郭晶晶，宋曉紅，劉華擎，陳秋蘭，張穎，王潔如

1.北京科興生物制品有限公司，北京 100085；2.島津企業(yè)管理（中國）有限公司，北京 100020

流感病毒裂解疫苗是用WHO 推薦并經(jīng)國家藥品管理部門批準(zhǔn)的流感病毒株接種雞胚，通過培養(yǎng)、收獲，滅活、純化、裂解等步驟制成的生物制品，廣泛應(yīng)用于預(yù)防流感病毒引起的流行性感冒。流感病毒屬正黏病毒科，單股負(fù)鏈RNA 病毒，由核衣殼和包膜組成［1-2］。包膜上嵌有血凝素（hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA），可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和抑制病毒在體內(nèi)擴(kuò)散的保護(hù)性抗體［3-5］。病毒中的類脂和內(nèi)部蛋白等成分易引發(fā)不良反應(yīng)［6］。流感病毒裂解疫苗生產(chǎn)過程中，常使用去氧膽酸鈉、TritonX100、TritenN101、乙醚和聚山梨酯80 等裂解劑，病毒的裂解程度（已裂解病毒占病毒總量的百分?jǐn)?shù)）直接影響疫苗的免疫原性和安全性［6-9］。目前，通用的裂解效果評(píng)價(jià)方法是電鏡觀察法［10］，雖具有可直接觀察病毒顆粒微觀結(jié)構(gòu)和高分辨率的優(yōu)點(diǎn)，但也存在取樣量小和視野選擇受限等問題，導(dǎo)致裂解程度無法定量，結(jié)果不準(zhǔn)確。

聚合物分析系統(tǒng)（Aggregates Sizer）是一種高穩(wěn)定、高靈敏和自動(dòng)化程度高的分析工具，該系統(tǒng)是以半導(dǎo)體激光為光源，依據(jù)光的散射與衍射現(xiàn)象建立數(shù)學(xué)模型，散射與衍射的光能角度只與顆粒粒徑有關(guān)［11］。當(dāng)檢測對(duì)象為顆粒群時(shí)，不同粒徑顆粒的數(shù)量決定了對(duì)應(yīng)各特定角獲得的光能量，各特定角光能量在總光能量中所占比例可反映各顆粒的分布豐度。Aggregates Sizer 可檢測7 nm ～800 μm 范圍粒子的粒徑，且可定量檢測40 nm ～20 μm 范圍內(nèi)生物制藥顆粒物的濃度，并可檢測顆粒物的形成過程及濃度變化［12］。通過建立病毒顆粒分布豐度-裂解程度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，評(píng)價(jià)流感病毒的裂解效果。因此，本研究旨在基于Aggre-gates Sizer 系統(tǒng)建立一種初步評(píng)價(jià)病毒裂解程度的新方法，從而提高流感疫苗病毒裂解程度數(shù)據(jù)的可靠性。

1 材料與方法

1.1標(biāo)準(zhǔn)品 流感病毒裂解疫苗原液A（由裂解液制得，病毒顆粒已裂解）和B（由裂解前純化液制得，病毒顆粒未裂解）均由北京科興生物制品有限公司提供。

1.2主要儀器 Aggregates Sizer 系統(tǒng)［含高濃度池測定裝置SALD-HC75S，樣品量0.125 mL，采集軟件WingSALD bio-7500 for English（US）V3.3］購自廠家島津企業(yè)管理（中國）有限公司北京分公司。

1.3裂解效果評(píng)價(jià)用樣本的制備 分別取流感病毒裂解疫苗原液A 0.6、0.7、0.8、0.9 和1.0 mL 于離心管中，依次加入0.4、0.3、0.2、0.1 及0 mL 的原液B，配制成裂解程度分別為60%、70%、80%、90%和100%的系列工作液。另取60%、80%和100%裂解程度的工作液作為質(zhì)量控制（quality control，QC）樣本。

1.4分析方法 用Aggregates Sizer 系統(tǒng)檢測待測物顆粒粒徑、濃度和分布，光源發(fā)出的光照射到樣品上產(chǎn)生散射衍射光和散射光，WingSALD bio-7500 for English（US）V3.3 軟件采集散射衍射光光強(qiáng)數(shù)據(jù)，并根據(jù)光強(qiáng)數(shù)據(jù)換算得出顆粒粒徑大小和分布數(shù)據(jù)，根據(jù)WingSALD bio-7500 for English（US）V3.3 內(nèi)置曲線，計(jì)算出不同粒徑顆粒的分布豐度。

1.5病毒顆粒粒徑檢測 將原液B 稀釋4 倍，加入至Aggregates Sizer 系統(tǒng)的樣品池中，按1.4 項(xiàng)方法進(jìn)行檢測，得到各粒徑的分布豐度。

1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 取裂解程度為60%、70%、80%、90%和100%的系列工作液，分別加入Aggregates Sizer 系統(tǒng)樣品池中，按1.4 項(xiàng)方法測定，以病毒顆粒累積分布豐度為縱坐標(biāo)，裂解程度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，建立回歸方程，計(jì)算相關(guān)系數(shù)（r2）。

