張 暉，吳雪輝，董 斌，李榮喜，黃永芳

（1. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學院，廣東 廣州 510225；2. 華南農(nóng)業(yè)大學，廣東 廣州 510642；3. 廣東省油茶工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642；4. 廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學院，廣東 廣州 510507）

油茶Camellia oleifera屬于山茶科植物，為常綠小喬木，被國家列為大宗油料作物，與油棕、油橄欖和椰子樹并稱世界四大木本食用油料植物，油茶籽油不飽和脂肪酸高達90%，且含多種保健性成分。近年來，油茶在種植面積、產(chǎn)油量、產(chǎn)值上均逐年穩(wěn)步提高，我國現(xiàn)有油茶種植面積已達到453.33 萬hm2，力爭到2025 年油茶種植面積達到600 萬hm2[1]。在南方，油茶產(chǎn)業(yè)逐漸成為加快農(nóng)村經(jīng)濟結(jié)構(gòu)調(diào)整的特色產(chǎn)業(yè)，是脫貧攻堅和鄉(xiāng)村振興的支柱產(chǎn)業(yè)[2]

油茶籽油作為食用油占比超過1%，產(chǎn)量的提升使得油茶籽粕量也隨之增加。油茶果去殼壓榨除油后剩下的油茶粕，其中含有約10%～20%的蛋白質(zhì)，10%～12%的茶皂素，6%～10%的油酸；其中蛋白質(zhì)、碳水化合物、粗纖維總量可達75%[3]。油茶粕加工利用主要體現(xiàn)在蛋白質(zhì)提取與利用[4]、多糖提取[5]、多酚的應用研究[6-7]等方面，蛋白質(zhì)的提取可作為反芻動物類的飼料蛋白[8]，油茶粕多糖具有抗氧化、降血糖、提高免疫活性等多種生物學功能[9-10]；同時利用油茶粕為原料，制備可食性保鮮膜也成為新的開發(fā)方向[11]。目前為止，油茶餅粕的利用以茶皂素的提取和研究較為廣泛，因其可直接應用于日化等高附加值產(chǎn)品[12]。

我國每年油茶粕產(chǎn)量達到5.0×105t，對于提取茶皂素后的油茶粕在過往或作廢棄處理或是用作有機肥[12]，本團隊對毛霉Mucor roxianus、哈茨木霉Trichoderma harzianum和黑曲霉Aspergillus Niger3 種霉菌在油茶餅粕固態(tài)發(fā)酵的作用已做了相關(guān)研究[15-16]，關(guān)于油茶粕有機肥的有效利用以及發(fā)酵過程中養(yǎng)分變化及微生物群落的構(gòu)成卻一直未有研究。因此，本試驗通過分析不同比例油茶餅粕在自然環(huán)境發(fā)酵過程中的變化，比較養(yǎng)分變化與細菌微生物組成，為更好地科學利用和開發(fā)茶粕有機肥提供相關(guān)參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 油茶餅粕

試驗用的油茶餅粕購于廣東新大地生物科技有限公司，是未脫茶皂素的餅粕。

1.1.2 油茶餅粕去茶皂素處理

通過水提法脫去茶皂素的油茶餅粕。水提法是將油茶餅粕浸泡在pH=10，固液比1∶10 的80 ℃熱水中，12 h 后進行脫水，60 ℃烘干備用[17]。

1.2 方法

1.2.1 不同比例油茶餅粕配制

將已烘干的脫茶皂素油茶餅粕與黃心土分別用粉碎機碾碎，過200 目篩。按比例配制成含有油茶餅粕0%、5%、10%、20% 和100%的茶粕樣品，稱取50 g 混合樣品裝進無紡布袋（7 cm×9 cm），并用繩子系緊封口，每個處理3 重復。

1.2.2 油茶餅粕發(fā)酵處理

試驗選址于仲愷農(nóng)業(yè)工程學院農(nóng)場內(nèi)地毯草坪地進行，在去除表面植物后，挖深度為10 cm，長寬分別為15 cm×8 cm 的坑槽，然后將茶粕袋平放于坑槽中，每袋茶粕放置于1 個坑槽，然后將原土回填覆蓋還原，每天往試驗地澆水保濕，在試驗進行的第1、2、4、8 和12 周分別取樣，測定全氮、有機質(zhì)、腐殖酸含量。

1.2.3 細菌16S rRNA 基因高通量測序

采用CTAB 法對樣本的基因組DNA 進行提取，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度，取適量樣品DNA 于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA 為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用特異引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGA CTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，對16S rRNA 基因的V3 ～V4 高變區(qū)片段進行PCR 擴增。

PCR 反應體系：2×Phusion Master Mix 15 μL，正、反向引物（2 μmol/L）各3 μL，基因組DNA（1 ng/μL）7 μL，ddH2O 2 μL。PCR 反應條件：

