高嚴(yán)

【摘要】? 目的? 評(píng)價(jià)交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增法（crossing-primeramplification，CPA）檢測(cè)技術(shù)診斷結(jié)核病的價(jià)值。方法? 分析涇縣醫(yī)院2019年1月- 2021年6月進(jìn)行CPA檢測(cè)的207例疑似結(jié)核病住院患者的臨床資料，并與羅氏培養(yǎng)檢測(cè)、涂片改良抗酸染色鏡檢、結(jié)核抗體（tuberculosis antibody，TB-Ab）檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)比，評(píng)價(jià)各檢測(cè)方法的診斷效能。結(jié)果? 以羅氏培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，CPA檢測(cè)的靈敏度和特異度分別為63.1%、95.1%，且和羅氏培養(yǎng)結(jié)果具有中高等程度的一致性（Kappa=0.626），診斷效能優(yōu)于涂片改良抗酸染色鏡檢和結(jié)核抗體診斷技術(shù)。結(jié)論? CPA檢測(cè)技術(shù)與羅氏培養(yǎng)的檢測(cè)結(jié)果相似，但方法簡(jiǎn)便、快速，可用于疑似結(jié)核患者的快速診斷。

【關(guān)鍵詞】? 結(jié)核分枝桿菌;交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增;回顧性分析

中圖分類(lèi)號(hào)? R521? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A? ? 文章編號(hào)? 1671-0223（2022）17--02

結(jié)核病是一種慢性傳染病，由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起。2020年我國(guó)估計(jì)的結(jié)核病新患病人數(shù)為84.2萬(wàn)，估算的結(jié)核病發(fā)病率為59/10萬(wàn)，在結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家中結(jié)核病新患病人數(shù)僅低于印度[1]，結(jié)核病的防治依然嚴(yán)峻。為了能有效防治結(jié)核病，需要在疾病早期能夠有一種檢測(cè)技術(shù)可以快速地檢測(cè)并診斷出MTB。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是從臨床標(biāo)本中（主要是痰液）經(jīng)過(guò)抗酸染色或者培養(yǎng)來(lái)鑒定MTB，但它們各自都有優(yōu)缺點(diǎn)。隨著檢測(cè)技術(shù)不斷發(fā)展，MTB的分子學(xué)檢測(cè)技術(shù)得到廣泛的應(yīng)用。交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增法（crossing-primeramplification，CPA）檢測(cè)技術(shù)是其中一種快速分子診斷方法，它檢測(cè)的是結(jié)核桿菌復(fù)合群特異性的IS16110序列。在恒溫條件下，可以一次性進(jìn)行基因片段的特異性擴(kuò)增和雜交，然后在密閉的一次性核酸檢測(cè)裝置中使用免疫層析技術(shù)，定性檢測(cè)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，是中國(guó)自主創(chuàng)新的技術(shù)[2]。本研究采用對(duì)比方式，分析CPA對(duì)結(jié)核病的診斷價(jià)值。

1? 對(duì)象與方法

1.1? 研究對(duì)象

以涇縣醫(yī)院2019年1月- 2021年6月進(jìn)行CPA檢測(cè)的207例疑似結(jié)核病住院患者為研究對(duì)象。標(biāo)本中痰液194例，胸腔積液11例，肺泡灌洗液1例，膿汁1例。本研究以羅氏培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，共確診65例結(jié)核病，其中男55例，女10例，年齡24～88歲;非結(jié)核患者142例，其中男111例，女31例，年齡18～86歲。

1.2? 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：咳嗽，咳痰>2周，痰中帶血或咯血以及肺部影像學(xué)檢測(cè)異常等肺結(jié)核疑似癥狀的患者。

（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：正在進(jìn)行規(guī)范化抗結(jié)核治療且時(shí)間>2周的患者;經(jīng)綜合判斷標(biāo)準(zhǔn)未能明確診斷或排除肺結(jié)核可能的患者。

1.3? 檢測(cè)方法

（1）CPA檢測(cè)：采用杭州優(yōu)思達(dá)的檢測(cè)試劑盒（恒溫?cái)U(kuò)增-試紙條法），標(biāo)本需要經(jīng)過(guò)液化、洗滌的手工步驟進(jìn)行前處理，然后加入DNA提取液進(jìn)行核酸提取，再將提取的核酸加入玻璃化試管中，恒溫?cái)U(kuò)增1h，最后放入檢測(cè)裝置中讀取結(jié)果。

（2）TB-Ab檢測(cè)：采取膠體金法，吸取約100μl的血清或血漿加入試劑的樣品孔中，15～20min判讀結(jié)果。結(jié)果判斷依據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)。

（3）涂片法：采用改良抗酸染色，標(biāo)本的處理以及涂片染色步驟和結(jié)果判讀按照《WS 288-2017肺結(jié)核診斷》附錄B中的操作步驟進(jìn)行。

（4）羅氏培養(yǎng)法：采用酸性改良羅氏固體斜面培養(yǎng)，痰液需要加入4%氫氧化鈉進(jìn)行前處理，然后按照參考文獻(xiàn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作[3]。

1.4? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)算各檢測(cè)方法的靈敏度、特異度與Kappa值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? 4種檢測(cè)方法的陽(yáng)性檢出率比較

4種檢測(cè)方法中，羅氏培養(yǎng)的陽(yáng)性率最高，涂片法的陽(yáng)性率最低，組間陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2? 以羅氏培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)各檢測(cè)方法的診斷效能

以羅氏培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，CPA檢測(cè)診斷的靈敏度最高，特異度略低于涂片法，并且與金標(biāo)準(zhǔn)診斷結(jié)果有較高的一致性，且高于其他兩種方法，具有臨床應(yīng)用價(jià)值，見(jiàn)表2。

