(cè)定。由于AM66、SWCC8和XSBN3未達(dá)到檢測(cè)要求，所以只測(cè)了其他9個(gè)自交系的內(nèi)源激素。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理和作圖均在R軟件包(Version 3.6.3，https://www.r-project.org)中進(jìn)行。相關(guān)性分析通過(guò)計(jì)算皮爾森相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation coefficient)完成(https://cran.r-project.org/web/packages/psych/)，多個(gè)自交系之間利用Tukey’s test進(jìn)行重復(fù)間的差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同果型黃瓜子房的形態(tài)學(xué)分析

由圖2可見(jiàn)，不同果型黃瓜開(kāi)花當(dāng)天的子房大小和形狀不同，一些自交系間的子房形態(tài)存在顯著差異，其中WI7237子房最長(zhǎng)，子房形狀指數(shù)最大；而AM66、XSBN3、WI7120、True Lemon和WI7200的子房較短，子房果形指數(shù)較小。XSBN3、True Lemon和WI7204的子房橫徑較粗；XSBN3的種腔橫徑最大，True Lemon和WI7204次之。不同果型黃瓜自交系之間子房長(zhǎng)度的長(zhǎng)短規(guī)律與子房形狀指數(shù)基本一致，而子房橫徑與種腔橫徑的規(guī)律則相一致。

通過(guò)對(duì)子房大小性狀進(jìn)行相關(guān)分析，計(jì)算各性狀間的皮爾森相關(guān)系數(shù)，結(jié)果表明，子房形狀指數(shù)與子房長(zhǎng)度極顯著正相關(guān)(0.953 1，P<0.001)，與子房橫徑顯著負(fù)相關(guān)(-0.416 1，P<0.05)，說(shuō)明二者均對(duì)黃瓜的果型形成具有重要作用。種腔橫徑與子房橫徑極顯著正相關(guān)(0.891 1，P<0.001)，說(shuō)明種腔橫徑對(duì)子房橫徑有重要影響。

圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，下圖同Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05),the same below圖2 不同果型黃瓜開(kāi)花當(dāng)天的子房形態(tài)指標(biāo)Fig.2 Morphological index of cucumber ovaries with different fruit sizes and shapes at anthesis

2.2 不同果型黃瓜子房的組織學(xué)分析

對(duì)不同果型黃瓜開(kāi)花當(dāng)天子房縱切面和橫切面的觀察結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。

圖3 不同果型黃瓜開(kāi)花當(dāng)天子房縱切面細(xì)胞(標(biāo)尺=100 μm)Fig.3 Cell in longitudinal section of cucumber ovaries with different fruit sizes and shapes at anthesis (bar=100 μm)

對(duì)不同果型黃瓜開(kāi)花當(dāng)天子房縱切面(圖3)和橫切面(圖4)的細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞面積、細(xì)胞密度進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，子房較長(zhǎng)的NZ1、9930的縱切面細(xì)胞數(shù)目較多，子房較短的AM66、XSBN3、WI7120、True Lemon和WI7200的縱切面細(xì)胞數(shù)目較少(圖5-A)；XSBN3、True Lemon和SWCC8的橫切面細(xì)胞數(shù)目較多，AM66的橫切面細(xì)胞數(shù)目最少，其他自交系間均無(wú)明顯差異(圖5-B)。WI7204和AM66的縱、橫切面細(xì)胞面積均較大，Gy14的縱切面細(xì)胞面積較小，WI7120和SWCC8的橫切面細(xì)胞面積較小(圖5-C，D)。XSBN3的縱切面細(xì)胞密度較大，NZ1的較??；WI7120的橫切面細(xì)胞密度較大，WI7204的較小(圖5-E，F(xiàn))。綜合上述結(jié)果可知，不同果型黃瓜自交系之間子房縱切面細(xì)胞數(shù)目的變化規(guī)律與子房長(zhǎng)度大致相同，子房橫切面細(xì)胞數(shù)目的多少則與子房橫徑變化規(guī)律相似。

圖4 不同果型黃瓜開(kāi)花當(dāng)天子房橫切面細(xì)胞(標(biāo)尺=100 μm)Fig.4 Cell in cross section of cucumber ovaries with different fruit sizes and shapes at anthesis (bar=100 μm)

