蔡亮亮，林 昕，倪榮華，周盈盈，王 欽，范義鳳**

1 南通大學(xué)附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，南通 226001；2 南京中醫(yī)藥大學(xué) 翰林學(xué)院藥學(xué)院，泰州225300

磺胺止咳口服液為南通大學(xué)附屬醫(yī)院的院內(nèi)特色制劑，處方組成為：磺胺甲惡唑50 g、甲氧芐啶5 g、鹽酸溴己新0.8 g、甘草流浸膏50 mL、其余為藥用輔料，加水至1000 mL。臨床主要用于治療兒童因感冒、支氣管炎、肺炎引起的咳嗽咳痰，效果顯著[1]。該復(fù)方制劑的原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅檢測(cè)磺胺甲惡唑、甲氧芐啶的含量，未檢測(cè)鹽酸溴己新、甘草流浸膏的含量。甘草酸是甘草流浸膏的主要有效成分，《中國(guó)藥典》（2020 年版，一部）規(guī)定甘草流浸膏中甘草酸的含量不得少于1.8%（g·mL-1）[2]。因此，有必要檢測(cè)該復(fù)方制劑中甘草酸的含量。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道，采用高效液相色譜法（HPLC）分別檢測(cè)磺胺甲惡唑[3]、甲氧芐啶[4]、鹽酸溴己新[5]、甘草酸[6]的含量；也有文獻(xiàn)報(bào)道采用HPLC 法同時(shí)檢測(cè)磺胺甲惡唑與甲氧芐啶的含量[7]；但是未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道采用HPLC 法同時(shí)檢測(cè)磺胺甲惡唑、甲氧芐啶、鹽酸溴己新、甘草酸的含量。因此，為了全面控制磺胺止咳口服液的質(zhì)量，確保臨床用藥安全有效。本研究建立了HPLC 法同時(shí)檢測(cè)磺胺止咳口服溶液中4 個(gè)成分的含量，并為磺胺止咳口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與藥品、試劑

Agilent 1200 高效液相色譜儀，Cary-300 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（均安捷倫科技公司）；BT25 S 型十萬(wàn)分之一電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器公司）；FE28 型pH 計(jì)（梅特勒-托利多儀器公司）。

對(duì)照品：磺胺甲惡唑（批號(hào)：100025-201906，純度99.8%）、甲氧芐啶（批號(hào)：100031-201606，純度99.8%）、鹽酸溴己新（批號(hào)：100427-201903，純度99.9%）、甘草酸銨（批號(hào)：110731-202021，純度96.2%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

磺胺止咳口服液（批號(hào)：20210108、20210327、20210409）由南通大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供。乙腈、甲醇為色譜純，其它試劑為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Phenomenex Luna-C18（4.6mm×250mm，5 μm）；流動(dòng)相A：0.2%三乙胺水溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH 至2.5）-乙腈（90∶10，v∶v），流動(dòng)相B：乙腈（梯度洗脫：0～2 min，10%B；2～8 min，10%B→12%B；8～30 min，12%B→38%B；30～35 min，38%B→70%B；35～36 min，70%B→10%B；36～45 min，10%B）；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。

取磺胺止咳口服液1 mL，置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，振蕩混勻，離心取其上清液，用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液即得系統(tǒng)適用性溶液。理論板數(shù)按磺胺甲惡唑計(jì)算不低于3000，磺胺止咳口服液中4 個(gè)成分與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 磺胺甲惡唑?qū)φ掌啡芤海喝』前芳讗哼蚣s100 mg，精密稱定，置于5 mL 量瓶中，加入適量甲醇，超聲溶解，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得磺胺甲惡唑?qū)φ掌穬?chǔ)備溶液；精密量取該儲(chǔ)備溶液2.5 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

甲氧芐啶對(duì)照品溶液：取甲氧芐啶約50 mg，精密稱定，置于10 mL 量瓶中，加入適量甲醇，超聲溶解，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得甲氧芐啶對(duì)照品儲(chǔ)備溶液；精密量取該儲(chǔ)備溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

鹽酸溴己新對(duì)照品溶液：取鹽酸溴己新約16mg，精密稱定，置于20 mL 量瓶中，加入適量甲醇，超聲溶解，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得鹽酸溴己新對(duì)照品儲(chǔ)備溶液；精密量取該儲(chǔ)備溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

甘草酸對(duì)照品溶液：取甘草酸銨約16mg（甘草酸質(zhì)量=甘草酸銨質(zhì)量×0.9797），精密稱定，置于10mL量瓶中，加入適量甲醇，超聲溶解，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得甘草酸銨對(duì)照品儲(chǔ)備溶液；精密量取該儲(chǔ)備溶液1 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