98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。使用2%的瓊脂糖凝膠對PCR 產(chǎn)物進行電泳檢測。根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用1×TAE 質(zhì)量百分濃度為2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR 產(chǎn)物，回收目標條帶。使用MiSeq/Hiseq 平臺對16S rDNA 的一個或多個高變區(qū)進行雙末端（paired-end）測序。

1.2.4 細菌多樣性分析

使用Cutadapt 軟件對Reads 進行過濾，按Barcode 拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode 和引物序列，去除嵌合體序列[18]，得到最終有效數(shù)據(jù)。使用Uparse 軟件[19]對序列進行聚類，默認以97%的一致性將序列聚類成為操作分類單元（Operational taxonomic unit，OTU）。根據(jù)OTU聚類結(jié)果，利用SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫[20]對每個OTU的代表序列進行物種注釋，獲得分類學信息和各樣本在各分類水平上的群落組。同時，使用QIIME V1.9.1 軟件進行OTU 豐度與多樣性指數(shù)計算，得到樣品內(nèi)物種豐富度信息，并基于KEGG對其代謝功能進行預測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0 軟件進行One-way ANOVA 單因素方差分析，采用WPS 2021 軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用SigmaPlot 軟件進行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶餅粕在自然發(fā)酵過程中相關(guān)養(yǎng)分變化

不同比例油茶餅粕在土壤自然發(fā)酵過程中全氮變化如圖1 所示。由圖1 可見，不同比例的油茶餅粕全氮隨著時間的推移變化不明顯，其中茶粕含量20%時在1 周后出現(xiàn)明顯的下降，與試驗前的初始含量差異性顯著，隨后的含量保持在0.24%～0.25%范圍內(nèi)，差異性不顯著。即使是在100%茶粕的處理中，其總氮含量雖然在1.28%～1.29%范圍內(nèi)波動，但各時間段之間的差異性并不顯著，總體上保持平穩(wěn)。而在0%處理中，全氮總量出現(xiàn)明顯的變化，在12 周時，全氮含量顯著低于試驗初始值。從表1 同一時間不同處理全氮的差異性分析結(jié)果來看，添加5%茶粕與未添加茶粕的處理在第1、2 和4 周時差異性不顯著，而5%與10%的全氮含量在第1 和第2 周時差異性顯著，但第4 和第8 周時差異性不顯著，在第12 周時差異性顯著。

圖1 不同比例油茶餅粕在土壤自然發(fā)酵過程中全氮變化Fig. 1 Changes of total nitrogen in different ratio of oilcake during natural fermentation in soil

表1 同一時間不同處理差異性分析Table 1 Difference analysis of different treatments at the same time

不同比例油茶餅粕在土壤自然發(fā)酵過程中有機質(zhì)變化情況如圖2 所示。由圖2 可見，不同比例油茶餅粕在自然發(fā)酵過程中有機質(zhì)呈現(xiàn)出明顯的變化，經(jīng)過12 周的發(fā)酵過程，0%、5%、10%、20%處理的有機質(zhì)含量均明顯下降，較初始含量分別下降了44%、40%、21%、41%，而100%處理中的有機質(zhì)降幅最小，只有3%。從表1 同一時間不同處理有機質(zhì)含量分析可見，添加茶粕后，即使在最低設計含量5%時，其有機質(zhì)含量與未添加茶粕的處理相比，除在第4 周時兩者之間差異性不顯著外，其余各處理差異性均顯著高于未添加茶粕處理，而隨著茶粕含量的增加，各處理之間的差異性顯著。

圖2 不同比例油茶餅粕在土壤自然發(fā)酵過程中有機質(zhì)變化Fig 2 Changes of organic matter in different ratio of oil cake during natural fermentation in soil

不同比例油茶餅粕在土壤自然發(fā)酵過程中碳氮比變化如圖3 所示。從油茶餅粕在土壤中自然發(fā)酵過程中C/N 比變化（圖3）可見，在0%處理中，其C/N 變化波動相對較大，C/N 變化范圍在19.7 ～48.4 之間，并于試驗第1 周和第4 周分別達到最低值和最高值，兩者差異性顯著。5%、20%和100%處理的C/N 均于試驗第1 周和第2 周達到最高值，分別為34.3、35.1 和32.3，隨后呈下降趨勢。在第12 周，含有茶粕的處理組其C/N 介于24.5 ～38.6區(qū)間，其中10%處理組C/N 最高，為38.6。

圖3 不同比例油茶餅粕在土壤自然發(fā)酵過程中碳氮比變化Fig 3 Changes of carbon-nitrogen ratio in different ratio of oil-cake during natural fermentation in soil