由表2可知，不同果型黃瓜開(kāi)花當(dāng)天子房長(zhǎng)度與橫徑無(wú)顯著相關(guān)性，子房縱切面細(xì)胞數(shù)目與橫切面細(xì)胞數(shù)目無(wú)顯著相關(guān)性，而子房縱切面細(xì)胞面積和橫切面細(xì)胞面積有極顯著正相關(guān)性。不同果型黃瓜開(kāi)花當(dāng)天子房縱切面細(xì)胞數(shù)目分別與子房長(zhǎng)度和子房形狀指數(shù)有極顯著正相關(guān)性，子房橫切面細(xì)胞數(shù)目分別與子房橫徑和子房形狀指數(shù)有極顯著正相關(guān)性和顯著負(fù)相關(guān)性；而子房縱切面細(xì)胞面積和細(xì)胞密度與子房長(zhǎng)度及子房形狀指數(shù)均無(wú)顯著相關(guān)性，子房橫切面細(xì)胞面積和細(xì)胞密度與子房橫徑及子房形狀指數(shù)均無(wú)顯著相關(guān)性。以上結(jié)果顯示，不同果型黃瓜子房長(zhǎng)度和橫徑的差異主要是由細(xì)胞數(shù)目差異引起的，且子房長(zhǎng)度和橫徑與子房形狀指數(shù)顯著相關(guān)，說(shuō)明黃瓜果型的差異主要是由細(xì)胞數(shù)目不同所致。

表2 不同果型黃瓜開(kāi)花當(dāng)天子房大小與細(xì)胞數(shù)目、面積和密度間的相關(guān)性Table 2 Correlation among ovary size and cell number,area and density in cucumbers with different fruit sizes and shapes at anthesis

2.3 不同果型黃瓜子房的內(nèi)源激素含量比較

由表3可見(jiàn)，不同果型黃瓜開(kāi)花當(dāng)天子房中，WI7237的IAA含量較高，True Lemon較少，其他自交系間均無(wú)顯著差異；9930和WI7204的ZT含量較高，WI7120和WI7200較少，其他自交系間均無(wú)顯著差異；WI7200的tZR含量較高，WI7123和9930較少，其他自交系間均無(wú)顯著差異；WI7120的GA3含量最高，總體表現(xiàn)為子房較長(zhǎng)的自交系GA3含量較低，子房較短的自交系含量較高；WI7120的ABA含量最高，WI7200最低，其他自交系間無(wú)顯著差異；9930的JA含量較高，True Lemon、WI7200和WI7237較低，其他自交系間無(wú)顯著差異。

表3 不同果型黃瓜開(kāi)花當(dāng)天子房?jī)?nèi)源激素含量的比較Table 3 Comparison of endogenous hormone content of cucumber ovaries with different fruit sizes and shapes at anthesis ng/g

由表4可知，不同果型黃瓜自交系中，IAA含量與子房長(zhǎng)度和子房形狀指數(shù)有極顯著正相關(guān)性，與子房橫徑有極顯著負(fù)相關(guān)性，說(shuō)明IAA可能通過(guò)促進(jìn)子房伸長(zhǎng)，抑制子房橫向增長(zhǎng)而影響黃瓜果型的形成。ZT含量與子房橫徑有顯著正相關(guān)性，說(shuō)明ZT對(duì)子房橫徑的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用；ZT含量與子房橫切面細(xì)胞面積有極顯著正相關(guān)性，而與橫切面細(xì)胞密度有顯著負(fù)相關(guān)性，說(shuō)明ZT可能通過(guò)促進(jìn)子房橫切面細(xì)胞面積增大而促進(jìn)子房橫徑生長(zhǎng)。tZR含量與子房橫徑和子房橫切面細(xì)胞數(shù)目有顯著負(fù)相關(guān)性，說(shuō)明tZR可能通過(guò)抑制橫切面細(xì)胞分裂影響子房橫徑大小。GA3含量與子房長(zhǎng)度、子房形狀指數(shù)和子房縱切面細(xì)胞數(shù)目均有極顯著負(fù)相關(guān)性，說(shuō)明GA3可能通過(guò)抑制縱切面細(xì)胞分裂影響子房長(zhǎng)度和子房形狀指數(shù)。ABA和JA含量總體而言對(duì)子房相關(guān)指標(biāo)影響不大。

表4 不同果型黃瓜開(kāi)花當(dāng)天子房大小和細(xì)胞相關(guān)性狀與內(nèi)源激素含量的相關(guān)性Table 4 Correlation among ovary size and cell traits and endogenous hormone content in cucumbers with different fruit sizes and shapes at anthesis