混合對(duì)照品溶液：分別精密量取磺胺甲惡唑?qū)φ掌穬?chǔ)備溶液2.5mL、甲氧芐啶對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1mL、鹽酸溴己新對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1 mL、甘草酸銨對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取磺胺止咳口服液1mL，置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，振蕩混勻，離心（5000 r·min-1）20 min，取上清液，用0.45 μm 濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照磺胺止咳口服液處方配比及制備工藝，制成不含磺胺甲惡唑、甲氧芐啶、鹽酸溴己新、甘草流浸膏的陰性樣品；再按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制得陰性樣品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下的陰性樣品溶液、磺胺甲惡唑?qū)φ掌啡芤?、甲氧芐啶對(duì)照品溶液、鹽酸溴己新對(duì)照品溶液、甘草酸對(duì)照品溶液、混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，按“2.1”色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。結(jié)果甲氧芐啶、磺胺甲惡唑、鹽酸溴己新、甘草酸銨出峰時(shí)間分別為4.817、17.511、25.091、31.127 min，這4 個(gè)成分與之相鄰峰的分離度均＞1.5。表明磺胺止咳口服液中其它成分不干擾4 個(gè)主成分的檢測(cè)，方法專屬性良好。

圖1 專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖

2.3.2 檢測(cè)限、定量限確定 取“2.2.1”項(xiàng)下4 個(gè)成分的對(duì)照品溶液，用甲醇逐步稀釋，取各溶液10 μL進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算主峰峰高與基線噪音的比值（S/N）。以比值為3 時(shí)的濃度計(jì)為檢測(cè)限濃度；比值為10時(shí)的濃度計(jì)為定量限濃度。結(jié)果磺胺甲惡唑、甲氧芐啶、鹽酸溴己新、甘草酸的檢測(cè)限濃度分別為0.032、0.022、0.033、0.101 μg·mL-1；定量限濃度分別為0.095、0.065、0.098、0.404 μg·mL-1。

2.3.3 線性關(guān)系考察 以磺胺止咳口服液中4 個(gè)成分在供試品溶液中的濃度為100%，考察4 個(gè)成分在50%～150%濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系。精密量取甲氧芐啶、鹽酸溴己新、甘草酸對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 mL，分別置于6 個(gè)10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度；另精密量取磺胺甲惡唑?qū)φ掌穬?chǔ)備溶液1.25、1.5、2、2.5、3、3.75 mL，分別置于6 個(gè)10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。以上述各溶液10 μL 進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖。以峰面積（Y，mAU）對(duì)濃度（X，mg·mL-1）作線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 4 個(gè)成分的線性關(guān)系

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，室溫下分別于0、1、2、4、6、8、12、24、48 h 取樣檢測(cè)，記錄色譜圖。結(jié)果磺胺甲惡唑、甲氧芐啶、鹽酸溴己新、甘草酸峰面積的RSD 分別為0.45%、1.28%、1.69%、1.53%，表明供試品溶液室溫放置48 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.5 進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 取4 個(gè)成分的對(duì)照品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，連續(xù)測(cè)定6 次，記錄色譜圖。結(jié)果磺胺甲惡唑、甲氧芐啶、鹽酸溴己新、甘草酸峰面積的RSD 分別為0.84%、1.37%、1.75%、1.01%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次磺胺止咳口服液，照“2.2.2”項(xiàng)下方法分別制備6 份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)；另取混合對(duì)照品溶液，同法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積分別計(jì)算磺胺磺胺止咳口服液中4 個(gè)成分的含量。結(jié)果磺胺甲惡唑、甲氧芐啶、鹽酸溴己新、甘草酸的平均含量分別為49.82、5.11、0.81、1.21 mg·mL-1；RSD 分別為1.42%、1.57%、1.65%、0.52%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.3.7 回收率試驗(yàn) 精密稱定甲氧芐啶20、25、30 mg（處方量的80%、100%、120%），分別置于5 mL量瓶中，加入陰性樣品溶液適量，超聲振蕩，用陰性樣品溶液稀釋至刻度，每個(gè)濃度平行配制3 份。同法制備磺胺甲惡唑、鹽酸溴己新、甘草酸的樣品溶液。樣品溶液照“2.2.2”項(xiàng)處理，分別制得4 個(gè)成分的供試品溶液。分別精密量取4 種成分的供試品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)；另取混合對(duì)照品溶液，同法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積分別計(jì)算4 個(gè)成分的含量。結(jié)果磺胺甲惡唑、甲氧芐啶、鹽酸溴己新、甘草酸的平均回收率分別為99.57%、101.28%、98.71%、98.15%；RSD 分別為1.32%、0.98%、1.56%、1.78%（n=9）；表明方法的準(zhǔn)確度良好。

2.3.8 耐用性試驗(yàn) 分別考察梯度的初始比例、檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫、流速、流動(dòng)相的pH 值、不同型號(hào)的色譜柱對(duì)本法色譜行為的影響。耐用性試驗(yàn)條件見(jiàn)表2。

表2 耐用性試驗(yàn)條件

結(jié)果顯示，在可接受的變動(dòng)條件下，這4 個(gè)成分與之相鄰峰的分離度＞1.5，含量測(cè)定值均符合要求，說(shuō)明色譜條件耐用性良好。