1.7方法的驗(yàn)證 取不同裂解程度的QC 樣本進(jìn)行檢測分析，以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算QC 樣本的裂解程度，重復(fù)3 次，準(zhǔn)確性以相對(duì)誤差（relative error，RE）表示，精密性以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）表示。

1.8數(shù)據(jù)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1病毒顆粒粒徑 在0.04 ～20 μm 粒徑檢測范圍內(nèi)，原液B 中主要分布0.04 ～0.3 μm 粒徑的顆粒，且以約100 nm 粒徑的顆粒居多，見圖1。

圖1 不同粒徑粒子的分布豐度Fig.1 Distribution abundance of particles at different sizes

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 60%、70%、80%、90%和100%裂解程度工作液在0.04 ～20 μm 粒徑檢測范圍內(nèi)，不同粒徑顆粒的分布豐度和累積分布豐度逐漸降低，見圖2。不同裂解程度系列工作液的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3，工作液在60% ～100%裂解程度范圍內(nèi)與病毒顆粒累積分布豐度呈良好線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y= -2 600x+ 2 610，r2為0.995。

圖2 不同裂解程度工作液檢測圖Fig.2 Determination images of working solutions at different lysis degrees

圖3 不同裂解程度系列工作液的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve for working solutions at different lysis degrees

2.3方法的驗(yàn)證 不同裂解程度QC 樣本經(jīng)3 次檢測的RE均＜2%，RSD均＜0.05%，見圖4 和表1。表明該方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密性。

表1 方法準(zhǔn)確性及精密性驗(yàn)證結(jié)果Tab.1 Verification for accuracy and precision of developed method

圖4 QC 樣本檢測圖Fig.4 Determination images of QC samples

3 討 論

本研究采用Aggregates Sizer 系統(tǒng)建立了流感疫苗裂解效果的檢測方法，并初步對(duì)該方法進(jìn)行了驗(yàn)證。檢測結(jié)果表明，流感病毒顆粒主要分布在0.04 ～0.3 μm 范圍內(nèi)，且較集中分布于約100 nm；工作液在60% ～100%裂解程度范圍內(nèi)與病毒顆粒累積分布豐度呈良好線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-2 600x+2 610，r2為0.995；該方法準(zhǔn)確性驗(yàn)證RE均＜2%，精密性驗(yàn)證RSD均＜0.05%，表明準(zhǔn)確度和精密度較高，符合生物樣品分析方法指導(dǎo)原則的要求［13］，可用于病毒裂解疫苗的裂解效果評(píng)價(jià)。

有文獻(xiàn)報(bào)道，流感病毒通常為球形顆粒，粒徑為80 ～120 nm，本文結(jié)果與報(bào)道相符［14］。研究發(fā)現(xiàn)，存在少量的絲狀結(jié)構(gòu)病毒顆粒，可能是由于在0.3 ～0.8 μm 間出現(xiàn)響應(yīng)值的原因，但總體所占比重較少。提示在后續(xù)的方法開發(fā)中應(yīng)主要對(duì)0.04 ～0.3 μm 粒徑顆粒進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并從顆粒結(jié)構(gòu)和團(tuán)聚等多個(gè)角度探究0.3 ～0.8 μm 間出現(xiàn)響應(yīng)值原因，以作出相應(yīng)改進(jìn)措施。研究過程中，對(duì)50%及小于50%裂解程度工作液進(jìn)行檢測，出現(xiàn)多重散射，信號(hào)偏移，造成檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，因此該標(biāo)準(zhǔn)曲線裂解程度的檢測下限為60%（未在正文表述）。

本研究建立了一種基于Aggregates Sizer 系統(tǒng)分析病毒裂解程度的方法，檢測方便快捷，受限少，并可監(jiān)測整個(gè)生產(chǎn)過程中病毒顆粒的粒徑分布及濃度改變，為疫苗行業(yè)中裂解疫苗的病毒裂解效果評(píng)價(jià)提供一個(gè)研究方向。該方法仍處于初步開發(fā)中，存在許多不足。如尚未對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行考察，即經(jīng)培養(yǎng)和純化工序得到的空白基質(zhì)液，是否會(huì)對(duì)病毒顆粒粒徑的檢測產(chǎn)生干擾尚未明確。根據(jù)《中國藥典》三部（2020 版）規(guī)定，采用柱色譜法或蔗糖密度梯度離心法及其他適宜方法進(jìn)行純化得到的疫苗原液中總蛋白含量不高于血凝素含量的4.5 倍［15］，嚴(yán)格控制除有效成分血凝素外其他雜蛋白的含量，激光粒度儀檢測顆粒濃度的最低粒徑為0.04 μm，推測空白基質(zhì)可能不會(huì)對(duì)病毒粒徑檢測產(chǎn)生干擾。因此，后續(xù)仍需對(duì)該方法進(jìn)行深入研究。