3 討 論

果實(shí)最終大小取決于花前因素和果實(shí)的早期生長(zhǎng)[11]，可以根據(jù)子房期的果型預(yù)測(cè)黃瓜成熟果實(shí)的果型[7]。本研究通過(guò)比較不同果型黃瓜子房縱、橫切面的細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞面積和細(xì)胞密度，在組織學(xué)水平上揭示了黃瓜果型差異的原因。前人的研究表明，不同品種間果實(shí)大小主要是由細(xì)胞數(shù)目而不是細(xì)胞大小決定的，例如甜瓜[12]、甜櫻桃[13]、桃[14]和梨[15]等作物。本研究結(jié)果與上述結(jié)果基本相同，但上述研究?jī)H比較了果實(shí)縱切面或橫切面細(xì)胞，本研究則同時(shí)對(duì)縱切面和橫切面細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)縱、橫切面細(xì)胞數(shù)目分別與子房長(zhǎng)度和橫徑有極顯著相關(guān)性，子房縱橫切面細(xì)胞面積和細(xì)胞密度與子房長(zhǎng)度或子房橫徑及子房形狀指數(shù)均無(wú)顯著相關(guān)性，說(shuō)明子房長(zhǎng)度和橫徑的差異是由細(xì)胞數(shù)目的差異引起的，且子房長(zhǎng)度和橫徑均與子房形狀指數(shù)顯著相關(guān)，進(jìn)一步表明黃瓜果型差異主要是由細(xì)胞數(shù)目決定的。但對(duì)于子房橫徑而言，種腔橫徑與子房橫徑之間有極顯著正相關(guān)性，說(shuō)明除子房橫切面細(xì)胞數(shù)目外，種腔橫徑也對(duì)黃瓜子房橫徑有一定作用，從而影響黃瓜的果型。

IAA是參與調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要激素，影響細(xì)胞的擴(kuò)增和分裂、細(xì)胞的伸長(zhǎng)和分化以及多種生理反應(yīng)，從而影響植物細(xì)胞和組織的形狀和功能[16-18]。有研究表明，一定濃度的IAA對(duì)黃瓜果實(shí)有顯著促進(jìn)作用[19]。本研究中IAA含量與子房長(zhǎng)度有極顯著正相關(guān)性，子房期的黃瓜果實(shí)處于果實(shí)發(fā)育的早期階段，為細(xì)胞分裂的旺盛期，不同自交系縱切面細(xì)胞數(shù)目的大小順序與子房長(zhǎng)度相似，然而縱切面細(xì)胞面積除WI7204與AM66較大外，其余自交系之間無(wú)顯著差異，說(shuō)明IAA可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞分裂來(lái)促進(jìn)黃瓜子房的伸長(zhǎng)。IAA含量與子房橫徑和橫切面細(xì)胞數(shù)目均有極顯著負(fù)相關(guān)性，說(shuō)明IAA主要促進(jìn)黃瓜子房縱向伸長(zhǎng)，并在一定程度上通過(guò)阻礙子房橫向細(xì)胞的分裂來(lái)抑制黃瓜子房橫向生長(zhǎng)。ZT可以促進(jìn)細(xì)胞分裂，ZT含量與子房縱切面細(xì)胞數(shù)目有顯著正相關(guān)性，表明ZT可以促進(jìn)黃瓜子房縱切面細(xì)胞分裂；ZT也可以促使細(xì)胞體積擴(kuò)大，它的主要作用是使細(xì)胞橫向擴(kuò)大，而不是縱向伸長(zhǎng)[20]。本研究中ZT含量與子房橫徑有顯著相關(guān)性，與子房橫切面細(xì)胞面積和細(xì)胞密度分別有極顯著正相關(guān)性和顯著負(fù)相關(guān)性，說(shuō)明ZT主要通過(guò)增加子房橫向細(xì)胞面積促進(jìn)黃瓜子房橫向增長(zhǎng)。tZR含量與子房橫徑和子房橫切面細(xì)胞數(shù)目均有顯著負(fù)相關(guān)性，表明tZR對(duì)子房橫向細(xì)胞分裂可能有抑制作用。GA3與IAA在促進(jìn)細(xì)胞分裂和細(xì)胞伸長(zhǎng)方面具有重要功能[21]，但GA3是促進(jìn)生長(zhǎng)還是抑制生長(zhǎng)(尤其是黃瓜果實(shí))與其濃度有著極為密切的關(guān)系，低濃度時(shí)抑制生長(zhǎng)，而高濃度時(shí)則表現(xiàn)為促進(jìn)生長(zhǎng)，而且其對(duì)瓜條縱向生長(zhǎng)的促進(jìn)作用遠(yuǎn)大于橫向[19]。本研究中GA3含量與子房長(zhǎng)度、子房形狀指數(shù)和子房縱切面細(xì)胞數(shù)目均有極顯著負(fù)相關(guān)性，表明GA3可能通過(guò)抑制縱切面細(xì)胞分裂影響子房長(zhǎng)度。有研究發(fā)現(xiàn)，在黃瓜子房期中,CsSUN和CsLNG1抑制細(xì)胞膨脹相關(guān)基因的表達(dá)并減小GA3/ABA值，可使細(xì)胞相比其他材料變小，細(xì)胞密度相對(duì)變大，導(dǎo)致子房相對(duì)變大[22]。綜上分析認(rèn)為，IAA、ZT、tZR、GA3的含量均與黃瓜子房大小和形狀有關(guān)。