純油茶餅粕在土壤自然發(fā)酵過程中腐殖酸變化如圖4 所示。由圖4 可見，100%處理組的腐殖酸變化呈現(xiàn)先升后降的趨勢，于第1 周時達到最高值26%，顯著高于其他時間段腐殖酸含量，之后腐殖酸含量開始下降，并且茶粕在試驗第4 周時已經(jīng)下降到14%，于第8 周時腐殖酸含量最小，為12%，但與第4 周和第12 周腐殖酸相比差異性不顯著，總體變化相對平穩(wěn)。

圖4 純油茶餅粕在土壤自然發(fā)酵過程中腐殖酸變化Fig 4 Changes of humic acid in different ratio of oil-cake during natural fermentation in soil

2.2 油茶餅粕在自然發(fā)酵過程中微生物群落組成變化

試驗原料微生物門層級相對豐度如表3 所示。對比分析試驗原料中的細菌微生物群落（表2），3 種原料的主要組成為變形菌門，其中配置用土的變形菌門相對豐度占95.8%，分別比試驗場地和茶粕原料中的變形菌門相對豐度高2.6 和2.5 倍。試驗場地土壤和茶粕原料的微生物門層級組成相似，在所統(tǒng)計的10 個門級，分別占兩試驗原料相對豐度的83.1%和82.8%，二者主要差異在放線菌門、綠彎菌門和泉古菌門，前者相對豐度分別為后者的3、2 和0.44 倍。

表2 試驗原料微生物門層級相對豐度Table 2 Relative abundance of microbe phylum level of materials

門層級各處理微生物群落相對豐度如圖5 所示。由圖5 可見，在試驗第4 周，各處理間的門水平的微生物組成發(fā)生了不同程度變化，其中茶粕含量為0%的處理組，其主要組成為變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門，相對豐度分別為54.7%、26%和10.9%，而處理前這3 個門級的相對豐度分別為95.8%、2.3%、1.5%（表1）。各處理組的主要組成為變形菌門，相對豐度最高的為5%的處理組，其變形菌門相對豐度為85.8%，其次為0%、10%、20%和100%處理組，呈現(xiàn)先高后低偏趨緩的趨勢。隨著變形菌門相對豐度的降低，其他菌門的相對豐度都有不同程度的提高。5%、10%和20%中厚壁菌門的相對豐度低于0%和100%處理組，前三個處理組分別為5.8%、1%和0.6%，后兩者的分別為26%和13.1%。擬桿菌門的相對豐度隨著茶粕含量的升高呈現(xiàn)出增加的趨勢，5%、10%、20%和100%的相對豐度分別為4.70%、12.50%、17.90%、35.00%。疣微菌門相對豐度則呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，其在20%處理組中相對豐度由17.2%降到100%處理組中的5.4%。酸桿菌門雖然在5%、10%、20%處理組有1.70%、8.10%、9.10%的相對豐度，但是在100%處理組并未檢測到。

圖5 門層級各處理微生物群落相對豐度Fig. 5 Relative abundance of microbe phylum level in treatments

各處理組微生物科層級OTUs 數(shù)量比較如圖6所示。從科水平OTUs 數(shù)量（圖6）來看，隨著茶粕含量的增加，科水平的OTUs 數(shù)量呈現(xiàn)先升再降的趨勢，5%處理OTUs 數(shù)為80，10%和20%的OTUs 數(shù)分別為231 和227，但到100%處理組則為150。試驗場地OTU 數(shù)量分別為385，說明即使經(jīng)過4 周的自然處理，各處理組中的OTU 數(shù)量與試驗地的背景值仍有差異。各處理組微生物群落多樣性比較如圖7 所示。由圖7 可見，其結(jié)果與細菌微生物群落多樣性一致。

圖6 各處理組微生物科層級OTUs 數(shù)量比較Fig. 6 Comparison of OTUs in family level of treaments

圖7 各處理組微生物群落香農(nóng)指數(shù)（a）、Chao1指數(shù)（b）和Observedspecies指數(shù)（c）比較Fig. 7 Comparison of bacterial community of Shannon index, Chao1 index and Observed species index in treatments

各處理組在共同科層級的細菌相對豐度如表3 所示。從4 個含有茶粕的處理組的細菌微生物科層級結(jié)果（表3）可見，在相對豐度大于1%的共有科中，噬幾丁質(zhì)菌科、鞘脂單胞科、黃單胞菌科的相對豐度均較高，在100%茶粕組中，其相對豐度分別為10.96%、8.32%和7.61%。在5%處理組中，鞘脂單胞菌科的相對豐度達到71%。

表3 各處理組在共同科層級的細菌相對豐度Table 3 Relative abundance of common microbe in family level of each treatment