3? 討論

TB-Ab是對(duì)MTB的免疫學(xué)檢測(cè)方法。TB-Ab檢測(cè)操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快，十幾分鐘可以報(bào)告檢測(cè)結(jié)果。在本次研究中TB-Ab檢測(cè)結(jié)核病的陽(yáng)性率為25.1%，雖然和羅氏培養(yǎng)法的陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是TB-Ab陽(yáng)性結(jié)果只能反映既往感染過(guò)MTB，且不能區(qū)分卡介苗接種導(dǎo)致的陽(yáng)性，易造成假陽(yáng)性。標(biāo)本溶血或嚴(yán)重脂血也會(huì)對(duì)結(jié)果造成干擾，患者感染MTB早期，以及免疫功能低下或免疫缺陷又會(huì)導(dǎo)致結(jié)核抗體檢測(cè)陰性，這是TB-Ab靈敏度低，以及和羅氏培養(yǎng)法結(jié)果一致性較差的原因。因此TB-Ab適合對(duì)疑似患者的篩查，其結(jié)果需結(jié)合其他檢測(cè)結(jié)果綜合判斷。

羅氏培養(yǎng)法、涂片抗酸染色鏡檢是病原學(xué)檢測(cè)手段。在本研究中羅氏培養(yǎng)的陽(yáng)性檢出率（31.4%）高于涂片抗酸染色（18.4%），有較好的陽(yáng)性率，也是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。但是由于結(jié)核桿菌在培養(yǎng)基上生成緩慢，約2～4周才能形成菌落，培養(yǎng)8周無(wú)菌落生長(zhǎng)，才能報(bào)告陰性結(jié)果，這嚴(yán)重制約了結(jié)核病的早診斷早治療。涂片抗酸染色鏡檢方便快捷，但其陽(yáng)性率較低，陽(yáng)性結(jié)果依賴(lài)于標(biāo)本中細(xì)菌的含量，易造成漏診，也不利于結(jié)核的診斷。

CPA檢測(cè)是分子學(xué)檢測(cè)手段，在本研究中CPA檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率為23.2%，略低于羅氏培養(yǎng)的陽(yáng)性率31.4%。以羅氏培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)時(shí)CPA檢測(cè)的靈敏度為63.1%，特異度為95.1%，Kappa=0.626，兩者檢測(cè)結(jié)果具有中高程度的一致性，這與坦桑尼亞的一項(xiàng)研究結(jié)果相似[4]，但靈敏度和一致性略低于姜曉穎等[5]的一項(xiàng)多中心研究。推測(cè)可能的原因在于CPA檢測(cè)中核酸提取步驟需要手工操作多次，可能會(huì)造成核酸物質(zhì)的損失，另外因?yàn)闉榛仡櫺匝芯?，無(wú)法知道送檢的痰液標(biāo)本的質(zhì)量，雖然醫(yī)護(hù)人員會(huì)進(jìn)行指導(dǎo)，但患者在自取痰液時(shí)執(zhí)行度有待商榷。相比羅氏培養(yǎng)，CPA檢測(cè)檢測(cè)速度快，2h左右報(bào)告結(jié)果，其結(jié)果在密閉的裝置中讀取，可避免污染，減少假陽(yáng)性產(chǎn)生[6]。在等待培養(yǎng)結(jié)果的過(guò)程中可用于快速鑒定MTB。此外有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在肺外結(jié)核診斷中，以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，CPA法在菌陽(yáng)性結(jié)核患者中與羅氏培養(yǎng)法有較好一致性，在菌陰性結(jié)核患者中優(yōu)于羅氏培養(yǎng)法[7]，可見(jiàn)CPA檢測(cè)也能很好地診斷肺外結(jié)核。CPA檢測(cè)技術(shù)對(duì)結(jié)核有較好的檢測(cè)效能。

綜上所述，CPA檢測(cè)操作簡(jiǎn)便，不需要復(fù)雜的儀器，利于快速檢測(cè)。對(duì)于疑似的結(jié)核患者，可使用TB-Ab對(duì)其進(jìn)行結(jié)核病的初篩，再使用CPA檢測(cè)等分子檢測(cè)手段快速診斷，并與涂片鏡檢和培養(yǎng)比較，結(jié)合影像學(xué)和臨床表現(xiàn)綜合分析對(duì)結(jié)核病進(jìn)行早診斷、早治療。

4? 參考文獻(xiàn)

[1] Organization WH.Global tuberculosis report 2021[R].Geneva：World Health Organization，2021.

[2] 王爍程，張林波.結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2020，37（3）：78-85.

[3] 趙雁林，王黎霞，成詩(shī)明，等.分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：37-49.

[4] Mhimbira FA，Bholla M，Sasamalo M，et al.Detection of mycobacterium tuberculosis by EasyNAT diagnostic kit in sputum samples from Tanzania[J].J Clin Microbiol，2015，53（4）：1342-1344.

[5] 姜曉穎，尹韶華，黃海榮，等.交叉引物擴(kuò)增法對(duì)初診肺結(jié)核患者檢測(cè)效能的多中心研究[J].中國(guó)防癆雜志，2017，39（7）：746-750.

[6] Xu G，Hu L，Zhong H，et al.Cross priming amplification： mechanism and optimization for isothermal DNA amplification[J].Sci Rep，2012，2：246.

[7] 毛秀軍，葛曉勵(lì)，高景利.交叉引物擴(kuò)增技術(shù)在肺外結(jié)核早期診斷中的價(jià)值[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2016，29（6）：637-640.

[2022-02-12收稿]

作者單位：242500? 安徽省宣城市，涇縣醫(yī)院檢驗(yàn)科