2.3.9 樣品含量測(cè)定 取3 個(gè)批號(hào)磺胺止咳口服液，照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。分別取供試品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄各成分峰面積。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算磺胺甲惡唑、甲氧芐啶、鹽酸溴己新、甘草酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 磺胺止咳口服液中4 個(gè)成分的含量（mg·mL-1）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

分別取磺胺甲惡唑、甲氧芐啶、鹽酸溴己新、甘草酸對(duì)照品溶液適量，用甲醇稀釋至約20 μg·mL-1。照紫外-可見(jiàn)分光光度法（《中國(guó)藥典》2020 年版四部通則0401），于波長(zhǎng)200～400 nm 范圍內(nèi)掃描?；前芳讗哼?、甲氧芐啶、鹽酸溴己新、甘草酸的最大吸收波長(zhǎng)分別為270、288、249、247 nm。

磺胺止咳口服液按處方配比計(jì)算，含磺胺甲惡唑（50 mg·mL-1）、甲氧芐啶（5 mg·mL-1）、鹽酸溴己新（0.8 mg·mL-1），甘草酸（＞0.9 mg·mL-1）。在此制劑中，磺胺甲惡唑、甲氧芐啶的濃度遠(yuǎn)大于鹽酸溴己新、甘草酸的濃度，為了提高鹽酸溴己新、甘草酸在此色譜條件下的檢測(cè)靈敏度，本研究采用250 nm 作為此制劑的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 供試品溶液制備方法的選擇

磺胺止咳口服液中4 個(gè)成分在水中溶解度差，在甲醇中溶解度較好，故選擇甲醇作為溶劑。按處方配比計(jì)算，磺胺甲惡唑濃度為50 mg·mL-1，鹽酸溴己新濃度僅為0.8 mg·mL-1，濃度相差較大，若直接進(jìn)樣，磺胺甲惡唑進(jìn)樣量會(huì)超過(guò)柱容量（超載）。因此考慮對(duì)樣品溶液稀釋處理再進(jìn)樣。樣品溶液用甲醇稀釋8 倍進(jìn)樣，磺胺甲惡唑超載；樣品溶液稀釋10 倍進(jìn)樣，4 個(gè)成分均可以檢測(cè)到，且沒(méi)有超載，峰形較好。因此，采用甲醇對(duì)樣品溶液稀釋10 倍，作為供試品溶液的制備方法。

3.3 色譜條件的選擇

3.3.1 流動(dòng)相pH 的選擇 流動(dòng)相的pH 對(duì)化合物的保留有重要影響，酸性化合物隨pH 增大，保留時(shí)間減小；堿性化合物一般隨pH 增大，保留時(shí)間增大，酸性條件下則保留弱，出峰時(shí)間短，峰形尖銳，常需要添加掃尾劑。化合物的分子與離子形式共存，峰型通常較差，本制劑的主要成分磺胺甲惡唑、鹽酸溴己新、甘草酸呈酸性，甲氧芐啶呈弱堿性，因此，在選擇流動(dòng)相pH 時(shí)考慮將其以分子或者離子形式存在。分別考察不同流動(dòng)相pH 值（2、3、4、6）對(duì)4 個(gè)化合物色譜行為的影響，經(jīng)過(guò)多次嘗試，最終確定流動(dòng)相A 為0.2%三乙胺水溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH 至2.5）-乙腈（90∶10，v/v）；流動(dòng)相B 為乙腈。使分離效果良好。

3.3.2 洗脫方式的選擇 在流動(dòng)相篩選中，選用流動(dòng)相A 為0.2%三乙胺溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH 至2.5）-乙腈（90∶10）；流動(dòng)相B 為乙腈。方法建立初應(yīng)選擇強(qiáng)流動(dòng)相洗脫樣品，這樣可在較短的時(shí)間內(nèi)使樣品中強(qiáng)保留組分洗脫出來(lái)[8]。首先采用流動(dòng)相A-流動(dòng)相B（10∶90）進(jìn)行洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，色譜圖上峰的個(gè)數(shù)少，各成分峰幾乎重合，這是因?yàn)榱鲃?dòng)相體系中乙腈比例高，洗脫能力太強(qiáng)，故考慮降低乙腈的比例。采用流動(dòng)相A-流動(dòng)相B（60∶40）進(jìn)行洗脫，色譜圖上各峰分離度有所改善，但是分離度還未符合要求。以主成分峰與相鄰雜質(zhì)峰之間分離度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在分離度合格的基礎(chǔ)上盡量縮短洗脫時(shí)間。嘗試用梯度條件（0～2 min，20%B；2～30 min，20%B→70%B；30～35 min，70%B；35～36 min，70%B →20%B；36～45 min，20%B）進(jìn)行分析。甲氧芐啶與相鄰雜質(zhì)峰的最小分離度為1.06，不符合要求。經(jīng)過(guò)多次調(diào)整，確定“2.1”的色譜條件。在此條件下，磺胺止咳口服液4個(gè)成分的峰與相鄰雜質(zhì)峰間的分離度均＞1.5，各峰的保留時(shí)間適宜。