微生物COG 功能預測如表4 所示。從樣品中的COG 功能預測（表4）可見，處理間的蛋白功能基本相似，其功能可以分為3 個層次，第一層級為氨基酸的運輸和代謝、轉(zhuǎn)錄、碳水化合物運輸和代謝、細胞壁/膜信號轉(zhuǎn)導機制，各功能占的比例在6%～8%之間。第二層級為能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換、翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生、無機離子轉(zhuǎn)運與代謝、復制、重組和修復，輔酶運輸與代謝，各功能占的比例在4%～6%之間；第三層級：其它，各功能占的比例低于4%。

表4 微生物COG功能預測Table 4 COG function prediction

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

不同比例油茶餅粕在自然發(fā)酵過程中有機質(zhì)含量呈下降趨勢，在未有添加油茶餅粕的0%處理組，其C/N 變化波動相對較大，變幅相差29%，并于試驗第1 周和第4 周分別達到最低值和最高值。5%、20%和100%處理組的C/N 均于試驗第1 周和第2 周達到最高值，隨后整體趨降并穩(wěn)定，于第12 周，整體的C/N 介于24.5 ～38.6 區(qū)間。

100%處理組的腐殖酸變化呈現(xiàn)先升后降，時間的拐點出現(xiàn)于第1 周，腐殖酸含量達到最高值的26%，顯著高于其他時間段腐殖酸含量，之后腐殖酸含量開始下降，在第4 周時已經(jīng)下降到14%，到第12 周時已保持相對平穩(wěn)，腐殖酸含量維持在14%。

茶粕發(fā)酵過程中細菌組成主要為變形菌門，茶粕含量5%的處理中，其變形菌門相對豐度達到85.8%。細菌群落組成的多樣性與茶粕含量有一定的相關(guān)性，在10%和20%處理組的科層級的OTUs 數(shù)量為231 和227，而100%則為150。從細菌微生物科水平結(jié)果來看，茶粕在試驗過程中主要集中在10 個科的細菌微生物組成，并且相對豐度較高的為噬幾丁質(zhì)菌科、鞘脂單胞科、黃單胞菌科。從結(jié)果來看，黃心土土壤中添加茶粕10%～20%較為合適，一方面合適的碳氮比有利于微生物生長，另一方面有機質(zhì)的增加有利于土壤的保水與根系生長。同時，在茶粕含量為20%時的擬桿菌門和酸桿菌門的豐度相對高于10%和5%處理組，總體微生物多樣性也較高。

3.2 討 論

油茶餅粕含有豐富的蛋白質(zhì)、多酚[21]、多糖。這些成分有利于微生物的生長，但是茶皂素存在會對微生物產(chǎn)生抑制作用。研究表明其對黃曲霉[22]、大腸桿菌、桔青霉、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)朊假絲酵母[23]等均呈現(xiàn)抑制作用。前期的研究也顯示在含茶皂素下，不利于油茶餅粕的固態(tài)發(fā)酵[16]。但個別特異的菌種如用黑曲霉、毛霉和117 假絲酵母等，可提高蛋白含量、分解茶粕中的纖維素、半纖維素，以及減少茶皂素及多酚類抗營養(yǎng)物質(zhì)。在其他原料堆肥過程中，個別的優(yōu)勢細菌其相對豐度也會比較高，比如潘夢等[24]發(fā)現(xiàn)豬糞在堆肥過程中微生物的結(jié)構(gòu)組成前位的是變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia），與本試驗中茶粕在自然發(fā)酵過程中變形菌門（Proteobacteria）占的豐富度最高相似。夏金利等[25]在園林廢棄物堆肥研究結(jié)果表明擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）作為優(yōu)勢菌門存在于整個堆肥過程中，擬桿菌門細菌可以降解木質(zhì)纖維素[26]，放線菌門的相對豐度越高越利于有機物的降解[27]。茶粕在自然發(fā)酵過程中，噬幾丁質(zhì)菌科、鞘脂單胞科、黃單胞菌科的相對豐度均處于較高水平，因此，可利用該科屬的細菌應用于餅粕類物質(zhì)的有機肥研究與應用，這也是下一步茶粕有機肥發(fā)酵時可針對性地選用該類優(yōu)勢菌群。綜合來看，本研究存在一定的局限性，試驗可能在其他地方重復時結(jié)果會有差異，與試驗地土壤微生物群落背景有關(guān)，如果試驗地選擇其他區(qū)域或者氣候帶，不同的微生物群落組成對茶粕產(chǎn)生的影響也會有差異。這是野外試驗不確定性造成，而不同發(fā)酵材料在環(huán)境中富集的某類特異性微生物，可作為茶粕發(fā)酵有機把試驗的菌種來源并發(fā)揮發(fā)協(xié)同作用，這種逆向思維方式有助于定向發(fā)掘茶粕有機發(fā)酵的優(yōu)勢種。